ANXA6+肿瘤相关成纤维细胞在EGFR突变介导的疾病治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医学，具体涉及成纤维细胞在疾病治疗中的应用

背景技术

人表皮生长因子受体(EGFR，epidermal growth factor receptor，简称为EGFR、ErbB-1或HER1)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。EGFR表达于正常上皮细胞表面，在许多实体肿瘤细胞中存在EGFR的高表达或异常表达，包括头颈癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌以及非小细胞肺癌等，尤其是肺癌，亚裔肺癌人群中EGFR突变率可达到50％(Seshacharyulu P等，Expert Opin Ther Targets,2012；16:15–31)。

EGFR是肿瘤靶向治疗的热门靶点。目前发现的EGFR酪氨酸激酶(EGFR TK)可以催化ATP的高能磷酸键转移到EGFR的数个酪氨酸位点，使其磷酸化，从而激活下游的PI3K/Akt、Ras/MAPK等信号通路，促进细胞进生长增殖、代谢，抑制细胞凋亡。细胞中EGFR过度表达和突变时，会阻碍细胞程序死亡，使细胞的生长调节失控，而获得无限增殖和侵袭能力，即发展成为恶性肿瘤细胞。EGFR TKI通过与ATP竞争胞内酪氨酸激酶的结合位点，阻止受体内酪氨酸的自身磷酸化，抑制EGFR酪氨酸激酶激活，从而抑制肿瘤细胞生长、加速肿瘤细胞凋亡，抑制血管生成和肿瘤细胞浸润、转移。小分子EGFR TKI的基本结构为喹唑啉胺。EGFRTKI可分为：1)可逆性TKI主要有：吉非替尼(gefitinib)，厄洛替尼(erlotinib)，拉帕替尼(Lapatinib)，2)不可逆性TKI主要有：阿法替尼(Afatinib)，达可替尼(Dacomitinib)。目前，可逆性和不可逆性EGFR TKI对突变EGFR非小细胞肺癌短时间内具有显著的疗效，但最终均因产生获得性耐药而导致治疗失败，并没有明显延长患者的生存期。目前有多种针对性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)获批用于EGFR基因敏感突变患者的治疗，可取得较好的疗效，显著延长生存期，改善生活质量，以奥西替尼为代表的三代EGFR-TKI给患者带来超3年的长期生存，但最终都不可避免地出现耐药。目前已经有部分四代EGFR-TKIs进入临床研究，能否让患者获益还需进一步探索。

人膜联蛋白A6(annexin A6，ANXA6)基因由26个外显子组成，约6000bp，位于染色体5q32-q34上，是高度保守的Ca

肿瘤是由恶性肿瘤细胞及大量非肿瘤细胞组成的复杂结构，它们之间相互作用共同构成肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)。TME主要由肿瘤周围的血管、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和其他非肿瘤细胞(包括成纤维细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞，以及T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、肿瘤相关巨噬细胞等免疫细胞)以及细胞分泌的细胞因子和外泌体等组成。其中，肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblats，CAFs)是TME中一类重要细胞组分，来源广泛，可由固有成纤维细胞、骨髓间充质干细胞和造血干细胞、脂肪干细胞、内皮细胞及肝细胞星状细胞等转化而来。CAF是TME中最为丰富的一类细胞，它的异质性很强，分别表现在其起源、功能、表型和生物标志物等方面，大多数文献报道均为CAF可以促进肿瘤的发生发展，但是仍然有小部分研究者发现CAF也发挥着抑制肿瘤的作用，如Brechbuhl HM等人发现在乳腺癌中CD146阳性的CAFS增强乳腺癌细胞的他莫昔芬敏感性，Patel等发现口腔癌中a-SMA表达低的CAFs可通过骨形态发生蛋白4(bonemorphogenetic protein 4，BMP4)抑制干细胞样肿瘤细胞的自我更新等。

发明内容

基于本申请对人膜联蛋白A6基因和肿瘤相关成纤维细胞(CAF)的研究发现，CAF细胞中的人膜联蛋白A6基因的过表达可以促进EGFR突变肺腺癌细胞对靶向药物的抵抗作用，而CAF细胞中ANXA6表达降低时明显逆转EGFR突变肺腺癌细胞对靶向药物的抵抗。基于此，完成了本发明。

第一方面，本发明提供一种ANXA6基因在制备治疗EGFR突变介导的疾病的诊断制剂中的应用，所述应用为当检测到有ANXA6基因在CAF细胞中过表达时，则EGFR突变介导的疾病不能采用EGFR靶向药物进行治疗。

进一步的，所述EGFR靶向药物为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)。

进一步的，所述EGFR-TKIs包括但不限于吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼(AZD9291)或伏美替尼。

进一步的，所述EGFR突变介导的疾病包括癌症。

进一步的，所述癌症包括但不限于成胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、神经系统的癌症、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、生殖-泌尿癌和膀胱癌。

进一步的，EGFR介导的癌症优选肺腺癌、肺鳞状细胞癌或非小细胞肺癌。

第二方面，本发明提供一种不适用EGFR靶向治疗的肺腺癌人群的筛选方法，所述方法包括如下步骤：

S1.采集受试者的肿瘤组织；

S2.从肿瘤组织中分离CAF细胞；

S3.检测CAF细胞中的ANXA6基因表达量的检测。

S4.人群判断：依据CAF细胞中是否有ANXA6基因的过表达确定为不适用人群。

进一步的，所述不适用EGFR靶向治疗的人群为CAF细胞中ANXA6基因的过表达的人群。

进一步的，所述EGFR靶向治疗包括但不限于吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼(AZD9291)或伏美替尼的药物治疗。

第三方面，本发明提供一种制剂组合物，所述制剂组合物含有抑制CAF细胞中ANXA6基因表达的抑制剂和EGFR靶向制剂以及药学上可接受的药物辅料。

进一步的，所述抑制剂还含有其他活性成分，所述活性成分为增强CAF细胞中ANXA6基因表达的抑制剂的活性成分且不影响EGFR靶向制剂功效的活性成分。

进一步的，所述活性成分可以是增强CAF细胞中ANXA6基因表达的抑制剂的活性成分且还提高EGFR靶向制剂功效的活性成分。

第四方面，本发明提供一种制剂组合物在制备EGFR靶向治疗EGFR突变介导的疾病的药物中的应用。

进一步的，所述制剂组合物为含有抑制CAF细胞中ANXA6基因表达的抑制剂和EGFR靶向制剂以及药学上可接受的药物辅料。

进一步的，所述抑制剂还含有其他活性成分，所述活性成分为增强CAF细胞中ANXA6基因表达的抑制剂的活性成分且不影响EGFR靶向制剂功效的活性成分。

进一步的，所述活性成分可以是增强CAF细胞中ANXA6基因表达的抑制剂的活性成分且还提高EGFR靶向制剂功效的活性成分。

进一步的，所述EGFR突变介导的疾病包括但不限于成胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、神经系统的癌症、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、生殖-泌尿癌和膀胱癌。

进一步的，EGFR介导的癌症优选肺腺癌、肺鳞状细胞癌或非小细胞肺癌。

进一步的，所述EGFR靶向制剂为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)。

进一步的，所述EGFR-TKIs包括但不限于吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼(AZD9291)或伏美替尼。

附图说明

图1为ANXA6

E：ANXA6

F：ANXA6

G：ANXA6

H：ANXA6

I：ANXA6

图2敲降ANXA6的CAF上清处理EGFR突变肺腺癌细胞后，肺癌细胞对奥西替尼的敏感性分析；

A：敲降ANXA6的CAF上清处理HCC827细胞96小时，HCC827细胞对奥西替尼的应答情况；

B：敲降ANXA6的CAF上清处理PC-9细胞96小时，PC-9细胞对奥西替尼的应答情况；C：敲降ANXA6的CAF上清处理H1975细胞96小时，H1975细胞对奥西替尼的应答情况。

图3为ANXA6

图4为ANXA6

图5为ANXA6

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例

实施例中细胞培养条件均为：37℃、5％CO

实施例中所用的基础培养基为：10％RPMI-1640(取无血清RPMI-1640培养基，加入胎牛血清至浓度为10％、加入青霉素至浓度为1％、加入链霉素至浓度为1％)和10％DMEM(取无血清DMEM培养基，加入胎牛血清至浓度为10％、加入青霉素至浓度为1％、加入链霉素至浓度为1％)。

实施例1 ANXA6

1.ANXA6

2.将HCC827、PC-9、H1975三种细胞接种于10％RPMI-1640培养基中，将生长90％汇合的细胞进行传代，加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞，加入完全培养基吹打混匀，混匀后用Muse细胞计数仪进行计数。

3.在96孔板中接种HCC827、PC-9、H1975三种细胞，每孔细胞数为5000个，待24小时细胞贴壁生长。

4.将ANXA6

5.将ANXA6

6.将96孔板置入细胞培养箱中，分别在奥西替尼作用细胞48小时、72小时和96小时后测定细胞的OD值，得到数据。

7.依据数据绘制细胞对奥西替尼的药物敏感性曲线。

8.实验结果：

如图1，奥西替尼作用48小时HCC827细胞IC50为5.20nM，ANXA6

综上所述，与3种细胞自身比较，ANXA6

实施例2敲降ANXA6的CAF细胞上清处理EGFR突变肺腺癌细胞的抗药性影响

1.使用CRISPR-Cas9技术在ANXA6

2.将HCC827、PC-9、H1975三种细胞接种于10％RPMI-1640培养基中，将生长90％汇合的细胞进行传代，加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞，加入完全培养基吹打混匀，混匀后用Muse细胞计数仪进行计数。

3.在96孔板中接种HCC827、PC-9、H1975三种细胞，每孔细胞数为5000个，待24小时细胞贴壁生长。

4将ANXA6

5.将ANXA6

6.将96孔板置入细胞培养箱中，在奥西替尼作用细胞96小时后测定细胞的OD值，得到数据。

7.依据数据绘制细胞对奥西替尼的药物敏感性曲线。

如图2所示，用ANXA6

ANXA6

ANXA6

结果提示用ANXA6表达降低的CAF细胞上清处理HCC827、PC-9和H1975细胞后，明显逆转这3种细胞对奥西替尼的抵抗。

实施例3 ANXA6

1.将HCC827细胞和ANXA6

2.根据计数结果，将细胞悬液稀释为1×10

3.准备相应数量的周龄为4周的BALB/c裸鼠，混匀细胞悬液后，分别用注射器将两组细胞接种于裸鼠腋下，每个部位注射细胞悬液200万细胞，每种细胞接种6只裸鼠。

5.等待裸鼠腋下成瘤后，按照150mg/kg剂量腹腔注射荧光素酶，15分钟后，用小动物活体成像系统观察裸鼠腋下瘤块情况。

6.待肿瘤大小为400±32.97mm

7.于给药后第5天、第9天、第12天、第17天、第23天时按照150mg/kg剂量腹腔注射荧光素酶，15分钟后，用小动物活体成像系统观察裸鼠腋下瘤块变化的情况。

8.实验结果

如图3所示，将ANXA6

实施例4敲降ANXA6的CAF(ANXA6

1.将PC-9细胞、ANXA6

2.根据计数结果，将细胞悬液稀释成1×10

3.准备相应数量的周龄为4周的BALB/c裸鼠，混匀细胞悬液后，用注射器接种于裸鼠腋下，每个部位注射细胞悬液200万细胞，每种细胞接种6只裸鼠。

5.等待裸鼠腋下成瘤后，按照150mg/kg剂量腹腔注射荧光素酶，15分钟后，用小动物活体成像系统观察裸鼠腋下瘤块情况。

6.待肿瘤大小为390±28.61mm

如图4所示，将ANXA6

实施例5 ANXA6

将培养的HCC827细胞和ANXA6

转移灶缩小判断依据：按照150mg/kg剂量给小鼠腹腔注射荧光素酶底物，10分钟后，使用小动物成像系统进行成像，对比治疗前后病灶荧光信号强弱，计算病灶改变情况。

1.将HCC827细胞和HCC827-3接种在10％RPMI-1640培养基中，培养至70％到80％汇合度。

2.加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。加入基础培养基，混匀，离心后弃上清。用培养基重悬，重悬后用Muse细胞计数仪进行计数。

3.用生理盐水洗涤细胞3次，用生理盐水重悬细胞至1×10

4.准备相应数量的NOD/SCID雌小鼠，周龄4周。

5.细胞悬液混匀后，以200万/只数量将HCC827/HCC827-3细胞经尾静脉进行注射，每种细胞接种5只小鼠。

6.等待1.5个月时，按照150mg/kg剂量腹腔注射荧光素酶，15分钟后，用小动物活体成像系统观察到小鼠均有肺转移情况。

7.伏美替尼按照5mg/kg的剂量给与小鼠灌胃治疗，0.1ml/天/只。

8.分别在给药10天、20天、30天、40天、51天、60天、80天、90天时按照150mg/kg剂量腹腔注射荧光素酶，15分钟后，用小动物活体成像系统观察小鼠肺转移灶大小情况。

为了观察ANXA6