心脉安制剂的检测方法

技术领域

本发明属于成分分析技术领域，更具体地，本发明涉及一种同时检测心脉安制剂中17种成分含量的方法。

背景技术

心律失常是一种常见并且危险性极高的心血管疾病，可加重原有心脏疾病，还会引起患者的突然死亡，中国心血管健康与疾病报告2020统计数据估测我国每年约有54.4万人猝死。近年来，随着研究技术的不断发展以及中医理论体系的日渐完善，中医药治疗心律失常的优势也越来越受关注。

心脉安片是广州白云山和记黄埔中药有限公司的独家产品，由人参、黄芪、丹参、赤芍、麦冬、冰片6味药组成，具有益气、养阴、活血定悸之功效，用于心悸气阴两虚兼心血瘀阻证(轻中度冠心病室性早搏)。

中成药化学成分复杂，很难进行全面的质量评价，心脉安片也面临同样的问题。

现行质量标准采用5种方法对人参、黄芪、丹参、赤芍和冰片进行薄层鉴别，采用2种方法对丹参中的丹参酮Ⅱ

现有文献及专利技术文件显示心脉安片有效成分的检测方法主要是薄层色谱法、HPLC高效液相色谱等。如马丽莎等采用薄层扫描法测定结代停片中丹参酮Ⅱ

近期祝瑶露等采用指纹图谱和多指标定量测定法对心脉安浸膏进行质量控制，采用流动相为乙腈(A)-0.1％乙酸溶液(B)，梯度洗脱(0～40min，10％～20％B；40～80min，20％B；80～140min，20％～60％B；140～145min，60％B)对其中儿茶素、芍药苷、人参皂苷Rg

现有技术中，还没有针对心脉安片多种活性成分同时测定的报道，检测通量少，未建立其与功效相关联的多指标成分的整体质量控制方法，不能整体反映出心脉安片有效成分的含量，且效率低，费时。

心脉安片中主要含有酚酸、皂苷、丹参酮类化合物等。由于这些化合物的结构、物理化学性质差异大，研究者们通常多采用多种分析方法对不同类型的化合物进行定量分析，由于皂苷对紫外吸收较弱，因此大部分文献都采用HPLC-ELSD测定皂苷，其他成分多采用HPLC-DAD法测定。现有技术也未能实现心脉安片中水溶性成分和脂溶性成分同时测定，多种分析方法的应用为质量控制的研究带来了极大不便。因此亟需对针对心脉安片中所含多种活性成分建立灵敏度高、专属性强、快速高效的分析方法，为中成药原料药材的选择提供依据，保障产品质量；为心脉安片的质量控制和评价提供依据，并为含人参、丹参等的中药成方制剂建立含量测定方法提供参考，为产品的高质量发展提供有效支撑。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种心脉安制剂的检测方法，采用该检测方法，可以在4分钟内同时测定心脉安制剂中17种有效成分的含量，灵敏度高、专属性强、快速高效。

实现上述发明目的的技术方案包括如下。

一种心脉安制剂的检测方法，包括以下步骤：将心脉安制剂制成的供试品溶液，进行高效液相色谱检测后，再进行质谱分析；其中，所述高效液相色谱检测采用梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：

0～0.3min，流动相B(50±3)％；

0.3～1.2min，流动相B(50±3)％→(95±3)％；

1.2～3.0min，流动相B(95±3)％；

3.0～3.1min，流动相B(95±3)％→(50±3)％；

3.1～4.0min，流动相B(50±3)％；

所述流动相B为有机相。

本发明基于高效液相色谱串联质谱方法，构建了一种心脉安制剂的检测方法，通过采用合适的梯度洗脱程序，尤其是严格控制梯度洗脱程序的初始流动相比例、再配合色谱柱以及流动相的选择，最终实现了可以快速、全面测定心脉安制剂17种有效成分(包括脂溶性成分和水溶性成分)的含量，本发明的检测方法分析时间短、灵敏度高、专属性好、结果准确可靠，重现性好。本发明建立起与其功效相关联的多指标成分的整体质量，全面反映了复方药效，为心脉安片的质量控制和评价提供依据，并为含人参、丹参等的中药成方制剂中建立含量测定方法提供参考，为产品的高质量发展提供有效支撑。

附图说明

图1为本发明实施例1中空白溶液中17种化合物的MRM色谱图。

图2为本发明实施例1中对照品溶液中17种化合物的MRM色谱图。

图3为本发明实施例1中心脉安制剂供试品溶液中17种化合物的MRM色谱图。

图4为本发明试验例中采用色谱柱WatersBEHHSST3(100mm×2.1mm，1.7μm)、60％流动相A-40％流动相B对心脉安制剂17种成分进行检测的结果。

图5为本发明试验例中采用色谱柱WatersACQUITYUPLCCSHC

图6为本发明试验例1中采用色谱柱WatersACQUITYUPLCCSHC

上述图1～图6中，A：丹参酮I；B：丹参酮II

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

现有技术中对心脉安制剂的检测方法存在以下不足：

1、心脉安制剂中化学成分十分复杂，主要含有酚酸、皂苷、丹参酮类化合物等。这些化合物的结构、物理化学性质差异大，需要采用多种分析方法对不同类型的化合物进行定量分析，复杂，检测成本高；

2、现有的多指标定量测定法，未能实现对组方的所有药材的活性成分同时进行测定，未能实现脂溶性成分和水溶性成分同时测定；未建立其与功效相关联的多指标成分的整体质量控制方法，不能整体反映出心脉安制剂有效成分的含量；

3、现有测定方法检测通量少，耗时长。

本发明的心脉安制剂的检测方法基于高效液相色谱串联质谱方法。本发明的发明人对高效液相色谱检测和质谱分析中的众多条件进行大量的摸索筛选后发现：高效液相色谱中梯度洗脱程序，尤其是初始流动相比例、色谱柱的选择、流动相的选择等条件，对能否实现同时测定心脉安制剂17种成分至关重要。

在本发明的其中一些实施例中，所述梯度洗脱程序为：0～0.3min，流动相B(50±3)％；0.3～1.2min，流动相B(50±3)％→(95±3)％；1.2～3.0min，流动相B(95±3)％；3.0～3.1min，流动相B(95±3)％→(50±3)％；3.1～4.0min，流动相B(50±3)％。优选梯度洗脱程序为：0～0.3min，流动相B50％；0.3～1.2min，流动相B50％→95％；1.2～3.0min，流动相B95％；3.0～3.1min，流动相B95％→50％；3.1～4.0min，流动相B50％。

针对17种成分所采用的离子对分别如下：丹参酮I：277.0/193.1；丹参酮II

在其中一些实施例中，所述高效液相色谱检测中，流动相A为0.08％～0.12％甲酸水，流动相B为乙腈。

在其中一些实施例中，所述高效液相色谱检测的色谱条件还包括：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的尺寸为：长度100±2mm×直径2.10±0.05mm，粒径1.7±0.1μm；

柱温：35±2℃；

进样量：2～4μL；

体积流量0.25～0.35mL/min。

在其中一些实施例中，所述色谱柱为WatersACQUITYUPLCCSHC

在其中一些实施例中，所述质谱分析的条件还包括：

电喷雾离子化电离源，正负离子同时检测(采用正负离子同时扫描的方式，兼顾了有机酸类化合物在正离子下灵敏度低的缺陷，可以实现对17种化合物同时进行高灵敏度的扫描，并且每个化合物的通道都只有唯一的目标峰，避免了其他如同分异构体的干扰等)；数据采集模式为多反应监测模式；

喷雾电压：5500.0V(+)，-4500.0V(-)；

雾化温度：500.0±10℃；

气帘气：20.0±2psi；

喷雾气：30.0±3psi；

辅助加热气：30.0±3psi；

去簇电压：60.0±5V；

入场电压：10.0±2V；

出场电压：25.0±2V。

在其中一些实施例中，采用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用(UHPLC-QTRAP-MS/MS)系统进行高效液相色谱检测和质谱分析。

只有采用上述高效液相色谱检测与质谱分析条件相配合，才能实现心脉安制剂中水溶性成分和脂溶性成分的同时测定(心脉安制剂中17种成分，包括水溶性的人参皂苷类、丹酚酸类，以及脂溶性的丹参酮类，极性相差较大，很难在一个方法中实现较好的分析)，得到峰型和分离度都很好的色谱峰，而采用其他的条件，分离效果均不理想。同时由于系统压力更高，采用的色谱柱为短柱，每一个样本的进样时间为4分钟，分析快速；在空白溶剂中未发现待检测的化合物峰，特异性高。17种化合物定量限最低能做到0.04ng/mL，线性范围为100倍，17种化合物均表现出良好的线性关系，给实际检测工作带来极大的便捷性。

在其中一些实施例中，所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：使用70％～80％的甲醇将心脉安制剂定容至浓度为10mg/mL。采用70％～80％的甲醇直接提取心脉安制剂，能够提取绝大多数水溶性和脂溶性成分，回收率高，操作简单，样本预处理过程被大大简化。只需要极少的进样量(3.00μL)进行分析就可以满足定量要求。

在其中一些实施例中，所述方法还包括对混合对照品溶液进行高效液相色谱检测和质谱分析的步骤，所述混合对照品溶液的制备包括以下步骤：取丹参酮I、丹参酮II

在本发明的以下实施例中，使用的仪器和试剂包括如下：

超高效液相色谱三重四极杆质谱联用(UHPLC-QTRAP-MS/MS)系统，包括LC-30ADUHPLC超高效液相色谱仪(含二元梯度泵-自动进样器-柱温箱)，日本岛津公司；SciexQTRAP5500三重四极杆质谱，美国Sciex公司；Milli-QReference超纯水仪，美国Millipore公司；Secura125-1CN电子天平，德国Sartorius公司；SIGMA3-18KS冷冻离心机，美国Sigma公司；HYCD-205医用冷藏冷冻箱，海尔集团公司。

色谱级乙腈及色谱级甲醇，美国Sigma-Aldrich公司；色谱级甲酸，上海阿拉丁生化科技有限公司；超纯水来自超纯水机自制。

对照品丹参酮I(批号110867-201607，质量分数96.5％)、丹参酮II

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1同时测定心脉安制剂中17种成分的方法

采用高效液相色谱串联质谱检测，同时测定心脉安制剂中17种成分的方法，包括以下步骤：

1、混合对照品溶液的制备

精密称取丹参酮I、丹参酮II

2、心脉安制剂供试品溶液的制备

取心脉安干膏粉约50.0mg，精密称定，置于10mL离心管中，加入75％甲醇5.0mL，超声处理30min，放冷，10000rpm下离心10min，取上清液通过0.22μm微孔滤膜，取滤液，为使不同化合物稀释后能够在定量限之内，用50％甲醇分别稀释10、100、1000、10000倍，即为供试品溶液；

3、高效液相色谱串联质谱检测

取混合对照品溶液和心脉安制剂供试品溶液，分别进行高效液相色谱串联质谱检测：

色谱条件包括：

色谱柱：WatersACQUITYUPLCCSHC

流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈溶液(B)

洗脱梯度程序：

0～0.3min，50％B；

0.3～1.2min，50％～95％B；

1.2～3.0min，95％B；

3.0～3.1min，95％～50％B；

3.1～4.0min，50％B；

进样量3μL，柱温35℃，体积流量0.3mL/min。

色谱条件包括：

电喷雾离子化电离源(ESI)，正负离子同时检测。喷雾电压：5500.0V(+)，-4500.0V(-)；雾化温度：500.0℃；气帘气：20.0psi；喷雾气：30.0psi；辅助加热气：30.0psi；去簇电压：60.0V；入场电压：10.0V；出场电压：25.0V。数据采集模式为多反应监测(MRM)模式。

17种化合物的多反应监测模式如表1所示。

表117种化合物的多反应监测模式

4、实验结果

根据一系列混合对照品溶液的检测结果绘制标准曲线，再计算供试品溶液中各待测组分的量，结果见表2。

表2心脉安制剂中17种化学成分定量测定结果

表2结果表明，本实施例中建立的UHPLC-QTRAP-MS/MS含量测定方法可在4min内同时测定心脉安制剂中丹参酮I、丹参酮II

实施例2本发明方法的方法学考察

1、专属性考察

分别取空白溶液、混合对照品溶液和心脉安制剂供试品溶液各3μL，按实施例1的检测方法分别进行检测，17种化合物的MRM色谱图分别如图1～3。所示，从图1～3可知，各化合物所选峰之间无干扰，方法专属性良好。

2、线性范围及定量下限考察

精密量取混合对照品溶液，用50％甲醇稀释为一系列质量浓度的混合对照品工作溶液，按实施例1的方法进行检测，以各对照品质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，对定量成分进行线性回归计算。结果如表2所示。

表3回归方程、线性范围考察结果

表3结果表明，17个定量成分在线性范围内线性良好，符合分析测试要求。

3、重复性考察

平行制备6份心脉安制剂供试品溶液，按实施例1的方法进行检测，随行当日标准曲线。详细记录峰面积响应值，根据标准曲线计算17种被测成分的含量的RSD值，RSD值在1.5％～4.4％。

结果表明，各定量成分的重复性良好，满足分析测定要求。

4、精密度考察

取高、中、低质量浓度的混合对照品溶液，分别按实施例1的方法连续进样6次，详细记录峰面积响应值。计算17种被测成分峰面积的RSD值，考察日内精密度。连续操作3d，计算定量成分的峰面积及其RSD值，作为方法日间精密度结果。结果如表4所示。

表417种化合物的日内、日间精密度结果

表4结果表明：17种化合物的日内、日间精密度良好。

5、加样回收率考察

精密称取已知含量的心脉安制剂，约1.0g，精密称定，平行6份。采用实施例1的方法对各对照品溶液配制混合对照品溶液，使加入后的各成分含量分别为心脉安制剂中相应成分的含量。

将混合对照品溶液按照实施例1的方法进行检测，利用当日随行的标准曲线计算各定量成分的含量。

17个定量成分的平均回收率分别为103.4％、106.5％、105.1％、107.8％、106.5％、94.8％、95.3％、102.5％、103.1％、103.8％、97.6％、93.5％、94.9％、92.6％、91.8％、94.7％、94.4％，RSD值分别为3.5％、4.3％、3.2％、2.7％、2.8％、3.4％、3.7％、2.7％、2.5％、1.9％、3.6％、2.7％、4.5％、3.7％、3.8％、4.1％、2.8％。结果显示，17个化合物的加样回收率为91.8％～107.8％，RSD值不大于4.5％，表明本发明的方法准确度满足测试要求。

6、稳定性考察

将供试品溶液，在4℃放置0、4、8、24h后，按实施例1的方法对17种成分进行测定，详细记录峰面积响应值，计算RSD值，结果显示RSD值为1.5％～4.6％，表明本发明的方法稳定性良好。

试验例色谱条件对检测结果的影响

本试验例考察了色谱条件中的色谱柱、流动相和洗脱程序对检测结果的影响，具体包括：

1、色谱柱

选择WatersBEHHSST3(1.7μm，2.1mm*100mm)、WatersACQUITYUPLC CSHC

图4为采用色谱柱WatersBEHHSST3(100mm×2.1mm，1.7μm)进行检测的结果；其中，柱温35℃，体积流量0.3mL/min；流动相为0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈溶液(B)，洗脱梯度：0～0.5min，40％～40％B；0.5～1.0min，40％～95％B；1.0～2.0min，95％～95％B；2.0～2.2min，95％～40％B；2.2～3.0min，40％～40％B；进样量3μL。采用色谱柱WatersBEHHSST3(100mm×2.1mm，1.7μm)进行检测，心脉安制剂中水溶性化合物(如芍药苷，芍药内酯苷，人参皂苷Rg

图5为采用色谱柱WatersACQUITYUPLCCSHC

综上结果，相较于Waters BEH HSS T3(100mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱，WatersACQUITY UPLC CSH C

2、流动相

流动相中，使用水、0.1％甲酸水作为流动相A，甲醇和乙腈作为流动相B。

结果表明：使用0.1％甲酸水作为流动相A，大部分化合物灵敏度较好。乙腈作为流动相B的洗脱效果较好，对化合物的峰型和出峰时间更好，最终选择0.1％甲酸水溶液作为流动相A，乙腈溶液作为流动相B。

3、初始流动相比例

采用等度洗脱程序，发现对于17种包含水溶性和脂溶性成分的化合物不能够都出峰良好，只能够采取两种方法，分别对脂溶性和水溶性成分进行检测，因而时间加倍，效率减慢。

继续尝试梯度洗脱方式，采用80％流动相A-20％流动相B、60％流动相A-40％流动相B和50％流动相A-50％流动相B作为梯度洗脱的起始流动相比例，其他洗脱程序同实施例1。

结果如图6(80％流动相A-20％流动相B)和图5(60％流动相A-40％流动相B)所示，采用80％流动相A-20％流动相B和60％流动相A-40％流动相B作为起始流动相比例时，17种化合物出峰时间和峰型较好，但对于脂溶性化合物残留较大，对化合物的定量检测不利。采用50％流动相A-50％流动相B作为起始流动相比例，17种化合物的峰型和出峰时间都较合适(结果如图3所示)。因此，选择50％流动相A-50％流动相B作为起始流动相比例。

综上1～3的结果，只有色谱条件中色谱柱、流动相和洗脱程序三者共同配合，才能实现本发明的心脉安制剂中17种成分的同时、快速、高灵敏性检测。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。