一种促进水杉生长和提高其耐盐性的方法

技术领域

本申请涉及植物促生技术领域，具体涉及一种促进水杉生长和提高其耐盐性的方法。

背景技术

土壤盐渍化是目前世界范围内面临的一种日趋严重的土壤退化状况。盐胁迫可诱导植物的渗透胁迫、氧化胁迫和离子毒害，干扰植物的主要新陈代谢过程，损害根系水分和养分的吸收(Paul et al.，2014)。目前，如何缓解或降低盐碱化对植物造成的损害成为有效利用植物修复日益增长的盐碱地的关键挑战之一。

利用有益微生物，包括植物根际促生细菌(Plant-growth-promotingrhizobacteria，PGPR)、外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi，EMF)、豆科-根瘤菌等来提高植物的耐盐性，已成为缓解植物盐胁迫以修复盐碱地的可选择手段(Berg，2009)。PGPR可通过多种作用机制对植物生长、产量和养分吸收起到直接或间接的促进作用，如通过固氮、溶磷、产生铁载体、产生植物激素、激发植物免疫并增加植物在逆境条件下产生的渗透物质和抗氧化酶等调控植物生理过程(Kumar et al.，2018；Goswami et al.，2020)。PGPR缓解植物盐胁迫的研究目前主要集中在草本植物，包括番茄(Lycopersicon esculentum)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、大豆(Glycinemax)和玉米(Zea mays)等(Abbas et al.，2019；Kumar et al.，2019)。有研究表明，盐胁迫下对山茶(Camelliajaponica)接种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MH48，或对椰子树(Cocos nucifera)接种粘质沙雷菌(Serratia marcescens)KiSII和肠杆菌(Enterobacter sp.)RNF 267，均可促进树木生长和养分吸收，显著增加其生物量(Georgeet al.，2013；Park et al.，2017)。然而这些PGPR对木本植物耐盐性影响的研究仍较少。

EMF被认为是缓解植物盐胁迫的重要组成部分。在盐胁迫条件下EMF可通过植株中Na

水杉(Metasequoia glyptostroboides)是中国特有的孑遗植物，被称为植物的“活化石”，因其树形优美、树干和纹理通直、生长迅速、适应性较强及秋叶观赏性极佳等特点，在国内外被广泛引种栽植。近年来，水杉已成为城乡绿化的主要树种。但随着水杉种植面积的扩大，一些土壤含盐度较高的立地对水杉植苗成活率和生长的影响很大，而目前还鲜见利用有益微生物来提高水杉植株对盐胁迫适应能力的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本申请所要解决的技术问题是提供一种促进水杉生长和提高其耐盐性的方法，通过拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5和裂褶菌Be的互作，来促进水杉生长和提高其耐盐性。

为了解决上述技术问题，本申请采用的技术方案为：

一种提高水杉耐盐性的方法，直接对水杉采用液体菌剂进行灌根处理；所述的液体菌剂为含有拟蕈状芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)JYZ-SD5和裂褶菌(Schizophyllumcommune)Be的液体菌剂，或为只含有裂褶菌Be的液体菌剂。

所述的提高水杉耐盐性的方法，对水杉进行施菌处理，首先接种裂褶菌Be，采用液体菌剂灌根接种，接种量为50mL/株；10d后进行拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5接种，采用液体菌剂灌根接种，接种量为1×10

一种促进水杉叶片中可溶性糖和可溶性蛋白积累的方法，直接对水杉采用液体菌剂进行灌根处理；所述的液体菌剂为含有拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5的液体菌剂。

一种促进水杉苗木中脯氨酸含量增加的方法，直接对水杉采用液体菌剂进行灌根处理；所述的液体菌剂为含有拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5和裂褶菌Be的液体菌剂，或为只含有裂褶菌Be的液体菌剂。

一种降低水杉抗氧化酶活的方法，直接对水杉采用液体菌剂进行灌根处理；所述的液体菌剂为含有拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5和/或裂褶菌Be的液体菌剂。

一种改变水杉Na

一种促进水杉生长的方法，直接对水杉采用液体菌剂进行灌根处理；所述的液体菌剂为含有拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5和裂褶菌Be的液体菌剂，或为只含有裂褶菌Be的液体菌剂。

所述的促进水杉生长的方法，对水杉进行施菌处理，首先接种裂褶菌Be，采用液体菌剂灌根接种，接种量为50mL/棵；10d后进行拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5接种，采用液体菌剂灌根接种，接种量为1×10

有益效果：与现有技术相比，本申请通过根际促生细菌拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5和菌根真菌裂褶菌Be单接种或双接种对水杉生长及耐盐性的试验，证实菌株JYZ-SD5和Be能促进水杉生长，并能缓解盐胁迫，且双接种效果最好。菌株JYZ-SD5和Be通过抑制盐胁迫下水杉苗木水分流失和膜透性的增加、减少自由基的积累和对植物细胞的损伤、提高渗透调节物质的含量、降低Na

附图说明

图1是拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5与裂褶菌Be对水杉生长及根系形态的影响结果图；

图2是盐胁迫下拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5与裂褶菌Be对水杉叶片盐害程度及相对水分含量的影响结果图；图中，不同小写字母表示在0.05水平差异显著，下同；

图3是盐胁迫下拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5与裂褶菌Be对水杉渗透调节物质的影响结果图；

图4是盐胁迫下拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5与裂褶菌Be对水杉抗氧化能力的影响结果图；

图5是盐胁迫下拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5与裂褶菌Be对水杉根茎叶Na

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请做进一步的说明。

以下实施例中所采用的材料如下：

根际细菌：拟蕈状芽孢杆菌(B.paramycoides)JYZ-SD5分离自山东禹城杨树根际(CN109355228A，：CCTCC NO：M2018469)；外生菌根真菌：裂褶菌(S.commune，以下简称Be)购自中国科学院微生物研究所。以上菌株保存于南京林业大学森林病理学实验室。

3月生水杉盆栽实生苗，基质选用南京林业大学北大山林木根际表层土。

实施例1

裂褶菌Be液体菌剂制备：将裂褶菌Be纯培养接种到ZPD固体培养基中，置于真菌培养箱25℃培养7d；打孔器(5mm)打孔，将菌丝块从平板中取出，采用ZPD液体培养基培养，每1000mL放置10块，置于摇床上震荡培养(25℃，180rpm)7d；用搅拌机打碎菌丝球；取菌液至50mL离心管中，25℃、8000r/min、10min，弃上清，用去离子水10mL，25℃、8000r/min、5min离心洗涤2次；将菌体沉淀重悬于等体积的去离子水中，振荡混匀备用。

拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5液体菌剂：将菌株JYZ-SD5在液体LB培养基中摇培12h作为种子液；按照1％的接种量将种子菌液接种到LB培养基中，置于摇床上震荡培养(28℃，200rpm)12h，获得细菌JYZ-SD5菌株的发酵液；取发酵液至50mL离心管中，25℃、8000r/min、10min，弃上清，用去离子水10mL，25℃、8000r/min、5min离心洗涤2次；将菌体沉淀重悬于等体积的去离子水中，振荡混匀备用。

1、混合液体菌剂处理：2020年5月对水杉进行施菌处理，首先接种裂褶菌Be，采用液体菌剂灌根接种，接种量为每盆50mL；10d后进行拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5接种，采用液体菌剂灌根接种，接种量为1×10

2、单独接种裂褶菌Be液体菌剂的水杉施菌处理：采用裂褶菌Be液体菌剂灌根接种，接种量为每盆50mL。

3、单独接种拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5液体菌剂的水杉施菌处理：采用液体菌剂灌根接种，接种量为1×10

4、空白(CK)的水杉施菌处理方法：不施菌，用同体积的水来代替菌液。

5、盐胁迫处理：对植株接菌生长60d(上述处理1、2、3)进行盐胁迫处理，使土壤盐含量达到0.3％。共设5个处理，分别为非盐胁迫下不接菌对照(CK)、盐胁迫下不接菌对照(NaCl+CK)、盐胁迫下单接JYZ-SD5(NaCl+JYZ-SD5)、盐胁迫下下单接Be(NaCl+Be)、盐胁迫下双接JYZ-SD5+Be(NaCl+JYZ-SD5+Be)，每个处理6个重复。施菌前和盐胁迫处理前对水杉株高和地径生长量进行测量并记录；盐胁迫前对水杉根系进行扫描分析；盐胁迫5d后观察水杉表观并进行其他相关指标的测定。

6、相关指标的测定，具体方法如下：

水杉生长指标测定：用卷尺(cm)测定水杉的株高和新稍生长量，用游标卡尺(mm)测定地径。3个重复。

水杉根系生长参数测定：将水杉幼苗从盆钵中取出，抖掉表面土，自来水冲洗掉根部附着土，用吸水纸吸干根部表面水分，采用EPSON.EXPRESSION1680型扫描仪(EPSON，Japan)对根系进行扫描，后用Win RHIZO2003b根系分析软件分析各处理间水杉根系根长、根表面积、根体积、根平均直径、总根尖数和分枝数。3个重复。

水杉盐害程度：参照霍佳楠等(2012)的盐害分级标准进行水杉受害程度观测。将其盐害等级分为：1级：植株叶片正常，无发黄现象；2级：植株部分叶尖、叶缘变黄枯干，叶片萎蔫占总数50％及以下；3级：大部分叶片焦枯，叶片萎蔫占总数50％～80％；4级：整株枯黄，叶片枯萎、凋落，甚至全株死亡。每个处理观察6株。

水杉相对水分含量：取水杉新鲜叶片，测重(Wf)，后将叶片浸入蒸馏水中10h，取出后用吸水纸吸干叶表面水分，称重，再将水杉叶片浸入蒸馏水中1h，取出吸干后称重，直至水杉叶片的饱和重量相近，即为水杉叶片饱和鲜重(Wt)，然后将水杉叶片用锡箔纸包好放置在85℃的烘箱中10h，即可得水杉叶片的干燥生物量(Wd)。3个重复。计算公式如下：

相对水分含量(Relative water content，RWC)＝(Wf-Wd)/(Wt-Wd)*100％水杉叶片渗透调节物质：可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法，可溶性蛋白含量测定采用BCA法，脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮法。上述指标的测定和计算根据试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)进行。

水杉叶片抗氧化相关指标：采用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)活性，采用愈创木酚比色法测定过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性，采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性、抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbateperoxidase，APX)活性和谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase，GR)活性，采用硫酸钛比色法测定过氧化氢(H

水杉Na

7、数据分析

采用Excel 2019、prism cracked和PS软件对试验数据进行分析并制图，利用SPSS21.0软件进行差异显著性分析(Duncan法，P＜0.05)，图表中数据为平均值±标准差。

8、结果

1)菌株JYZ-SD5和Be接种可显著提高水杉苗木的生物量。与对照苗木相比，单接种JYZ-SD5水杉苗木的株高增长量提高了28.95％，单接种Be和双接种JYZ-SD5+Be分别显著提高了61.65％和65.47％(P＜0.05)，上述3个处理的地径增长量分别显著提高了52.4％、79.81％和63.46％(P＜0.05)(表1，图1A)。

表1拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5与裂褶菌Be对水杉生物量的影响

同列中不同小写字母表示表示在0.05水平差异显著。下同。

与对照苗木相比，单接种JYZ-SD5可提高水杉苗木的根长、根表面积、根体积、根平均直径和分枝数，但不显著，仅总根尖数显著提高60.56％(P＜0.05)；单接种Be可显著提高水杉苗木的根长(1.39倍)、根表面积(88.15％)、总根尖数(1.11倍)和分枝数(1.2倍)(P＜0.05)；双接种JYZ-SD5和Be可显著提高水杉苗木的根长(1.04倍)、根表面积(1.51倍)、根体积(2.2倍)、总根尖数(1.88倍)和分枝数(2.31倍)(P＜0.05)(表2，图1B)。这说明菌株JYZ-SD5和Be接种可促进苗木根系的生长，且双接种作用效果明显优于单接种处理。

表2拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5与裂褶菌Be对水杉根系生长参数的影响

2)在盐胁迫下，未接种水杉叶片几乎大半都发黄萎蔫，受损严重，出现明显的盐害特征；而无论是单接还是双接的水杉叶片损伤程度均低于未接种处理，盐害程度明显降低(图2A)。这说明菌株JYZ-SD5和Be接种可以有效缓解盐胁迫对植物的损害，以双接种效果最好。

同时测定表明，与CK相比，NaCl+CK处理水杉苗木的RWC显著降低了68.9％(P＜0.05)。而NaCl+JYZ-SD5、NaCl+Be、NaCl+JYZ-SD5+Be处理水杉苗木的RWC与NaCl+CK处理相比分别显著提高了56.22％、79.54％和100.02％(P＜0.05)(图2B)。这说明盐胁迫使水杉失水严重，而菌株JYZ-SD5和Be接种可以促进盐胁迫下苗木水分的有效吸收，其中以双接种最高。

3)与CK相比，NaCl+CK处理的水杉苗木的可溶性糖和脯氨酸分别显著提高了27.79％和109.09％(P＜0.05)，可溶性蛋白提高了38.71％。盐胁迫下，菌株JYZ-SD5和Be接种均能提高水杉的渗透调节物质以保持渗透平衡，提高苗木对渗透胁迫的耐受性。NaCl+JYZ-SD5处理水杉苗木的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸分别显著提高了12.4％、62.58％和38.99％(P＜0.05)，NaCl+Be和NaCl+JYZ-SD5+Be处理水杉苗木的可溶性糖分别显著降低了33.49％和37.71％(P＜0.05)，可溶性蛋白分别显著降低了47.08％和48.67％(P＜0.05)，脯氨酸分别显著提高了122％和35.64％(P＜0.05)(图3)。表明菌株JYZ-SD5可以广泛提高水杉的各类渗透调节物质，而菌株Be则对脯氨酸含量的影响尤为显著。

4)与CK相比，NaCl+CK处理水杉苗木体内H

5)与CK相比，NaCl+CK处理水杉苗木的电解质渗漏和MDA含量分别显著提高了8.55倍和69.32％(P＜0.05)。与NaCl+CK相比，NaCl+Be处理水杉苗木的MDA含量降低了8.54％，NaCl+JYZ-SD5和NaCl+JYZ-SD5+Be分别显著降低了15.85％和53.66％(P＜0.05)，上述三个处理的电解质渗漏分别显著降低了18.76％、22.09％和30.39％(P＜0.05)。表明双接种JYZ-SD5和Be对于维持盐胁迫下水杉苗木细胞膜稳定性和降低膜脂质过氧化水平以缓解盐胁迫的能力明显优于单接种处理(图4C，D)。

6)与CK相比，NaCl+CK处理水杉苗木的SOD、POD、CAT、APX、GR活性分别显著提高了2.84倍、2.25倍、1.19倍、2.94倍和38.32％(P＜0.05)。盐胁迫下各接种处理能显著提高水杉叶片的生物活性，缓解植株本身受到的氧化胁迫，从而降低了植株的抗氧化酶水平。与NaCl+CK相比，NaCl+JYZ-SD5、NaCl+Be和NaCl+JYZ-SD5+Be处理的水杉苗木SOD活性分别显著降低了41.76％、52.14％和25.37％(P＜0.05)，POD活性分别显著降低了31.32％、43.52％和73.48％(P＜0.05)，CAT活性分别降低了9.61％、8.76％和18.13％，APX活性分别显著降低了78.43％、71.8％和76.37％(P＜0.05)，GR活性分别显著降低了73.63％、74.63％和76.67％(P＜0.05)(图4E-I)。

7)与CK相比，NaCl+CK处理水杉苗木根、茎、叶部的Na

表3盐胁迫下拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD5与裂褶菌Be对水杉根茎叶Na

与CK相比，NaCl+CK处理水杉苗木根和叶部的K

与CK相比，NaCl+CK处理水杉苗木根、茎、叶部的Na