用于结核分枝杆菌耐药基因检测的引物组合、寡核苷酸探针、检测方法、检测试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌耐药检测技术领域，具体涉及到用于结核分枝杆菌耐药基因检测的引物组合、寡核苷酸探针、检测方法、检测试剂盒及应用。

背景技术

结核病(TubercμLosis,TB)是由结核分枝杆菌(MycobacteriumtubercμLosis,MTB)引起的严重危害人类健康的慢性传染病。由于抗结核药物的不合理使用，目前结核病耐药情况愈发严重。结核分枝杆菌的多重耐药性(MDR)和广泛耐药性(XDR)的出现被认为是控制结核病最具挑战性的威胁之一，现有的抗结核药物均出现了耐药性问题。目前临床采用的耐药基因检测方法有表型检测和基因检测两类，且以传统检测为主。现有检测技术检测周期长，成本高，检测耐药突变类型不全面，不利于临床诊断的推广利用。因此，急需建立一种快速、准确、多重的结核耐药突变检测技术。

基于荧光微球的液相芯片技术有机整和了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、高速数字信号处理技术、计算机运算法则等多项最新科技成果，具有高通量、高速度、低成本、准确性高、重复性好、灵敏度高、操作简便、在同一平台上即可完成蛋白质和核酸等多种待测物检测等优点。该技术的核心是把检测用的微小聚苯乙烯颗粒(微球)用荧光染色的方法进行编码，同时偶联上对应检测目标所需的寡核酸探针，通过反应液中微球与目标分子进行杂交后采用激光激发与微球上的寡核苷酸的PCR产物上的报告分子产生荧光后，再使用对应的液相芯片系统信号读取设备来读取荧光数值，进而对检测结果进行判读。对于终端检测设备的不同，读取信号值的原理略有差异，但都是基于微球编码的液相芯片技术。该技术也是目前唯一得到美国FDA许可用于临床诊断的多重检测技术，也因此被许多厂商应用于诊断产品的开发。

目前对于结核分枝杆菌耐药常规检测方法是采集患者痰液等样本进行分离培养后再做药物敏感性鉴定。该方法是将结核分枝杆菌菌株在含抗结核药物的固体或液体培养基中进行培养，根据结核分枝杆菌在含药培养基中是否生长来判断结核分枝杆菌的耐药性。该方法的主要缺点是检测时间长，一般固体罗氏培养法进行药敏试验需要4-6周的时间，而BACTEC460TB等液体培养系统进行的结核杆菌快速培养和药敏测定虽然相对固体培养法速度快，但也需要1-2周的时间，且存在实验操作污染的风险；其次是培养法操作繁琐耗时长，对操作要求高，容易产生假阴性造成误判，进而耽误了患者的最佳治疗时间并造成耐药菌株的传播风险。近年来分子生物学相关技术的应用大大提高了结核耐药菌株的检测速度，但是结核分枝杆菌的耐药现象(表型)有很大一部分是由其多个基因上存在的多个位点发生突变而引发的。现有的检测结核分枝杆菌耐药基因相关位点的产品中，仅针对利福平、异烟肼或其它单一药物进行检测，存在检测药物种类及基因位点不全面或操作繁琐等诸多弊端，基本上最多仅可同时检测利福平及异烟肼两种药物。

因此，存在待改进之处，目前，本领域仍需要能够高通量、快速检测结核分枝杆菌对多种药物的耐药基因的检测工具以及检测方法。

发明内容

针对现有技术所存在的不足，本发明的第一目的在于提供一种检测范围可覆盖结核分枝杆菌针对异烟肼、乙胺丁醇、利福平和氟喹诺酮类药物耐药基因突变位点检测的试剂盒。

本发明的第二目的在于设计并验证了上述检测引物在结核分枝杆菌耐药突变检测中的应用。

本发明的第三目的在于提供上述检测引物在制备结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂盒中的应用。

本发明的第四目的在于提供上述试剂盒在检测结核分枝杆菌耐药突变中的应用。

对此，本发明提出用于结核分枝杆菌耐药基因检测的引物组合、寡核苷酸探针、检测方法、检测试剂盒以及应用，具体方案如下：

一种用于结核分枝杆菌耐药基因检测的引物组合，具体如下：

(1)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因突变位点的引物F、引物R的寡核苷酸序列：

katG-F：SEQ ID NO：1

katG-R：SEQ ID NO：2

(2)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因突变位点的引物F、引物R的寡核苷酸序列：

inhA-F：SEQ ID DNO：3

inhA-R：SEQQ IDDNO：4

(3)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因突变位点的引物F、引物R的寡核苷酸序列：

embB-F：SEQ ID NO：5

embB-R：SEQ ID NO：6

(4)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因突变位点的引物F、引物R的寡核苷酸序列：

rpoB-F：SEQ ID NO：7

rpoB-R：SEQ ID NO：8

(5)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因突变位点的引物F、引物R的寡核苷酸序列：

gyrA-F：SEQ ID NO：9

gyrA-R：SEQ ID NO：10

其中，每个引物F中的第一个位点均进行生物素标记。

进一步的，具体如下：

(1)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位突变位点的野生型探针katG-315AGC的DNA序列：SEQ ID NO：14

(2)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位突变位点的突变型探针katG-315ACC的DNA序列：SEQ ID NO：15

(3)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位突变位点的野生型探针inhA—-15C的DNA序列：SEQ ID NO：16

(4)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位突变位点的突变型探针inhA—-15T的DNA序列：SEQ ID NO：17

(5)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位突变位点的野生型探针inhA—-8T的DNA序列：SEQ ID NO：18

(6)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位突变位点的探针突变型inhA—-8A的DNA序列：SEQ ID NO：19

(7)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的野生型探针embB-306ATG的DNA序列：SEQ ID NO：20

(8)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的突变型探针embB-306GTG的DNA序列：SEQ ID NO：21

(9)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的突变型探针embB-306CTG的DNA序列：SEQ ID NO：22

(10)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的野生型探针embB-306ATG-2的DNA序列：SEQ ID NO：23

(11)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的突变型探针embB-306ATA-2的DNA序列：SEQ ID NO：24

(12)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的突变型探针embB-306ATT-2的DNA序列：SEQ ID NO：25

(13)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的突变型探针embB-306ATC-2的DNA序列：SEQ ID NO：26

(14)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因511位和513位突变位点的野生型探针rpoB-511CTG-513CAA的DNA序列：SEQ ID NO：27

(15)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因511位突变位点的突变型探针rpoB-511CCG-513CAA的DNA序列：SEQ ID NO：28

(16)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因513位突变位点的突变型探针rpoB-511CTG-513AAA的DNA序列：SEQ ID NO：29

(17)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因513位突变位点的突变型探针rpoB-511CTG-513CCA的DNA序列：SEQ ID NO：30

(18)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位突变位点的野生型探针rpoB-516GAC的DNA序列：SEQ ID NO：31

(19)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位突变位点的突变型探针rpoB-516GTC的DNA序列：SEQ ID NO：32

(20)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位突变位点的突变型探针rpoB-516GGC的DNA序列：SEQ ID NO：33

(21)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位突变位点的野生型探针rpoB-526CAC的DNA序列：SEQ ID NO：34

(22)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位突变位点的突变型探针rpoB-526TAC的DNA序列：SEQ ID NO：35

(23)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位突变位点的突变型探针rpoB-526GAC的DNA序列：SEQ ID NO：36

(24)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位突变位点的野生型探针rpoB-531TCG的DNA序列：SEQ ID NO：37

(25)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位突变位点的突变型探针rpoB-531TTG的DNA序列：SEQ ID NO：38

(26)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因533位突变位点的野生型探针rpoB-533CTG的DNA序列：SEQ ID NO：39

(27)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因533位突变位点的突变型探针rpoB-533CCG的DNA序列：SEQ ID NO：40

(28)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因88位突变位点的野生型探针gyrA-88GGC的DNA序列：SEQ ID NO：41

(29)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因88位突变位点的突变型探针gyrA-88TGC的DNA序列：SEQ ID NO：42

(30)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位和91位突变位点的野生型探针gyrA-90GCG-91TCG的DNA序列：SEQ ID NO：43

(31)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位突变位点的突变型探针gyrA-90GTG-91TCG的DNA序列：SEQ ID NO：44

(32)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位突变位点的突变型探针gyrA-90GCG-91CCG的DNA序列：SEQ ID NO：45

(33)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的野生型探针gyrA-94GAC的DNA序列：SEQ ID NO：46

(34)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的突变型探针gyrA-94AAC的DNA序列：SEQ ID NO：47

(35)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的突变型探针gyrA-94TAC的DNA序列：SEQ ID NO：48

(36)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的突变型探针gyrA-94CAC的DNA序列：SEQ ID NO：49

(37)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的突变型探针gyrA-94GGC的DNA序列：SEQ ID NO：50

(38)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的突变型探针gyrA-94GCC的DNA序列：SEQ ID NO：51

一种基于液相芯片系统检测结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点的方法，所述方法为采用所述的引物组合以及所述的寡核苷酸探针，结合样本总DNA，通过多重PCR反应，分子杂交，再用MAGPIX系统进行检测，以确定样本中所含病原体的种类。

进一步的，所述方法的具体步骤如下：

(1)提取样本中总DNA；

(2)进行多重PCR反应：

以步骤1中提取的样本总DNA为扩增序列模板进行PCR扩增反应，PCR扩增体系使用16S基因的引物16S-F和16S-R、katG基因的引物katG-F和katG-R、inhA基因的引物inhA-F和inhA-R、embB基因的embB-F和embB-R、rpoB基因的引物rpoB-F和rpoB-R、gyrA基因的引物gyrA-F和gyrA-R进行PCR扩增；在PCR反应管中依次加入以下试剂：2×MμLtiplexPCRMasterMix混合液12.5μL、浓度为20μmol/L的16S-F、16S-R、katG-F、katG-R、inhA-F、inhA-R、embB-F、embB-R、rpoB-F、rpoB-R、gyrA-F和gyrA-R各0.125μL，DNA模板2μL和不含RNase及DNase的超纯水9μL；

将PCR反应管放入PCR仪器内进行PCR扩增反应，在仪器上设定PCR反应条件如下：①(95℃5分钟)-②(95℃30秒)-③(65℃90秒)-④(72℃30秒)；重复步骤②-④共20次-⑤(95℃30秒)-⑥(56℃90秒)-⑦(72℃30秒)-重复步骤⑤-⑦共20次-⑧(68℃10分钟)；⑨降温至4℃。

(3)杂交：

将带有生物素标记修饰的PCR扩增产物分别与偶联好寡核苷酸探针的微球进行杂交反应，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；

(4)检测：

MAGPIX系统为液相芯片分析系统检测仪器，用MAGPIX系统分别读取经上述步骤(3)杂交后微球上的目标基因与探针结合的产物的荧光值，然后根据荧光值判定样品中结核分枝杆菌耐药相关基因的具体情况，即为野生型或存在某种检测范围内的耐药突变型。

进一步的，步骤(3)中，用于特异性结合PCR扩增出的不同产物的不同的寡核苷酸探针以共价偶联的方式结合到不同颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，工作浓度调整至100个微球/μL；

所述杂交缓冲液为1.5×TMAC的氯化四甲铵，所述特异性的寡核苷酸探针为权利要求2中所述的寡核苷酸探针。

进一步的，步骤(3)中，杂交反应具体为：

在PCR反应管中加入33μL杂交缓冲液、12μLpH8.0的TE缓冲液、5μLPCR产物，进行第一步杂交，杂交条件为①96℃5分钟-②63℃15分钟；

在第一步杂交产物中加入浓度为50μg/mL的荧光报告分子亲和素-藻红蛋白(SAPE)10μL，进行第二步杂交，杂交条件为63℃条件下10分钟。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明根据已知的结核分枝杆菌耐药基因研究成果，本发明提出了异烟肼耐药突变位点位于katG基因和inhA基因，乙胺丁醇耐药突变位点位于embB基因，利福平耐药突变位点集中于rpoB基因，氟喹诺酮类药物的耐药突变位点主要位于gyrA基因。主要根据基因数据库中能够检索到的耐药相关基因对上述5种耐药相关基因的核苷酸序列分别进行同源性分析，设计引物和探针，并得到了包含该引物和探针的检测试剂盒，从而提供了检测工具。

(2)本发明基于荧光编码微球的液相芯片技术对结核分枝杆菌内核酸序列相应的可能引发针对异烟肼、乙胺丁醇、利福平和氟喹诺酮类药物耐药基因的耐药基因突变位点进行检测。具体进行检测时，通过PCR扩增，分子杂交，再用液相芯片检测仪器(MAGPIX系统)进行检测，完成检测和原始数据的获取与判读，从而确定样本中是否含有耐药相关基因位点的突变情况。从而确定样本中是否含有可能导致结核分枝杆菌耐药的基因突变位点。

(3)与现有的技术相比，本发明检测结核分枝杆菌耐药的类型能够覆盖异烟肼、乙胺丁醇、利福平和氟喹诺酮类药物4种一线及二线核心抗结核药物，简化既往的检测流程，明显缩短实验周期，提高了检测的准确性与灵敏性，更利于临床上的应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不仅限于此。

基于现有技术中，现存的结核分枝杆菌耐药检测的手段与技术分两类，培养类的无论是固体培养还是液体培养技术都存在检测周期过长且整个培养操作过程中易污染的问题。而其它分子诊断类方法仅有固相芯片法和基于实时荧光PCR原理的方法，固相芯片虽然在一定程度上解决了多指标检测的问题但操作繁琐，同时在当前所有已上市产品中检测的耐药基因位点和药物种类偏少，结果判读容易受到外界因素影响等弊端；其它基于实时荧光PCR的技术与方法所提供的检测项目只针对本发明涉及的其中一种或几种药物，检测位点不全面。如果想完成本检测试剂盒所检出的全部指标，所耗费的时间和人力成本将大幅增加。

对此，本发明主要解决的技术问题是同时检测结核分枝杆菌对异烟肼、乙胺丁醇、利福平和氟喹诺酮类4大类药物耐药基因的突变位点。需要说明的是，其中，16SrRNA序列可用于分枝杆菌菌种鉴定，异烟肼耐药突变位点位于katG基因和inhA基因，乙胺丁醇耐药突变位点位于embB基因，利福平耐药突变位点位于rpoB基因，氟喹诺酮类药物的耐药突变位点位于gyrA基因。

针对技术问题，本发明的技术方案为根据结核分枝杆菌基因序列片段种的16SrRNA、katG、inhA、embB、rpoB和gyrA基因设计对应的特异性引物与探针。因此，提供了一种基于编码微球技术的液相芯片系统，对用于治疗结核分枝杆菌感染患者的异烟肼、利福平、乙胺丁醇和氟喹诺酮类药物中耐药基因突变位点检测的引物进行检测，具体的检测方法为将不同突变位点的特异性探针与上述液相芯片系统中不同颜色编码的微球结合，并在下游引物的末端进行biotin(生物素亲和素)修饰以便于与藻红蛋白(报告分子)结合。然后在同一个反应管中加入以上不同基因序列的引物，对不同片段同时扩增，完成扩增后再利用特异性探针与特异性得扩增产物进行核酸杂交反应，最后在对应的液相芯片仪器上完成检测，通过识别不同微球的编码来区分不同的检测指标，通过报告分子产生的荧光数值是否高于设定的检测阈值来判断该检测指标是否为阳性，即可同时检测出不同基因上的野生型和突变型的情况，从而达到一次性快速检测样本中的结核分枝杆菌对上述四种药物是否具有潜在的耐药风险，具有快速，高通量及高特异性以及高灵敏度的优点。

在该技术方案中，可以看出，首先需要进行引物设计，由于这4种结核分枝杆菌治疗药物的耐药基因位点主要分布在5个基因上，其中异烟肼耐药基因位点位于katG基因和inhA基因，乙胺丁醇耐药基因位点位于embB基因，利福平耐药基因位点位于rpoB基因，氟喹诺酮类药物的耐药基因位点位于gyrA基因。主要根据基因库中能够检索到的5种耐药相关基因所有的核苷酸序列分别进行同源性分析和引物设计，具体如下：

(1)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因突变位点的引物F、引物R的寡核苷酸序列：

katG-F：biotin-GCGGTCACACTTTCGGTAAG

katG-R：CAAGCGCCAGCAGGGCTCTT

(2)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因突变位点的引物F、引物R的寡核苷酸序列：

inhA-F：biotin-CAATTCGTAGGGCGTCAATACA

inhA-R：AACCAGGACTGAACGGGATAC

(3)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因突变位点的引物F、引物R的寡核苷酸序列：

embB-F：biotin-GGCTTCCTGCTCTGGCATGTC

embB-R：TATACCACGCCTGGCTCGGCCCG

(4)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因突变位点的引物F、引物R的寡核苷酸序列：

rpoB-F：GGCGAGCTGATCCAAAACCAGA

rpoB-R：biotin-CGACAGCGAGCCGATCAGAC

(5)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因突变位点的引物F、引物R的寡核苷酸序列：

gyrA-F：biotin-AGGAGATGCAGCGCAGCTACA

gyrA-R：CATTGCCTGGCGAGCCGAAGT

(6)用于检测结核分枝杆菌种属的特异性相关基因16S引物F(正向)、引物R(反向)的寡核苷酸序列：

16S-F：biotin-TTAGATACCCTGGTAGTCCAC(SEQ ID NO：11)

16S-R：ACGACACGAGCTGACGACAG(SEQ ID NO：12)

需要说明的是，上述多个引物F的一端均做了生物素标记。

其次，本发明提供的用液相芯片系统中检测结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点的探针有39种，它们分别与上述的6对引物对应设计制成，上述探针为序列特异性检测探针，其DNA序列为：

(1)用于检测结核分枝杆菌相关基因16S探针16S的DNA序列：

NH2-(CH2)12-TATCTCTAGACGCGTCCTGTGCATGTCAAA(SEQ ID NO：13)

(2)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位突变位点的野生型探针katG-315AGC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGCTGGTGATCGC

(3)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位突变位点的突变型探针katG-315ACC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGGTGGTGATCGC

(4)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位突变位点的野生型探针inhA—-15C的DNA序列：

NH2-(CH2)12-GACAACCTATCGTCTCGCCGCGG

(5)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位突变位点的突变型探针inhA—-15T的DNA序列：

NH2-(CH2)12-GACAACCTATCATCTCGCCGCGG

(6)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位突变位点的野生型探针inhA—-8T的DNA序列：

NH2-(CH2)12-TCACCCCGACAACCTATCGTCTC

(7)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位突变位点的探针突变型inhA—-8A的DNA序列：

NH2-(CH2)12-TCACCCCGACATCCTATCGTCTC

(8)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的野生型探针embB-306ATG的DNA序列：

NH2-(CH2)12–CTCGGGCCATGCCCAGGATG

(9)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的突变型探针embB-306GTG的DNA序列：

NH2-(CH2)12–CTCGGGCCACGCCCAGGATG

(10)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的突变型探针embB-306CTG的DNA序列：

NH2-(CH2)12–CTCGGGCCAGGCCCAGGATG

(11)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的野生型探针embB-306ATG-2的DNA序列：

NH2-(CH2)12–GCTCGGGCCATGCCCAGGAT

(12)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的突变型探针embB-306ATA-2的DNA序列：

NH2-(CH2)12–GACTCGGGCTATGCCCAGGAT

(13)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的突变型探针embB-306ATT-2的DNA序列：

NH2-(CH2)12–GACTCGGGCAATGCCCAGGAT

(14)用于检测乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的突变型探针embB-306ATC-2的DNA序列：

NH2-(CH2)12–GACTCGGGCGATGCCCAGGAT

(15)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因511位和513位突变位点的野生型探针rpoB-511CTG-513CAA的DNA序列：

NH2-(CH2)12-AGCCAGCTGAGCCAATTCATG

(16)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因511位突变位点的突变型探针rpoB-511CCG-513CAA的DNA序列：

NH2-(CH2)12-AGCCAGCCGAGCCAATTCATG

(17)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因513位突变位点的突变型探针rpoB-511CTG-513AAA的DNA序列：

NH2-(CH2)12-AGCCAGCTGAGCAAATTCATG

(18)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因513位突变位点的突变型探针rpoB-511CTG-513CCA的DNA序列：

NH2-(CH2)12-AGCCAGCTGAGCCCATTCATG

(19)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位突变位点的野生型探针rpoB-516GAC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGTCCATGAATTGG

(20)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位突变位点的突变型探针rpoB-516GTC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGACCATGAATTGG

(21)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位突变位点的突变型探针rpoB-516GGC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGCCCATGAATTGG

(22)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位突变位点的野生型探针rpoB-526CAC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTGGGTCAACCCCG

(23)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位突变位点的突变型探针rpoB-526TAC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTAGGTCAACCCCG

(24)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位突变位点的突变型探针rpoB-526GAC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTCGGTCAACCCCG

(25)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位突变位点的野生型探针rpoB-531TCG的DNA序列：

NH2-(CH2)12-CCCAGCGCCGACAGTCGG

(26)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位突变位点的突变型探针rpoB-531TTG的DNA序列：

NH2-(CH2)12–CCCAGCGCCAACAGTCGG

(27)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因533位突变位点的野生型探针rpoB-533CTG的DNA序列：

NH2-(CH2)12-ACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCG

(28)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因533位突变位点的突变型探针rpoB-533CCG的DNA序列：

NH2-(CH2)12–ACTGTCGGCGCCGGGGCCCGGCG

(29)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因88位突变位点的野生型探针gyrA-88GGC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-ACGCGTCGCCGTGCGGGTGGTA

(30)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因88位突变位点的突变型探针gyrA-88TGC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-ACGCGTCGCAGTGCGGGTGGTA

(31)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位和91位突变位点的野生型探针gyrA-90GCG-91TCG的DNA序列：

NH2-(CH2)12-TCGTAGATCGACGCGTCGCCGTG

(32)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位突变位点的突变型探针gyrA-90GTG-91TCG的DNA序列：

NH2-(CH2)12-TCGTAGATCGACACGTCGCCGTG

(33)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位突变位点的突变型探针gyrA-90GCG-91CCG的DNA序列：

NH2-(CH2)12-TCGTAGATCGGCGCGTCGCCGTG

(34)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的野生型探针gyrA-94GAC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGTCGTAGATCGACG

(35)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的突变型探针gyrA-94AAC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGTTGTAGATCGACGC

(36)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的突变型探针gyrA-94TAC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGTAGTAGATCGACGC

(37)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的突变型探针gyrA-94CAC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGTGGTAGATCGACGC

(38)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的突变型探针gyrA-94GGC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGCCGTAGATCGACGC

(39)用于检测氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的突变型探针gyrA-94GCC的DNA序列：

NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGGCGTAGATCGACGC

需要说明的是，上述的多个探针序列的一端均做了氨基标记。

本发明提供的用于液相芯片系统检测结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点的方法，是采用上述的引物和探针，通过多重PCR反应，分子杂交，再用MAGPIX系统进行检测，从而确定样本中所含病原体的种类。

所述方法可以按下列步骤顺序进行：

(1)提取样本中总DNA；

(2)进行多重PCR反应：

以步骤1中提取的样本总DNA为扩增序列模板进行PCR扩增反应，PCR扩增体系使用16S基因的引物16S-F和16S-R、katG基因的引物katG-F和katG-R、inhA基因的引物inhA-F和inhA-R、embB基因的embB-F和embB-R、rpoB基因的引物rpoB-F和rpoB-R、gyrA基因的引物gyrA-F和gyrA-R进行PCR扩增；在PCR反应管中依次加入以下试剂：2×MμLtiplexPCRMasterMix混合液(包含四种脱氧核糖核苷酸-dNTP、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶)12.5μL、浓度为20μmol/L的16S-F、16S-R、katG-F、katG-R、inhA-F、inhA-R、embB-F、embB-R、rpoB-F、rpoB-R、gyrA-F和gyrA-R各0.125μL，DNA模板2μL和不含RNase及DNase的超纯水9μL；

将PCR反应管放入PCR仪器内进行PCR扩增反应，在仪器上设定PCR反应条件如下：①(95℃5分钟)-②(95℃30秒)-③(65℃90秒)-④(72℃30秒)；重复步骤②-④共20次-⑤(95℃30秒)-⑥(56℃90秒)-⑦(72℃30秒)-重复步骤⑤-⑦共20次-⑧(68℃10分钟)；⑨降温至4℃；

(3)杂交：

提前把用于特异性结合PCR扩增出的不同产物的不同的寡核苷酸探针以共价偶联的方式结合到不同颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，工作浓度调整至100个微球/μL；

所述杂交缓冲液为1.5×TMAC的氯化四甲铵，所述特异性的寡核苷酸检测探针即为上述探针；

然后将带有生物素标记修饰的PCR扩增产物分别与偶联好上述寡核苷酸探针的微球进行杂交反应，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；所用寡核苷酸探针为16S基因、katG基因、inhA基因、embB基因、rpoB基因、gyrA基因对应的寡核苷酸探针。杂交反应具体为：在PCR反应管中加入33μL杂交缓冲液、12μLpH8.0的TE缓冲液、5μLPCR产物，进行第一步杂交。杂交条件为①96℃5分钟-②63℃15分钟。在第一步杂交产物中加入浓度为50μg/mL的荧光报告分子亲和素-藻红蛋白(SAPE)10μL，进行第二步杂交，杂交条件为63℃条件下10分钟；

(4)检测：

用液相芯片分析系统检测仪器MAGPIX分别读取经上述步骤(3)杂交后微球上的目标基因与探针结合的产物的荧光值；然后根据荧光值(实际获取数据为荧光增益值的中位数)判定样品中结核分枝杆菌耐药相关基因的具体情况，即为野生型或存在某种检测范围内的耐药突变型。

上述检测结果的获取与判读：杂交产物与报告分子亲和素-藻红蛋白孵育，亲和素-藻红蛋白可与杂交产物上的生物素特异性结合，在随后的检测过程中会被绿色光源激发产生荧光。通过MAGPIX仪器读取微球上对应的荧光数值可对检测结果进行判定。

本发明采用以下方法根据荧光检测值判断样本中是否含探针对应的突变种类：当微球上的探针与带有生物素标记的PCR产物杂交后的荧光检测值＞100，且大于同一基因同一检测位点其他探针荧光检测值1.5倍，则样品中相应基因的相应位点为该探针偶联DNA所对应的种类。如果该探针为野生型探针，则该样品中不携带该探针检测的耐药基因突变，如果该探针为突变型探针，则提示该样品中携带该探针检测的结核分枝杆菌耐药基因突变。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例l

已知样品1中含有异烟肼、利福平和氟喹诺酮类药物耐药的结核分枝杆菌，按本发明的方法进行检测，具体步骤如下：

1.提取样本中总DNA；

2.先以步骤1中提取的样本总DNA为模板链进行PCR扩增。在PCR反应管中加入下列物质：2×MμLtiplexPCRMasterMix混合液(包含四种脱氧核糖核苷酸、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶)12.5μL、浓度为20μmol/L的16S-F、16S-R、katG-F、katG-R、inhA-F、inhA-R、embB-F、embB-R、rpoB-F、rpoB-R、gyrA-F和gyrA-R各0.125μL，DNA模板2μL和超纯水9μL。

各引物序列如下：

16S-F：biotin-TTAGATACCCTGGTAGTCCAC

16S-R：ACGACACGAGCTGACGACAG

katG-F：biotin-GCGGTCACACTTTCGGTAAG

katG-R：CAAGCGCCAGCAGGGCTCTT

inhA-F：biotin-CAATTCGTAGGGCGTCAATACA

inhA-R：AACCAGGACTGAACGGGATAC

embB-F：biotin-GGCTTCCTGCTCTGGCATGTC

embB-R：TATACCACGCCTGGCTCGGCCCG

rpoB-F：GGCGAGCTGATCCAAAACCAGA

rpoB-R：biotin-CGACAGCGAGCCGATCAGAC

gyrA-F：biotin-AGGAGATGCAGCGCAGCTACA

gyrA-R：CATTGCCTGGCGAGCCGAAGT

使用BiometraTonePCR仪，反应条件如下：

①(95℃5分钟)-②(95℃30秒)-③(65℃90秒)-④(72℃30秒)；重复步骤②-④共20次-⑤(95℃30秒)-⑥(56℃90秒)-⑦(72℃30秒)-重复步骤⑤-⑦共20次-⑧(68℃10分钟)；⑨降温至4℃。

所得PCR的产物为带有生物素标记的目标基因溶液。

3.杂交：

分别把特异性检测探针以共价方式结合到指定颜色编码的微球上，用杂交缓冲液稀释，调整浓度至100个微球/μL；所述杂交缓冲液为1.5×TMAC的氯化四甲铵，所述特异性检测探针为上述探针。

然后将带有生物素标记修饰的PCR产物分别与结合了探针的微球进行杂交，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；所用探针为16S基因、katG基因、inhA基因、embB基因、rpoB基因、gyrA基因对应的探针。在PCR反应管中加入33μL杂交缓冲液、12μLpH8.0的TE缓冲液、5μLPCR产物，进行第一步杂交。杂交条件为：

①96℃5分钟-②63℃15分钟。在第一步杂交产物中加入浓度为50μg/mL的荧光报告分子亲和素-藻红蛋白(SAPE)10μL，进行第二步杂交。杂交条件为63℃10分钟。

反应体系所对应的探针序列为：

16S：NH2-(CH2)12-TATCTCTAGACGCGTCCTGTGCATGTCAAA

katG-315AGC：NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGCTGGTGATCGC

katG-315ACC：NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGGTGGTGATCGC

inhA--15C：NH2-(CH2)12-GACAACCTATCGTCTCGCCGCGG

inhA--15T：NH2-(CH2)12-GACAACCTATCATCTCGCCGCGG

inhA--8T：NH2-(CH2)12-TCACCCCGACAACCTATCGTCTC

inhA--8A：NH2-(CH2)12–TCACCCCGACATCCTATCGTCTC

embB-306ATG：NH2-(CH2)12–CTCGGGCCATGCCCAGGATG

embB-306GTG：NH2-(CH2)12–CTCGGGCCACGCCCAGGATG

embB-306CTG：NH2-(CH2)12–CTCGGGCCAGGCCCAGGATG

embB-306ATG-2：NH2-(CH2)12–GCTCGGGCCATGCCCAGGAT

embB-306ATA-2：NH2-(CH2)12–GACTCGGGCTATGCCCAGGAT

embB-306ATT-2：NH2-(CH2)12–GACTCGGGCAATGCCCAGGAT

embB-306ATC-2：NH2-(CH2)12–GACTCGGGCGATGCCCAGGAT

rpoB-511CTG-513CAA：NH2-(CH2)12-AGCCAGCTGAGCCAATTCATG

rpoB-511CCG-513CAA：NH2-(CH2)12-AGCCAGCCGAGCCAATTCATG

rpoB-511CTG-513AAA：NH2-(CH2)12-AGCCAGCTGAGCAAATTCATG

rpoB-511CTG-513CCA：NH2-(CH2)12-AGCCAGCTGAGCCCATTCATG

rpoB-516GAC：NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGTCCATGAATTGG

rpoB-516GTC：NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGACCATGAATTGG

rpoB-516GGC：NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGCCCATGAATTGG

rpoB-526CAC：NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTGGGTCAACCCCG

rpoB-526TAC：NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTAGGTCAACCCCG

rpoB-526GAC：NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTCGGTCAACCCCG

rpoB-531TCG：NH2-(CH2)12-CCCAGCGCCGACAGTCGG

rpoB-531TTG：NH2-(CH2)12–CCCAGCGCCAACAGTCGG

rpoB-533CTG：NH2-(CH2)12–ACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCG

rpoB-533CCG：NH2-(CH2)12-ACTGTCGGCGCCGGGGCCCGGCG

gyrA-88GGC：NH2-(CH2)12-ACGCGTCGCCGTGCGGGTGGTA

gyrA-88TGC：NH2-(CH2)12-ACGCGTCGCAGTGCGGGTGGTA

gyrA-90GCG-91TCG：NH2-(CH2)12-TCGTAGATCGACGCGTCGCCGTG

gyrA-90GTG-91TCG：NH2-(CH2)12-TCGTAGATCGACACGTCGCCGTG

gyrA-90GCG-91CCG：NH2-(CH2)12-TCGTAGATCGGCGCGTCGCCGTG

gyrA-94GAC：NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGTCGTAGATCGACG

gyrA-94TAC：NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGTAGTAGATCGACGC

gyrA-94GGC：NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGCCGTAGATCGACGC

gyrA-94CAC：NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGTGGTAGATCGACGC

gyrA-94GCC：NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGGCGTAGATCGACGC

gyrA-94AAC：NH2-(CH2)12-ACCAGGGTGTTGTAGATCGACGC

4.检测：

用MAGPIX仪器分别读取经步骤(3)杂交后微球上的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值。

结果如表1所示，该样本异烟肼耐药相关katG基因315位突变位点的野生型探针katG-315AGC的荧光值为2415，大于100，且超过突变型探针katG-315ACC荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有katG基因315位相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位碱基突变位点的突变型探针inhA—-15T的荧光值为3173，大于100，且为野生型探针inhA—-15C荧光值的1.5倍以上，所以该样本携带有inhA基因-15位碱基相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位突变位点的野生型探针inhA—-8T的荧光值为1688，大于100，且为突变型探针inhA—-8A荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有inhA基因-8位碱基相关的耐药突变。综上，该样本含有可能对异烟肼耐药的结核分枝杆菌。

该样本乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的野生型探针embB-306ATG的荧光值为3063，大于100，且为突变型探针embB-306GTG和突变型探针embB-306CTG的1.5倍以上，所以该样本不含有embB基因306位位点的相关耐药突变。该样本乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的野生型探针embB-306ATG-2的荧光值为3205，大于100，且为突变型探针embB-306ATA-2、突变型探针embB-306ATT-2和突变型探针embB-306ATC-2荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有embB基因306位突变位点的耐药突变。综上，该样本中不带有乙胺丁醇耐药的结核分枝杆菌。

该样本利福平耐药相关基因rpoB基因511位突变位点的野生型探针rpoB-511CTG的荧光值为2914，大于100，且大于突变型探针rpoB-511CCG荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有rpoB基因511位相关的耐药突变。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因513位突变位点的野生型探针rpoB-513CAA的荧光值为2914，大于100，且数值大于突变型探针rpoB-513AAA和突变型探针rpoB-513CCA荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带rpoB基因513位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因516位突变位点的野生型探针rpoB-516GAC的荧光值为2197，大于100，且数值大于突变型探针rpoB-516GTC和突变型探针rpoB-516GGC检测荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带rpoB基因516位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因526位突变位点的野生型探针rpoB-526CAC的荧光值为2824，大于100，且数值为突变型探针rpoB-526TAC和突变型探针rpoB-526GAC的1.5倍以上，所以该样本不含有携带rpoB基因526位耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因531位突变位点的突变型探针rpoB-531TTG的荧光值为2634，大于100，且数值大于野生型探针rpoB-531TCG荧光值的1.5倍以上，所以该样本含携带有rpoB基因531位耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因533位突变位点的野生型探针rpoB-533CTG的荧光值为594，大于100，且数值为突变型探针rpoB-533CCG荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带rpoB基因533位耐药突变的结核分枝杆菌。综上，此结果提示该检测样本中含有可能针对利福平耐药的结核分枝杆菌。

经检测该样本中氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因88位突变位点的野生型探针gyrA-88GGC的荧光值为2412，大于100，且数值为突变型探针gyrA-88TGC荧光值的1.5倍以上,所以该样本不含有携带gyrA基因88位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位突变位点的野生型探针gyrA-90GCG的荧光值为1992，大于100，且数值为突变型探针gyrA-90GTG荧光值的1.5倍以上,所以该样本不含有携带gyrA基因90位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位突变位点的野生型探针gyrA-91TCG的荧光值为1992，大于100，且数值为突变型探针gyrA-91CCG荧光值的1.5倍以上,所以该样本不含有携带gyrA基因91位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的突变型探针gyrA-94GCC的荧光值为2560，大于100，且数值为野生型探针gyrA-GAC、突变型探针gyrA-94TAC、突变型探针gyrA-94GGC、突变型探针gyrA-94CAC、突变型探针gyrA-94GCC和突变型探针gyrA-94AAC荧光值的1.5倍以上，所以该样本含有携带了gyrA基因94位耐药突变的结核分枝杆菌。综上，该样本含有可能针对氟喹诺酮类药物产生耐药表型的结核分枝杆菌。

该检测结果与样品已知的结果完全一致。

实施例二

已知样品2中含有乙胺丁醇、利福平和氟喹诺酮类药物耐药的结核分枝杆菌，依照本发明的方法进行检测，具体实验步骤与样品1相同，荧光检测值的结果如表1所示。该样本异烟肼耐药相关katG基因315位突变位点的野生型探针katG-315AGC的荧光值为2535，大于100，且检测数值为突变型探针katG-315ACC荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有katG基因315位相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位突变位点的野生型探针inhA-15C的荧光值为1659，大于100，且该数值为突变型探针inhA-15T荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带inhA基因-15位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位突变位点的野生型探针inhA基因-8T的荧光值为1786，大于100，且数值为突变型探针inhA-8A荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带inhA基因-8位相关耐药突变的结核分枝杆菌。综上，该样本中不含有异烟肼耐药的结核分枝杆菌。

该样本乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的突变型探针embB-306GTG的荧光值为3317.5，大于100，且数值大于野生型探针embB-306ATG和突变型探针embB-306CTG的1.5倍以上，所以该样本含有携带embB基因306位的耐药突变的结核分枝杆菌。该样本乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的野生型探针embB-306ATG-2的荧光值为759，大于100，且检测数值大于突变型探针embB-306ATA-2、突变型探针embB-306ATT-2和突变型探针embB-306ATC-2检测荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带embB基因306位突变位点耐药突变的结核分枝杆菌。综上，该样本内含有可导致乙胺丁醇耐药表型的的结核分枝杆菌。

该样本利福平耐药相关基因rpoB基因511位突变位点的野生型探针rpoB-511CTG的荧光值为2924，大于100，且检测数值大于突变型探针rpoB-511CCG荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带rpoB基因511位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因513位突变位点的野生型探针rpoB-513CAA的荧光值为2924，大于100，且检测数值大于突变型探针rpoB-513AAA和突变型探针rpoB-513CCA荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带rpoB基因513位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因516位突变位点的野生型探针rpoB-516GAC的荧光值为2074.5，大于100，且检测数值大于突变型探针rpoB-516GTC和突变型探针rpoB-516GGC荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带rpoB基因516位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因526位突变位点的野生型探针rpoB-526CAC的荧光值为2779，大于100，且检测数值大于突变型探针rpoB-526TAC和突变型探针rpoB-526GAC的1.5倍以上，所以该样本不含有携带rpoB基因526位耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因531位突变位点的突变型探针rpoB-531TTG的荧光值为2600，大于100，且检测数值大于野生型探针rpoB-531TCG荧光值的1.5倍以上，所以该样本含有携带rpoB基因531位耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因533位突变位点的野生型探针rpoB-533CTG的荧光值为588，大于100，且该检测数值大于突变型探针rpoB-533CCG检测荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带rpoB基因533位耐药突变的结核分枝杆菌。综上，该样本内含有可出现利福平耐药表型的结核分枝杆菌。

该样本氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因88位突变位点的野生型探针gyrA-88GGC的荧光值为2370.5，大于100，且该数值大于突变型探针gyrA-88TGC检测荧光值的1.5倍以上,所以该样本不含有携带gyrA基因88位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位突变位点的突变型探针gyrA-90GTG的荧光值为2366，大于100，且该数值大于野生型探针gyrA-90GCG检测荧光值的1.5倍以上,所以该样本含有携带gyrA基因90位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位突变位点的野生型探针gyrA-91TCG的荧光值为575，大于100，且该数值大于突变型探针gyrA-91CCG荧光值的1.5倍以上,所以该样本不含有携带gyrA基因91位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的野生型探针gyrA-GAC的荧光值为1866，大于100，且该数值大于突变型探针gyrA-94TAC、突变型探针gyrA-94GGC、突变型探针gyrA-94CAC、突变型探针gyrA-94GCC和突变型探针gyrA-94AAC荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带gyrA基因94位耐药突变的结核分枝杆菌。综上，该样本内含有可能引起氟喹诺酮类药物耐药的结核分枝杆菌。

该检测结果与样品已知的结果完全一致。

实施例三

已知样品3中含有异烟肼耐药的结核分枝杆菌，依照本发明的方法进行检测，具体实验步骤与样品1相同，荧光检测值的结果如表1所示。该样本异烟肼耐药相关katG基因315位突变位点的野生型探针katG-315AGC的荧光值为2449，大于100，且该数值大于突变型探针katG-315ACC检测荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带katG基因315位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位突变位点的突变型探针inhA-15T的荧光值为3342，大于100，且该数值大于野生型探针inhA-15C检测荧光值的1.5倍以上，所以该样本含有携带inhA基因-15位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位突变位点的野生型探针inhA基因-8T的荧光值为1700，大于100，且该数值大于突变型探针inhA-8A检测荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带inhA基因-8位相关耐药突变的结核分枝杆菌。综上，该样本含有可能对异烟肼药物表现出耐药表型的结核分枝杆菌。

该样本乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的野生型探针embB-306ATG的荧光值为2533，大于100，且该数值大于突变型探针embB-306GTG和突变型探针embB-306CTG的两倍，所以该样本不含有携带embB基因306位耐药突变的结核分枝杆菌。该样本乙胺丁醇耐药相关基因embB基因306位突变位点的野生型探针embB-306ATG-2的荧光值为2793，大于100，且该检测数值大于突变型探针embB-306ATA-2、突变型探针embB-306ATT-2和突变型探针embB-306ATC-2检测荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带embB基因306位突变位点耐药突变的结核分枝杆菌。综上，该样本不含可能导致对乙胺丁醇耐药表型的结核分枝杆菌。

该样本利福平耐药相关基因rpoB基因511位突变位点的野生型探针rpoB-511CTG的荧光值为3358，大于100，且该数值大于突变型探针rpoB-511CCG荧光值的1.5倍，所以该样本不含有携带rpoB基因511位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因513位突变位点的野生型探针rpoB-513CAA的荧光值为3358，大于100，且该检测数值大于突变型探针rpoB-513AAA和突变型探针rpoB-513CCA检测荧光值的1.5倍，所以该样本不含有携带rpoB基因513位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因516位突变位点的野生型探针rpoB-516GAC的荧光值为2455.5，大于100，且该数值大于突变型探针rpoB-516GTC和突变型探针rpoB-516GGC荧光值的1.5倍，所以该样本不含有携带rpoB基因516位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因526位突变位点的野生型探针rpoB-526CAC的荧光值为1638，大于100，且该数值大于突变型探针rpoB-526TAC和突变型探针rpoB-526GAC的1.5倍以上，所以该样本不含有携带rpoB基因526位耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因531位突变位点的野生型探针rpoB-531TCG的荧光值为1651，大于100，且该检测数值大于突变型探针rpoB-531TTG荧光值的1.5倍，所以该样本不含有携带rpoB基因531位耐药突变的结核分枝杆菌。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因533位突变位点的野生型探针rpoB-533CTG的荧光值为1651，大于100，且该检测数值大于突变型探针rpoB-533CCG检测荧光值的1.5倍以上，所以该样本不含有携带rpoB基因533位耐药突变的结核分枝杆菌。综上，该样本不含有可能携带针对利福平产生耐药突变的结核分枝杆菌。

该样本氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因88位突变位点的野生型探针gyrA-88GGC的荧光值为2207.5，大于100，且该数值大于突变型探针gyrA-88TGC检测荧光值的1.5倍以上,所以该样本不含有携带gyrA基因88位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位突变位点的野生型探针gyrA-90GCG的荧光值为1898，大于100，且该数值大于突变型探针gyrA-90GTG荧光值的1.5倍,所以该样本不含有携带gyrA基因90位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位突变位点的野生型探针gyrA-91TCG的荧光值为1898，大于100，且该检测值大于突变型探针gyrA-91CCG检测荧光值1.5倍以上,所以该样本不含有携带gyrA基因91位相关耐药突变的结核分枝杆菌。该样本氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位突变位点的野生型探针gyrA-GAC的荧光值为2190，大于100，且该数值大于突变型探针gyrA-94TAC、突变型探针gyrA-94GGC、突变型探针gyrA-94CAC、突变型探针gyrA-94GCC和突变型探针gyrA-94AAC荧光值的1.5倍，所以该样本不含有携带gyrA基因94位耐药突变的结核分枝杆菌。综上，该样本不含有可针对氟喹诺酮类药物产生耐药突变表型的结核分枝杆菌。

该检测结果与样品已知的结果完全一致。

表一

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以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。