博莱霉素用于模拟电离辐射对T细胞的效应

技术领域

本发明涉及电离辐射对细胞，特别是对淋巴细胞的效应的测定。更具体地说，本发明涉及在不使用电离辐射的情况下，模拟电离辐射对细胞效应的方法。本发明的方法特别可用于在电离辐射治疗/辐射疗法治疗之前评估受试者的个体辐射敏感性。

背景技术

电离辐射治疗是肿瘤学的主要治疗方式之一，50％以上的诊断具有癌症的患者在其治疗过程中接受过电离辐射治疗。虽然通过电离辐射的治疗主要是局部治疗，但患者在治疗区域(尤其是肿瘤周围组织中)暴露于毒性的风险中，其可发展为急性(即，在前3个月)或晚期(即，在治疗之后超过3个月以上)。因为恢复可能不完全，严重的急性毒性可能会具有晚期后果。此外，晚期毒性可能会随着时间的推移而发生，并经常持续存在，在癌症幸存者中对生活质量产生重大负面影响。

已知有许多因素会增加辐射诱导毒性的风险，包括个体辐射敏感性(Azria，Betz等人，2012年)。虽然对患者群体的毒性风险是已知的，但在治疗前很难确定个体正常组织的辐射敏感性。因此，目前的实践标准通常根据标准建议中的临床情景来规定辐射剂量，而不考虑待辐射个体的基因型或表型。

此前，基于对RILA(辐射诱导T-淋巴细胞凋亡)的流式细胞术评估，开发辐射敏感性诊断测试。这项诊断测试被描述为具有明显的潜力用于选择可能对电离辐射治疗显示出增加的毒性概率的个体(Ozsahin，Crompton等人2005年)。

然而，RILA测试涉及到用电离辐射处理细胞的步骤。因此，在没有配备细胞辐射器、没有被授权使用这种设备的标准医学分析实验室中，可能不会容易和常规地实施RILA测试。

WO 2014/154854公开了用于模拟电离辐射对T细胞(T淋巴细胞)效应的体外方法，包括将所述T细胞与辐射模拟剂(如博莱霉素)接触，但未公开或建议本文公开的持续时间。

Ozsahin等人(Clin Cancer Res，2005年10月15日；11(20)：7426-33)公开，辐射诱导的T-淋巴细胞凋亡可明显地预测个体之间的晚期毒性差异，并可用于快速筛查对辐射治疗超敏感的患者。

Weng等人(Mutat Res.，2008年3月29日；652(1)：46-53)通过体外测量诱导的和基础的DNA损伤，表征了人白细胞的不同亚群暴露于H

Adema等人(Int J Radiat Biol.，2003年8月；79(8)：655-61)表明，在染色单体断裂的G2分析中，博莱霉素和辐射具有相同的敏感性表型(这可以被认为是对DNA损伤反应的辐射敏感性易感基因的标记)。然而，该试验不同于如上所述的RILA，细胞暴露于博莱霉素的持续时间也不同于本文所述的试验。

Tedeschi等人(Mutat Res.，2004年2月26日；546(1-2)：55-64)描述阿非迪霉素(APC)和博莱霉素(BLM)在体外处理培养的人淋巴细胞中进行诱导后，在诱导染色体损伤的个体表达中某种遗传学基础。博莱霉素的暴露时间与本文公开的不同。

Azria等人(Cancer Radiother.，2008年11月12日(6-7)：619-24)公开最近CD4和CD8淋巴细胞凋亡低百分比与高度的后遗症有关，并且患有严重辐射诱导晚期副作用的患者在候选基因(ATM、SOD2、TGFB1、XRCC1和XRCC3)上存在4个或更多SNP，并在体外低辐射-诱导CD8淋巴细胞凋亡。

所有这些文件都表明，在某些条件下，可以使用博莱霉素产生与某些辐射相同类型的DNA断裂。然而，对于博莱霉素模拟RILA所用辐射条件的能力，以及是否可以产生能够取代RILA的体外测试，这些文献都没有提及。

因此，特别是在RILA领域，需要在不使用辐射器的情况下(出于安全或监管的原因)模拟电离辐射效应的方法。

因此，严重需要去开发一种不需要辐射步骤的RILA测试的替代。

本文申请人提供了这样一种替代方法，其中使细胞与特定浓度的博莱霉素接触一段特定的时间。

发明内容

本发明涉及一种用于模拟电离辐射对T细胞效应的体外方法，包括将所述T细胞与至少一种辐射模拟剂(优选博莱霉素)接触一段至少50小时的时间。

在一个实施方案中，所述至少一种辐射模拟剂(优选博莱霉素)的浓度范围为约100至约300μg/ml。

在一个实施方案中，所述方法模拟剂量范围为约2至约10Gy，优选为约6至约10Gy，更优选为约8Gy的电离辐射的效应。

在一个实施方案中，所述效应是辐射后48小时观察到的淋巴细胞凋亡百分比。

在一个实施方案中，使用下列数学公式来测定所述至少一种辐射模拟剂(优选博莱霉素)的剂量：

其中，

在一个实施方案中，在约37℃的温度和约5％的CO

在一个实施方案中，所述T细胞是CD8

在一个实施方案中，所述T细胞包含在选自以下的含有T细胞的样本中：血液样本，或者从骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织、和肿瘤中回收的样本，优选地，所述含有T细胞的样本是血液样本，更优选地，所述含有T细胞的样本是全血样本。

在一个实施方案中，所述方法是一种用于测定受试者的个体辐射敏感性的方法，并且包括用至少一种辐射模拟剂(优选为博莱霉素)接触之前从受试者获得的含有T细胞的样本至少50小时的一段时间。

在一个实施方案中，所述受试者诊断为患有癌症。

在一个实施方案中，所述受试者使用电离辐射治疗进行治疗或计划使用电离辐射治疗进行治疗。

在一个实施方案中，所述方法用于评估在电离辐射治疗之后发展出副作用的风险。

在一个实施方案中，所述方法包括：

a.用至少一种辐射模拟剂(优选博莱霉素)接触之前从受试者获得的含有T细胞的样本，以及

b.测量来自受试者的样本中CD8

在一个实施方案中，所述方法包括将在步骤(b)中测量的CD8

本发明还涉及用于实施上述体外方法的试剂盒，该试剂盒包含用于测量辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡的装置(mean)。在一个实施方案中，所述试剂盒包括至少一种辐射模拟剂，优选为博莱霉素，以及用于测量CD8

定义

在本发明中，下列术语具有以下含义：

术语“一种”和“一个”指的是文章的语法对象的一个或多个(即，至少指一个)。举个例子，“一种元素”指的是一个元素或多个元素。

当提及诸如量、持续时间等的可测量值时，术语“约”意指包含距指定值±20％、或在某些情况下±10％、或在某些情况下±5％、或在某些情况下±1％、或在某些情况下±0.1％的变量，因为这种变量适合执行公开的方法。

术语“生化标记物”是指在来自受试者的样本(所述样本优选为血液样本)中可以测量的变量。

术语“Cox回归”指的是用于时间-对-事件分析的常用统计模型(Cox等人，1984)。除了直接处理二元或多类结果的分类算法之外，Cox回归定义了半参数模型以将预测变量与实际结果直接相关，实际结果可以是，例如生存时间(例如，月或年)、或没有发生副作用的时间、或疾病复发的时间。在区分时间-对-事件终点方面，多变量Cox函数被认为是组合独立参数的最佳风险函数。

术语“编码”指的是多核苷酸中的核苷酸的特定序列的固有属性，例如基因、cDNA、或mRNA，用作生物过程中其他聚合物和大分子合成的模板，这些聚合物和大分子具有定义的核苷酸序列(例如rRNA、tRNA和mRNA)、或定义的氨基酸序列、以及由此产生的生物属性。因此，如果基因、或cDNA对应的mRNA在细胞或其他生物系统中转录和翻译产生蛋白质，则该基因、cDNA、或RNA编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和用作基因或cDNA转录模板的非编码链，都可以被称为编码蛋白、或该基因或cDNA的其他产物。

术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

术语“指导性材料”包括出版物、记录、图表、或任何可用于传达本发明试剂盒的有用性的其他表达介质。本发明的试剂盒的指导性材料，可以例如被固定到包含用于实施本发明方法的试剂的容器上，或者与包含用于实施本发明方法的试剂的容器一起运输。或者，指导性材料可以与容器分开运输，目的是使指导性材料由接收者合作使用。

术语“体外方法”是指一种包括在体外(in vitro)(例如，凋亡的测量)或离体(ex-vivo)(例如，通过之前在患者上评估的凋亡百分比、临床参数或生化标记物所获得的多变量Cox回归模型)执行的步骤的方法。

当提及根据本发明的方法时，术语“非侵入性”指的是本发明的方法不包括从受试者的身体获得组织样本。在一个实施方案中，不认为血液样本是组织样本。

在统计学上“ROC”，接收者操作特征曲线(ROC)或ROC曲线，是说明二元分类器系统在其区分阈值变化时的性能的图形图解。该曲线是通过绘制针对特异性(通常为1-特异性)的灵敏度(0到1之间的连续值)创建而成。

“AUROC”代表ROC曲线下面积，是预后或诊断测试的准确性的指标。ROC曲线和AUROC在统计学领域是众所周知的。

术语“预后方法的灵敏度(Se)”指的是使用预后方法，将具有发展出副作用风险的患者正确地鉴定为如此的比例。

术语“预后方法的特异性(Sp)”指的是使用预后方法，将不具有发展出副作用风险的患者正确地鉴定为如此的比例量度。

术语“副作用”(或不良事件)是指与使用医疗治疗暂时相关的不利的和非预期的体征(包括实验室发现的异常)、症状或疾病。具体地说，电离辐射-诱导的副作用是在受试者中由电离辐射治疗诱导的副作用。副作用的严重程度可以根据不良事件通用术语标准(Common Terminology Criteria for Adverse Event)(CTCAE，例如CTCAE v3.0或CTCAEv4.0或CTCAE v5.0)来定义。根据CTCAE，在全球范围可以区分以下级别的副作用：1级：轻度副作用，2级：中度副作用，3级：严重副作用，4级：危及生命或致残的副作用，以及5级：与副作用有关的死亡，但是对每种症状需要专门定义。在本发明的一个实施方案中，副作用至少是2级副作用。在一个实施方案中，副作用是2级、3级、4级或5级副作用，优选为2级、3级或4级副作用。

术语“受试者”意在包括任何活的有机体(例如，哺乳动物，优选人类)。在一个实施方案中，受试者是“患者”，即，温血动物，优选人类，其正等待接受或正在接受医疗护理、或曾经/现在/将成为医疗程序的对象，或被监测目标疾病或病状的发展。在一个实施方案中，受试者是成年人(例如，18岁以上的受试者)。在另一个实施方案中，受试者是儿童(例如，18岁以下的受试者)。在一个实施方案中，受试者是男性。在另一个实施方案中，受试者是女性。

术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指减少或改善目标疾病(例如，癌症)的进展、严重程度和/或持续时间，或改善目标疾病的一个或多个症状(优选是一个或多个可辨别的症状)，其中所述改善是通过施用一种或多种疗法而产生的。在一个实施方案中，术语“治疗”、“治疗”和“治疗”指的是通过在物理上通过，例如稳定至少一个可辨别症状、或者在生理上通过，例如稳定生理参数，或两者兼而有之地抑制目标疾病的进展。在其他实施方案中，术语“治疗”、“治疗”和“治疗”是指减少或改善目标疾病的进展、严重程度和/或持续时间，或指目标疾病的一个或多个症状的改善。如果受试者在接受治疗有效剂量的治疗剂或治疗后，受试者表现出可观察的和/或可测量的致病细胞数量的减少或致病细胞总数百分比的减少；与特定疾病相关的一种或多种症状在一定程度上得到缓解；发病率和死亡率降低，和/或生活质量问题得到改善，则成功地“治疗”了受试者的疾病。上述用于评估成功治疗和病情改善的参数很容易通过医生熟悉的常规程序进行测量。

具体实施方式

本发明首先涉及一种用于模拟电离辐射对T淋巴细胞的效应的体外方法，包括使所述T淋巴细胞与至少一种辐射模拟剂接触。

这里使用的术语“辐射模拟剂”是这样一种物质，其对活细胞产生的效应与电离辐射引起的相类似。

在一个实施方案中，所述至少一种辐射模拟剂选自、但不限于以下：博莱霉素、链黑菌素(streptonigrin)、阿非迪霉素(aphidicolin)、烯二炔抗生素、和过氧化氢。

在一个实施方案中，所述至少一种辐射模拟剂是博莱霉素，例如，如溶解在乙醇、水或DMSO中的博莱霉素。优选地，博莱霉素是在水性溶剂中。可以在本发明中使用的博莱霉素盐的示例包括但不限于，博莱霉素硫酸盐或博莱霉素盐酸盐。在一个实施方案中，本发明中使用的博莱霉素是博莱霉素硫酸盐，优选在水溶剂中的博莱霉素硫酸盐。博莱霉素是商业上可获得的。可以使用的博莱霉素制剂的示例包括但不限于由Euromedex或Interchim提供的博莱霉素。

在一个实施方案中，T细胞是CD4

在一个实施方案中，本发明的T细胞包含在含有T细胞的样本中，或者从含有T细胞的样本中回收。

含有T细胞样本的示例包括但不限于，全血样本和从骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤中回收的样本。在本文公开的方法中可以使用的其他含有T细胞的样本，例如，主要含有PBMC(外周血单个核细胞)或分离的T细胞(特别是分离的CD8 T细胞)的提取物。主要意在表明在提取物中存在的细胞中至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％是所指示的细胞类型。

在一个实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术，例如，如通过白细胞分离，从受试者采集的单位血液中获得含有T淋巴细胞的样本。

在一个实施方案中，所述样本是体液样本，例如，如血液、血浆、血清、淋巴、尿液、脑脊液或汗液样本。

在一个实施方案中，所述样本是血液样本。

在一个实施方案中，在实施本发明的方法之前回收样本，即，回收样本的步骤不是本发明方法的一部分。

在一个实施方案中，在肝素化试管中从受试者采集含有T细胞的样本(优选血液样本)。

在一个实施方案中，新鲜回收含有T细胞的样本。在一个实施方案中，含有T细胞的样本在室温(优选从大约18℃到大约25℃)下保存在肝素化的试管中。

在另一个实施方案中，含有T细胞的样本超低温保存(即，在液氮中冷冻)并解冻。

在一个实施方案中，在接触至少一种辐射模拟剂之前，在细胞培养介质中培养T细胞。可以使用的细胞培养介质的示例，包括但不限于RPMI-1640(Thermofish，法国)和DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium，Thermofish)。在一个实施方案中，细胞培养介质可任选地添加20％胎牛血清(FCS)(例如，由法国EuroBio提供的FCS)。在一个实施方案中，在37℃、5％CO

在一个实施方案中，将至少一种辐射模拟剂添加到培养介质中。

在一个实施方案中，T细胞与至少一种辐射模拟剂接触至少约50小时，至少约51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或至少约80小时。

在一个实施方案中，T细胞与至少一种辐射模拟剂接触约50小时，约51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或约80小时。

实际上，申请人已经证明，令人吃惊的是，即在细胞培养24小时之后并且总共持续约48小时，在模拟RILA测试的条件下，用至少一种辐射模拟剂接触T细胞，不足以再现电离辐射对T细胞的效应(特别是与根据RILA方法所获得的相同的CD8淋巴细胞中的凋亡水平，特别是当对培养24小时的细胞施加8Gy，并且在辐射后48小时观察凋亡时)。为了模拟电离辐射对T细胞的效应，申请人进一步出人意料地证明，更长的接触步骤，例如，如一段约50小时到约80小时的时间范围，允许重现电离辐射对T细胞的效应。具体而言，可以在细胞培养开始时加入至少一种辐射模拟剂，并在介质中维持至少50小时。有利的是，其维持至少60小时，或至少、或约72小时，或至少、或约75小时，或在约70至77小时之间。据推测，凋亡诱导是复杂的并且需要一些时间，这就是为什么需要将细胞暴露在辐射模拟剂中更长的时间，即使在细胞暴露在辐射模拟剂之后早期在细胞中出现了一些辐射的标记物(如，DNA断裂)。

在一个实施方案中，在约37℃、以及约5％的CO

在一个实施方案中，将T细胞添加到含有至少一种辐射模拟剂的细胞培养介质中。在另一个实施方案中，将所述至少一种辐射模拟剂添加到之前含有T细胞的培养介质中。

在一个实施方案中，本发明的体外方法用于模拟电离辐射对T淋巴细胞的效应，所述电离辐射的范围为约2格雷(Gy)至约10Gy，优选为约5至约9Gy，更优选为约6至约10Gy，例如，如，约6Gy、约8Gy或约10Gy的电离辐射。

本领域技术人员很容易理解，要使用的至少一种辐射模拟剂的剂量取决于要模拟的电离辐射剂量。

在一个实施方案中，所述剂量根据以下数学式确定：

其中

在一个实施方案中，

在一个实施方案中，所述至少一种辐射模拟剂的浓度范围为50μg/ml至约500μg/ml，优选为约100μg/ml至约300μg/ml，例如约100、125、150、175、200、225、250、275、或300μg/ml。

在一个实施方案中，所述至少一种辐射模拟剂是博莱霉素，所述博莱霉素的浓度范围从约50μg/ml至约500μg/ml，优选从约100μg/ml至约300μg/ml，例如，如约100、125、150、175、200、225、250、275、或300μg/ml。

在一个实施方案中，本发明的方法用于模拟6Gy辐射的效果，并且所述至少一种辐射模拟剂(优选为博莱霉素)的浓度范围为从约50μg/ml至约500μg/ml，优选为约100μg/ml至约300μg/ml，例如，如约100、125、150、175、200、225、250、275或300μg/ml。

在一个实施方案中，本发明的方法用于模拟8Gy辐射的效果，并且所述至少一种辐射模拟剂(优选为博莱霉素)的浓度范围为从约50μg/ml至约500μg/ml，优选为约100μg/ml至约300μg/ml，例如，如约100、125、150、175、200、225、250、275或300μg/ml。在一个实施方案中，本发明的方法用于模拟8Gy辐射的效果，并且所述至少一种辐射模拟剂(优选为博莱霉素)的浓度范围为约135至约160μg/mL。

在一个实施方案中，本发明的方法用于模拟10Gy辐射的效果，并且所述至少一种辐射模拟剂(优选为博莱霉素)的浓度范围为约50μg/ml至约500μg/ml，优选为约100μg/ml至约300μg/ml，例如，如约100、125、150、175、200、225、250、275、或300μg/ml。

在一个实施方案中，本发明的方法包括：

a)使T细胞与至少一种辐射模拟剂接触，以及

b)测量辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡。

在一个实施方案中，本发明的方法包括：

a)将含有T细胞的样本与至少一种辐射模拟剂接触，以及

b)在含有T细胞的样本中测量辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡。

在一个实施方案中，本发明的体外方法包括测量辐射模拟剂诱导的CD4和/或CD8T-淋巴细胞的凋亡。在一个实施方案中，本发明的方法包括测量辐射模拟剂-诱导的CD8 T-淋巴细胞凋亡。

在一个实施方案中，在接触步骤结束时，将T细胞转移到预先-标记的离心管中用于离心，例如，如在390g下离心5分钟。离心后，可以用荧光染料(fluorochrome)偶联的-抗-CD4和/或荧光染料偶联的-抗-CD8抗体来标记样本。

然后，在一个实施方案中，将裂解缓冲液添加到离心管，以便裂解任何非淋巴细胞(例如，如红细胞)。裂解缓冲液的一个示例是由Beckton Dickinson(美国)提供的基于氯化铵的裂解缓冲液。

在裂解后，根据本领域技术人员已知的通常方法，将试剂添加到试管中以评估淋巴细胞凋亡。

用于测量T-淋巴细胞(优选为CD8 T-淋巴细胞)凋亡的方法的示例包括，但不限于，FACS分析(例如，使用碘化丙啶和RNA酶A作为试剂)、膜联蛋白V的剂量、和半胱天冬酶(caspases)的剂量。优选通过FACS分析进行T淋巴细胞凋亡的评估。

在一个实施方案中，本发明的方法包括测量细胞中发生的凋亡特征，例如膜不对称性(例如，这可以通过磷脂酰丝氨酸外化来观察到)、膜通透性、线粒体代谢活性、半胱天冬酶激活和染色质凝聚。

因此，在一个实施方案中，本发明的凋亡测量步骤包括使用特定试剂来评估T细胞凋亡特征。这种试剂的示例包括、但不限于：碘化丙啶、7-AAD、荧光染料偶联-膜联蛋白、YO-PRO染料、PO-PRO染料、刃天青染料(Reazurin)、赫斯特染料(Hoechst)、荧光染料偶联-半胱天冬酶抗体和JC-1染料。优选地，本发明的方法使用碘化丙啶。

在一个实施方案中，本发明的方法包括在接触步骤之后测量凋亡细胞的百分比。

在一个实施方案中，以一式三份进行凋亡的测量。

在一个实施方案中，本发明的方法还包括在未与至少一种辐射模拟剂接触的对照样本中，测量凋亡T细胞百分比的步骤(“基础T细胞凋亡”)。在一个实施方案中，为了测量基础T细胞凋亡，除了这些细胞不与至少一种辐射模拟剂接触之外，将细胞保持在与测试样本完全相同的条件下(例如，介质、温度、CO

在一个实施方案中，本发明的体外方法允许测定受试者的个体辐射敏感性。

因此，在一个实施方案中，本发明的体外方法用于评估受试者在电离辐射后出现副作用的风险。

在一个实施方案中，本发明的方法旨在预测在电离辐射治疗期间以及在电离辐射治疗后约1、3、6、12、18、24、30或36个月期间发生副作用的风险。

在一个实施方案中，本发明的体外方法旨在预测发生急性副作用的风险，即，在电离辐射治疗期间发生的副作用、或在电离辐射治疗后小于约1周、2周、3周、或4周，或在电离辐射治疗后小于约1、2或3月的情况下发生的副作用。

在另一个实施方案中，本发明的体外方法旨在预测发生晚期副作用的风险，即，在电离辐射治疗后至少约3个月发生的副作用，例如，如在电离辐射治疗后约3个月至约6个月之间，在电离辐射治疗后约3个月至约12个月之间，在电离辐射治疗后约3个月至约18个月之间，在电离辐射治疗后约3个月至约2年之间，在电离辐射治疗后约3个月至约30个月之间，或在电离辐射治疗后约3个月至约3年之间。在一个实施方案中，晚期副作用发生在电离辐射治疗后约4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长，或在电离辐射治疗后2或3年或更长。

在一个实施方案中，以上列出的副作用是根据CTCAE(例如，v3.0 CTCAE、v4.0CTCAE、或v5.0 CTCAE)的至少2级副作用。在一个实施方案中，以上列出的副作用是根据CTCAE(例如，v3.0 CTCAE)的2级、3级、4级、或5级副作用，优选为2级、3级、或4级。

在一个实施方案中，本发明的方法是非侵入性的。

在一个实施方案中，本发明的方法包括将之前从受试者处获得的T细胞与至少一种辐射模拟剂接触。

在一个实施方案中，所述受试者是人类。

在一个实施方案中，所述受试者正在、曾经或将要接受电离辐射治疗。

在一个实施方案中，在电离辐射治疗开始之前从受试者获得T细胞或含有T细胞的样本。

在一个实施方案中，所述受试者被诊断患有肿瘤。在一个实施方案中，所述受试者被诊断患有恶性肿瘤。在另一个实施方案中，所述受试者被诊断患有非恶性(或良性肿瘤)。非恶性肿瘤的示例包括、但不限于痣、子宫肌瘤、赘生物(例如，脂肪瘤、软骨瘤、腺瘤、畸胎瘤、错构瘤等)。

在另一个实施方案中，所述受试者诊断患有可通过电离辐射治疗的非恶性疾病。可通过电离辐射治疗的非恶性疾病的示例包括、但不限于格雷夫斯病、跟骨骨刺(calcaneal spur)和瘢痕瘤。

在一个实施方案中，所述受试者被诊断患有癌症。癌症的示例包括、但不限于前列腺癌、乳腺癌、胃肠癌(例如，结肠癌、小肠癌或结直肠癌)、胃癌、胰腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、间皮瘤、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、贲门癌(cardiac cancer)、泌尿生殖道癌、肝癌、骨癌、神经系统癌(例如，脑癌)、妇科癌症(例如，卵巢癌)、睾丸癌、血液癌、喉癌、头颈癌、口腔癌、皮肤癌、和肾上腺癌。

在一个实施方案中，所述癌症是肿瘤，例如，实体肿瘤。在另一个实施方案中，所述癌症是一种血液癌症。在另一个实施方案中，所述癌症是一种血液系统恶性肿瘤。

乳腺癌的示例包括、但不限于原位导管癌、浸润性导管癌、乳腺管状癌、乳腺髓样癌、乳腺粘液癌、乳腺乳头状癌、乳腺筛状癌、浸润性小叶癌、炎性乳腺癌、小叶原位癌、男性乳腺癌、乳头派杰氏(Paget)病、乳腺叶状瘤以及复发和转移性乳腺癌。

胃肠道癌症的示例包括、但不限于：食道(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤(glucagonoma)、胃泌素瘤、类癌瘤、舒血管肠肽瘤(vipoma))、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波济氏(Karposi)肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)、结肠癌、结肠直肠癌和直肠癌。

肺癌的示例包括、但不限于腺癌(以前称为细支气管肺泡癌)、未分化小细胞癌、未分化大细胞癌、小细胞癌、大细胞癌、大细胞神经内分泌肿瘤、小细胞肺癌(SCLC)、未分化非小细胞肺癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤病错构瘤、肺沟瘤(Pancoast tumor)和类癌瘤。

间皮瘤的示例包括、但不限于胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、心包间皮瘤、终末期间皮瘤以及上皮样间皮瘤、肉瘤和双相间皮瘤。

膀胱癌的示例包括、但不限于移行性细胞膀胱癌(以前称为尿路上皮癌)、浸润性膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、非肌肉浸润性(浅表性或早期)膀胱癌、肉瘤、膀胱小细胞癌和继发性膀胱癌。

贲门癌的示例包括、但不限于肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤。

泌尿生殖道癌的示例包括但不限于：肾(腺癌、维恩(Wihn)瘤或[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺癌(腺癌、肉瘤)、和睾丸癌(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺癌、腺瘤样瘤、脂肪瘤)。

肝癌的示例包括但不限于肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、和血管瘤。

骨癌的示例包括、但不限于成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏(Ewing's)肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生性骨疣)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、类骨性骨瘤和巨细胞瘤。

神经系统癌症的示例包括、但不限于颅骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤、变形骨炎)、脑膜癌(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤)、和脑癌(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)。

妇科癌症的示例包括、但不限于：子宫癌(子宫内膜癌)、宫颈癌(子宫颈癌、癌前宫颈不典型增生)、卵巢癌(ovaries cancer)(卵巢癌(ovarian carcinoma)[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌]、肉芽肿样鞘细胞瘤、塞尔托利-莱氏(Sertoli-Leydig)细胞瘤、未分化胚细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴癌(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、和阴道癌(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤[胚胎性横纹肌肉瘤]、输卵管癌症(cancer)[癌(carcinoma)]。

血液癌症的示例包括、但不限于血癌(髓样白血病[急性和慢性]、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]。

皮肤癌的示例包括、但不限于恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤、痣性发育不良性痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤和瘢痕瘤。

肾上腺癌的示例包括、但不限于神经母细胞瘤。

在一个实施方案中，所述癌症是晚期癌症。这里使用的术语“晚期癌症”指的是一种已经扩散到身体其他部位的癌症，通常不能通过治疗得到治愈或控制。具体而言，局部晚期癌症是指从其起始处扩散到附近组织或淋巴结的癌症。在一个实施方案中，所述癌症是一种无法切除的癌症。这里使用的术语“无法切除的癌症”指的是一种不能通过手术切除的癌症。

在一个实施方案中，所述癌症是复发性癌症。这里使用的术语“复发性癌症”指的是已经复发(回来)的癌症。癌症可能又回到与原初(原发)肿瘤相同的地方，或者到身体的另一个地方。

在一个实施方案中，所述癌症是转移性癌症。本文使用的术语“转移性癌症”指的是一种癌症，其已经从最初开始的地方扩散到身体中的另一地方。由转移性癌细胞形成的肿瘤可称为转移性肿瘤或转移。转移性肿瘤含有与原初(原发)肿瘤中的细胞相似的细胞。

在一个实施方案中，计划对受试者进行电离辐射治疗，并且在开始电离辐射治疗之前实施本发明的方法。

本文使用的术语“电离辐射”指的是涉及使用辐射(例如，如X-射线(电子束或光子束)、伽马射线、或质子)来杀死或破坏癌或肿瘤细胞并阻止它们生长和繁殖的治疗。

在一个实施方案中，电离辐射涉及使用X-射线。

在一个实施方案中，所述副作用是在治疗区域(例如，如在用于治疗前列腺癌的骨盆区域中、或在用于治疗乳腺癌的乳房区域中)由电离辐射诱导的副作用。

在前列腺癌治疗期间可能诱导的电离辐射诱导的副作用的示例包括、但不限于泌尿生殖系统(例如，如泌尿的和生殖的毒性)、胃肠道和神经毒性。

在乳腺癌治疗期间可能诱导的由电离辐射诱导的副作用的示例包括、但不限于皮肤萎缩、毛细血管扩张、硬化(纤维化)、坏死或溃疡。在一个实施方案中，电离辐射-诱导的副作用是乳房晚期副作用，即在乳腺癌治疗期间诱导的副作用(例如，皮肤萎缩、毛细血管扩张、硬化(纤维化)、坏死、或溃疡)，并且发生在电离辐射治疗后至少约3个月(例如，如在电离辐射治疗后在约3个月至约6个月之间、在电离辐射治疗后在约3个月至约12个月之间、在电离辐射治疗后在约3个月至约18个月之间、在电离辐射治疗后约3个月至约2年之间、在电离辐射治疗后约3个月至约30个月之间、或在电离辐射治疗后约3个月至约3年之间，或在电离辐射治疗后约4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长，或在电离辐射治疗后2或3年或更长)。

在一个实施方案中，本发明的体外方法还包括将辐射模拟剂诱导的T细胞与参考辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡进行比较的步骤，从而确定受试者出现电离辐射诱导的副作用的风险是高还是低。

在一个实施方案中，参考辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡对应于在参考人群中测量的凋亡。在一个实施方案中，在参考人群中测量参考凋亡，所述参考人群包括使用电离辐射治疗并且在随访期间(例如，如在电离辐射期间和/或在电离辐射之后的随访期间，例如，如在电离辐射结束后的1个月、3、6、12、18、24、30或36个月)经历辐射-诱导副作用的患者(例如，癌症患者)。在另一个实施方案中，在参考人群中测量参考凋亡，所述参考人群包括使用电离辐射治疗的并且在随访期间(例如，如在电离辐射期间和/或在电离辐射之后的随访期间，例如，如在电离辐射结束后的1个月、3、6、12、18、24、30或36个月)没有经历电离辐射诱导的副作用的患者(例如，癌症患者)。

参考凋亡可以从人群研究中得出，包括但不限于，具有相似年龄范围的受试者、相同或相似种族的受试者、相似病史的受试者、相似电离辐射治疗的受试者等。

在一个实施方案中，使用算法和其他统计和结构分类的方法来构建参考凋亡。

在一个实施方案中，参考凋亡对应于在参考人群中测量的平均凋亡。在本发明的一个实施方案中，参考凋亡对应于在参考人群中测量的凋亡的中位数。

在一个实施方案中，本发明的方法是计算机化的(或计算机实现的)。

在一个实施方案中，本发明的方法包括确定辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡是否高于参考凋亡，还是低于或等于所述参考凋亡。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括测定为受试者测量的辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡可以位于的百分位数。根据该实施方案，在参考人群中测量的辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡值以分类到百分位数中，其中针对参考人群的所有受试者获得的辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡值根据其数值以升序排列。在本发明的一个实施方案中，所述百分位数是受试者的百分位数，即，每个百分位数包括相同数量的受试者。因此，第一个百分位数对应于最低辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡值的受试者，而最后一个百分位数对应的是最高辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡值的受试者。在一个实施方案中，当绘制三个百分位数时，每个百分位数被命名为三分位数。在另一个实施方案中，当绘制四个百分位数时，每个百分位数被命名为四分位数。在另一个实施方案中，当绘制五个百分位数时，每个百分位数被命名为五分位数。

本领域技术人员知道，如何根据在参考人群中获得的辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡值，来测定辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡值的参考凋亡或百分位数。

这种方法的非限制性示例包括绘制ROC曲线，以确定具有副作用的受试者相对于无副作用的受试者测量的辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡值(AUROC)的截止值，其使得Se和Sp最大化。

在一个实施方案中，测定辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡将有助于医生根据患者调整电离辐射治疗的剂量和顺序，以限制电离辐射诱导的副作用，并任选地通过用其他治疗方法取代电离辐射治疗来调整治疗。

在特定实施方案中，辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡用于为患者选择适当的治疗，例如适当的电离辐射方案。

本发明的另一目的是一种用于实现对患者的适应性患者护理(或治疗)的方法，其中所述方法包括：

-使用上述体外方法评估所述患者发展出电离辐射诱导的副作用的风险；

-根据患者发展出电离辐射诱导的副作用的风险实施适应性患者护理(或治疗)。

在一个实施方案中，患者具有发展出电离辐射诱导的副作用的高风险，因此适应性患者护理可以选自以下：降低电离辐射剂量方案、或者替代治疗，例如，如手术。

在一个实施方案中，患者没有或仅表现出发展出电离辐射-诱导的副作用的低风险，因此适应性患者护理可以选自增加电离辐射剂量方案。

因此，本发明的另一目的是用于实现本发明方法的计算机软件。

在一个实施方案中，本发明的体外方法由微处理器实施，所述微处理器包括配置为计算辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡的软件。

本发明的另一目的针对一种系统，所述系统包括机器-可读存储，例如计算机和/或计算器，以及配置为计算所述数学函数(特别是所述多变量Cox函数)的处理器。该系统可以专用于执行根据本发明的方法。

本发明的另一目的是用于实施本发明方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含如本发明所定义的用于测量辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡的试剂。

本发明的另一目的是用于实施本发明方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括：

-一种盒/容器和袋，其适合用于生物运输含有T细胞的样本(特别是血液样本)、以及任选的用于分离T细胞的试剂；以及

-一种试剂，其用于测量辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡。

因此，本发明的另一目的是一种试剂盒，其用于检测在受试者中使用本发明的方法发展出电离辐射-诱导的副作用的风险，其中所述试剂盒包括：

-一种盒/容器和袋，其适于生物运输含有T细胞的样本(特别是血液样本)，以及任选的用于分离T细胞的试剂；

-用于测定本发明定义的辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡的试剂。

通过“试剂盒”指的是任何制造商(例如，包装或容器)。所述试剂盒可以作为用于执行本发明的方法的单元来推广、分发或销售。此外，可以在容器中提供任何或所有试剂盒试剂以保护它们免受外部环境，例如在密封容器中。试剂盒还可以包含描述试剂盒及其使用方法的说明性材料。还提供了可用于各种目的的试剂盒。标签或说明性材料可以提供试剂盒内容的描述以及预期用途的说明。

在一个实施方案中，本发明中定义的用于确定辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡的试剂对应于以下所需的一些或全部特定试剂：

-在存在至少一种辐射模拟剂的情况下，运行如上所述的T细胞培养步骤，例如，如适合培养T细胞的培养介质(例如，如添加了20％FCS的RPMI)、以及所述辐射模拟剂(例如，如博莱霉素)；

-运行凋亡测量分析(例如，使用流式细胞仪)，例如，如碘化丙啶、荧光染料偶联-膜联蛋白、YO-PRO染料、PO-PRO染料、刃天青染料、赫斯特染料、荧光染料偶联半胱天冬酶。

在一个实施方案中，本发明的体外方法是一种用于评估患有乳腺癌的受试者的个体辐射敏感性的方法(优选用于测定发展出电离辐射-诱导的乳房晚期副作用的风险)，并且本发明的方法包括：

a)将之前从受试者获得的含有T细胞的样本与至少一种辐射模拟剂接触；

b)测量样本中辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡；

c)测定受试者中至少两个临床参数的水平，

d)任选地测量受试者中的至少一种生化标记物，以及

e)任选地在数学函数中组合：在步骤b)中测量的辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡、与在步骤c)中测定的所述至少两个临床参数、以及任选地在步骤d)中测量的至少一种生化标记物。

通过“临床参数”是指与受试者相关并与评估所述受试者中电离治疗-诱导的毒性风险增加相关的任何临床参数。临床参数的示例包括、但不限于年龄、乳房体积、辅助激素治疗、增强(补充辐射剂量)、结节辐射、和吸烟。优选地，所述在步骤c)中测量的至少两个临床参数包括吸烟习惯和辅助激素疗法。

在一个实施方案中，本发明的方法包括在步骤c)中测定受试者是否之前接受过或当前正在接受辅助激素疗法。如本文所使用的，术语“辅助激素疗法”指在手术、化疗和/或电离辐射治疗之后、或同时、或之前开始的用于降低癌症复发风险的治疗。

激素受体阳性的乳腺癌生长依赖称为雌激素和/或黄体酮的激素。辅助激素疗法允许降低体内这些激素的水平，或者阻断激素进入任何残留的癌细胞。

可用于乳腺癌治疗的辅助激素疗法的示例包括、但不限于他莫昔芬(tamoxifen)、芳香化酶抑制剂(Als)(例如，阿那曲唑(Arimidex)和来曲唑(Femara))、依西美坦(Aromasin)，以及通过手术或通过药物抑制卵巢，所述药物选自促性腺激素、黄体生成素、戈舍瑞林(goserelin)(Zoladex)和亮丙瑞林(Lupron)。

在一个实施方案中，本发明的方法包括在步骤(c)中测定受试者的吸烟习惯。

如本文所使用的，术语“测定受试者的吸烟习惯”是指测定受试者是吸烟受试者(每日吸烟者、间歇性吸烟者或非-每日吸烟者)、还是如下文所定义的非吸烟受试者。

“每日吸烟者”可被定义为目前在每天的基础上都在吸烟的受试者。“间歇性吸烟者”可以定义为并非每日吸烟的受试者(DiFranza等人，2007；Lindstrom，Isacsson，&Malmo肩颈研究小组(Shoulder-Neck Study Group)，2002)、或在前一个月吸烟1-15天的受试者(McCarthy，Zhou,&Hser,2001)。“非每日吸烟者”可以限定为这样的受试者：(i)至少每周(但不是每天)吸烟、或常少于一周一次；(ii)在一生中吸烟至少100支香烟，现已吸烟若干天；(iii)一生吸烟100支香烟以上，现已吸烟若干天，以及在过去30天内吸烟少于30支香烟；(iv)一生吸烟100支香烟以上，且在过去30天内吸烟若干天或1-2天；或(v)在一生中吸烟少于100支香烟且在过去30天内吸过烟(Gilpin,White,&Pierce,2005；Hassmiller等人,2003；Husten,McCarty,Giovino,Chrismon,&Zhu,1998；Leatherdale,Ahmed,Lovato,Manske,&Jolin,2007；McDermott等人,2007；Tong,Ong,Vittinghoff,&Perez-Stable,2006；Wortley,Husten,Trosclair,Chrismon,&Pederson,2003)。

“某天吸烟者”可以定义为在吸烟者的一生中曾经吸过100支香烟并且目前在某些日子吸烟的受试者(不是每天；CDC，1993；Hassmiler，Warner，Mendez，Levy，&Romano，2003)。

“从不每天吸烟”可定义为在6个月或更长时间中从未在每天吸烟的受试者(Gilpin等人，1997)。

在一个实施方案中，本发明的方法包括在步骤d)中测量至少一个生化标记物。在一个实施方案中，所述至少一个生化标记物选自：个体辐射敏感性的蛋白和个体辐射敏感性的基因。

在一个实施方案中，所述至少一个生化标记物是个体辐射敏感性的蛋白，优选选自：AK2(腺苷酸激酶2)、HSPA8(热休克同源蛋白71kDa，也称为HSC70)、ANX1(膜联蛋白1)、APEX1(DNA-(无嘌呤或无嘧啶位点)裂解酶)和IDH2(线粒体异柠檬酸脱氢酶2)、片段及其组合。

在一个实施方案中，所述至少一个生化标记物是以下的组合：个体辐射敏感性的至少两个蛋白、个体辐射敏感性的至少三个蛋白、个体辐射敏感性的至少四个蛋白、个体辐射敏感性的五个蛋白、优选选自AK2、HSPA8、ANX1、APEX1和IDH2。

如本文所使用的，“个体辐射敏感性的蛋白”是指其表达(在蛋白质或RNA水平上)指示受试者个体辐射敏感性的蛋白质。

因此，在一个实施方案中，在步骤(c)测量至少一个生化标记物对应于测量来自受试者的样本中个体辐射敏感性的至少一个蛋白的蛋白水平，或者测量来自受试者的样本中编码所述蛋白质的核酸。在一个实施方案中，在第一步中，从之前从受试者中获得的生物样本中分离蛋白质和/或核酸。因此，根据本发明的方法可以包括使用众所周知的生物化学方法提取、纯化和表征蛋白质或核酸。

可以通过本领域公知的方法来确定个体辐射敏感性的所述蛋白质的存在或水平。这些方法的示例包括、但不限于基于免疫检测的方法、基于蛋白印迹的方法、基于质谱的方法、基于层析的方法、或基于流式细胞术的方法、以及用于特定核酸检测的方法。用于在样本中测定蛋白质水平的体外方法的具体示例在本领域中是公知的，并且包括、但不限于免疫组织化学、多重方法(Luminex)、蛋白印迹、酶联免疫吸附分析(ELISA)、夹心ELISA、荧光连接免疫吸附分析(FLISA)、酶免疫分析(EIA)、辐射免疫分析(RIA)、流式细胞术(FACS)等。

在一个实施方案中，可以直接测定蛋白质的存在和表达水平，或者通过检测(以及优选定量)蛋白质特异性核酸，以及特定mRNA(即，评估蛋白质的转录水平)，在核酸水平上分析蛋白质的存在和表达水平。用于评估蛋白质转录水平的方法在现有技术中是公知的。这些方法的示例包括、但不限于RT-PCR、RT-qPCR、Northern Blot、杂交技术(例如，如使用微阵列)及其组合，包括、但不限于通过RT-PCR获得的扩增片段的杂交、测序(例如，如下一代DNA测序(NGS)或RNA-seq(也称为“全转录组鸟枪测序”(Whole Transcriptome ShotgunSequencing)))等。

在一个实施方案中，所述至少一个生化标记物是个体辐射敏感性的基因，优选选自TGFβ、SOD2、TNFα和XRCC1。

如本文所使用的，“个体辐射敏感性的基因”是指一种基因，其(在蛋白质或RNA水平上)表达指示受试者的个体辐射敏感性，或指一种基因，其包含指示受试者的个体辐射敏感性的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，或涉及纤维化途径和ROS管理的基因。

因此，在一个实施方案中，在步骤(c)测量的至少一个生化标记物对应于测量来自受试者的样本中个体辐射敏感性的至少一个基因的表达水平或测定SNP的存在。

可以通过本领域技术人员已知的通常方法来测定所述个体辐射敏感性基因的存在或表达水平。以上示出了此类方法的非限制性列表。

在一个实施方案中，用于测定个体辐射敏感性基因的存在或表达水平的体外方法公开在如Azria等人，2008中，以及包括淋巴细胞分离、DNA提取和扩增，以及变性高效液相色谱、或使用转基因组WAVE高灵敏核酸片段分析系统(Transgenomic WAVE HighSensitivity Nuclei Acid Fragment Analysis System)的Surveyor核酸酶分析。

在一个实施方案中，本发明的体外方法包括在步骤(c)测量至少一个个体辐射敏感性的蛋白和至少一个个体辐射敏感性的基因。

在一个实施方案中，本发明的体外方法包括：

a)用至少一种辐射模拟剂接触之前从受试者获得的含有T细胞的样本；

b)测量样本中辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡；

c)测定受试者是否使用辅助激素疗法治疗，并测定受试者的吸烟习惯，

d)任选地测量受试者的至少一个生化标记物，以及

e)任选地在数学函数中组合：在步骤b)中测量的辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡、与在步骤c)中测定的所述至少两个临床参数、以及任选地在步骤d)中测量的至少一个生化标记物。

在一个实施方案中，本发明的方法在步骤e)包括在数学函数中组合以下的步骤：在步骤(b)中测量的辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡、在步骤c)中测定的至少两个临床参数(优选存在或不存在辅助激素疗法、和吸烟习惯)、以及任选的在步骤d)中测量的至少一个生化参数，从而获得终值(end-value)。

在一个实施方案中，所述数学函数是多变量分析，其使用二元逻辑(Logistic)回归、多重线性回归或任何时间依赖的回归。

在一个实施方案中，所述数学函数是Cox比例风险(hazard)回归模型。

在一个实施方案中，对于上述列举的且可能存在或不存在的临床参数，对于所述参数的存在，在数学函数中给定值＝1(优选在多变量Cox函数中)，而对于其不存在，在数学函数中给定值＝0(优选在多变量Cox函数中)。

例如，在一个实施方案中，在步骤(c)中，如果受试者接受辅助激素疗法治疗，则值“1”是受到影响的(affected)。在一个实施方案中，在步骤(c)中，如果受试者未接受辅助激素疗法治疗，则对受试者而言值“0”是受到影响的。

在一个实施方案中，对于临床参数“吸烟”，吸烟患者一致地定义为每日吸烟者、间歇性吸烟者或非每日吸烟者(并且在数学函数中给定值＝1，优选在多变量Cox函数中)，而不吸烟患者定义为某天吸烟者或从不每天吸烟者(并且在数学函数中给定值＝0，优选在多变量Cox函数中)。

在一个实施方案中，对于临床参数“年龄”，中位年龄是55岁，以用于定义55岁或以下的患者(在数学函数中给定值＝0，优选在多变量Cox函数中)和55岁以上的患者(在数学函数中给定值＝1，优选在多变量Cox函数中)。

在另一个实施方案中，对于连续数据(特别是对于在步骤d)中任选地测量的生化标记物)和在步骤b)中测量的辐射模拟剂诱导的T细胞凋亡)，在数学函数中给出该参数的精确值，优选在多变量Cox函数中。

在一个实施方案中，本发明的数学函数是二元逻辑回归、多元线性回归或任何依赖时间的回归。

在一个实施方案中，通过在使用多变量分析建立的回归公式中通过组合以下来获得终值：测量辐射模拟剂诱导的T淋巴细胞凋亡、至少两个临床参数(优选辅助激素疗法和吸烟习惯)、以及任选的至少一个生化标记物。

在一个实施方案中，所述公式表示为：

A+B1*(辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡)+B2*(第一临床参数，优选辅助激素疗法)+B3*(第二临床参数，优选吸烟习惯)+...+Bn*((n-1)临床参数或生化标记物)，其中A、B1、B2、…、Bn为预定系数。

在另一个实施方案中，所述公式表示为：

C+[D1*LN(辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡)]+[D2*LN(第一临床参数，优选辅助激素疗法)]+[D3*LN(第二临床参数，优选吸烟习惯)]+...+[Dn*LN((n-1)临床参数或生化标记物)]，其中C、D1、D2、…Dn是预定系数。

在另一个实施方案中，所述公式表示为：

E+exp[F1*(辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡)]+[F2*(第一临床参数，优选辅助激素疗法)]+[F3*(第二临床参数，优选吸烟习惯)]+...+[Fn*((n-1)临床参数、或生化标物)]，其中E、F1、F2、…、Fn为预定系数。

在一个实施方案中，回归是多变量Cox回归。

在一个实施方案中，所述回归是时间依赖的，优选地是时间依赖的多变量回归。

在一个实施方案中，所述回归是多变量时间相关模型，优选为Cox比例风险回归模型。

在本发明的一个实施方案中，在Cox回归中组合的独立参数是辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡、辅助激素疗法、吸烟习惯以及任选的至少一个生化标记物。在本发明的一个实施方案中，在Cox回归中组合的独立参数是辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡、辅助激素疗法、和吸烟习惯。

当标记物与乳房晚期副作用的观察呈负相关时，多变量Cox函数通常可以通过将(在多变量Cox回归中单独确定的)每个参数的相关权重与负信号组合而获得。

在一个实施方案中，为了定义本发明的多变量Cox模型(即，建模)，在研究的临床随访期间，基于对电离辐射诱导的副作用(优选如上所述的乳房晚期副作用)的检测，对乳腺癌患者进行分类。

在一个实施方案中，所述建模可以基于接受电离辐射治疗的乳腺癌患者的人群(例如，多中心人群)(其可以称为“参考人群”)。因此，建立该模型的步骤可包括：

-测量人群中所有受试者中辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡的百分比；

-确定生化标记物(例如，个体辐射敏感性的蛋白质和/或基因)和与评估受试者电离辐射毒性的风险增加相关的临床参数；

-在多中心临床试验中，使用所述鉴定的生化标记物和临床参数用于鉴定作为电离辐射-诱导的副作用(特别是乳房晚期副作用)的预测因素的相关变量，即，所述变量指示发展出电离辐射-诱导的副作用(特别是乳房晚期副作用)的特异性风险；

-在大型多中心临床试验中应用这些变量，以鉴定辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡、生化标记物(例如，个体辐射敏感性的蛋白质和/或基因)和临床参数的组合对发展电离辐射-诱导的副作用(特别是乳房晚期副作用)的预测作用。

通过“多中心研究试验”，是指在一个以上的医学中心或诊所进行的临床试验。

在一个实施方案中，多变量Cox模型是：

风险(hazard)(经历电离辐射-诱导的副作用)＝基线风险*exp((β1*辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡)+β2*(第一临床参数，优选是辅助激素疗法)+β3*(第二临床参数，优选是吸烟习惯)+...βn*(n大于或等于3的临床参数(n-1)或生化标记物)，当所有协变量均为零时，其中基线风险对应于经历该事件(电离辐射-诱导的副作用)的风险。

在另一个实施方案中，多变量Cox模型是：

风险(经历电离辐射-诱导的副作用)＝基线风险*exp((β1*辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡)+β2*(辅助激素疗法)+β3*(吸烟习惯)，其中当所有协变量均为零时，基线风险对应于经历该事件(电离辐射-诱导的副作用)的风险。

上述方程式的右侧详细说明这个模型的基础功能。方程式的左边是可以用诺模图(nomogram)表示的预测概率，并传递给乳腺癌患者。正如在任何统计报告中一样，必须估计每个协变量的β系数，并将其转换为效果量度的风险比。为了获得相关事件(经历电离辐射-诱导的副作用)的预测概率，通过使用患者的个体特征和模型导出的β系数来计算上述方程式。

在一个实施方案中，所述基线风险是与发展出电离辐射-诱导的副作用的基础风险相对应的常量，没有任何协变量。在根据Cox回归模型进行建模期间，如上所述可以从来自参考人群的数据来确定该基线风险。

从如上所述，临床参数“1”至“n”可以选自以下：如上所公开的临床参数、或疾病参数、或电离辐射治疗参数。在一个实施方案中，所述临床参数选自以下：年龄、乳房体积、辅助激素疗法、增强(补充辐射剂量)、结节辐射、和吸烟。在一个实施方案中，所述临床参数包括辅助激素疗法和吸烟习惯。

在一个实施方案中，风险(经历电离辐射-诱导的副作用)＝基线风险*exp((β1*辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡)+β2*(第一临床参数，优选辅助激素疗法)+β3*(第二临床参数，优选吸烟习惯)+...βn*(n大于或等于3的临床参数(n-1)或生化标记物)，其中基线风险对应于当所有协变量均为零时经历事件(电离辐射诱导的副作用，优选是乳房晚期副作用)的风险。

在一个实施方案中，如果上述公式中的给定参数不存在，则为该给定参数输入的值为0，如果存在所述参数(例如，如对于辅助激素疗法存在或不存在)，则为该给定参数输入的值为1。

在另一个实施方案中，在上述公式中给定参数输入的值对应于所述参数的测量值(例如，如对于辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡)。

在一个实施方案中，风险(经历电离辐射-诱导的副作用)＝基线风险*exp(β1*辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡)+β2*(辅助激素疗法[0＝否；1＝是])+，β3*(吸烟[0＝否；1＝是])，其中当所有协变量为零时，基线风险对应于经历该事件(电离辐射诱导的副作用，优选是乳房晚期副作用)的风险。

在一个实施方案中，对于乳腺癌受试者，风险(经历电离辐射-诱导的副作用)也可以被命名为发展出电离辐射诱导的副作用的风险。

在一个实施方案中，基于该多变量Cox函数，本领域技术人员将能够向所述多变量Cox模型引入任何额外的相关生化标记物和/或临床参数。

在一个实施方案中，在本发明的函数中，优选在多变量Cox回归中，用于不同标记物所得值的不同系数可以通过在患者的参考人群中的统计分析来计算。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括测量终值，其中所述终值指示受试者发展出如上所述电离辐射-诱导的副作用的风险。在一个实施方案中，考虑基本风险(基线特征)和协变量(在数学函数中组合的生化标记物和临床参数)来估计所述风险。

因此，在一个实施方案中，该“终值(end-value)”是对每个受试者发生电离辐射-诱导的副作用的预测概率。

在一个实施方案中，根据为受试者获得的终值，在电离辐射治疗之后的随访期间，例如，如在电离辐射治疗结束后的3个月或6、12、18、24、30或36个月，有可能为所述受试者预测发展出电离辐射-诱导的副作用的风险。例如，在一个实施方案中，92％的终值意味着在电离辐射期间和/或在电离辐射之后的随访期间，例如，如在电离辐射结束后的1个月、3、6、12、18、24、30或36个月期间，具有8％的风险发展出电离辐射-诱导的副作用。

在一个实施方案中，本发明的方法包括将为受试者获得的终值与参考终值进行比较。

在一个实施方案中，参考终值对应于在乳腺癌患者的参考人群中测量的终值。在一个实施方案中，在包括乳腺癌患者的参考人群中测量所述参考终值，所述乳腺癌患者接受电离辐射治疗并且在随访期间(例如，如在电离辐射期间和/或在电离辐射之后的随访期间，例如在电离辐射结束后的1个月、3、6、12、18、24、30或36个月期间)经历过电离辐射诱导的副作用。在另一个实施方案中，在包括乳腺癌患者的参考人群中测量参考终值，这些乳腺癌患者接受电离辐射治疗，并且在随访期间(例如，在电离辐射期间和/或在电离辐射之后的随访期间，例如，在电离辐射结束后的1个月、3、6、12、18、24、30或36个月期间)没有经历过电离辐射诱导的副作用。

可以从人群研究中得出参考终值，包括但不限于，具有相似年龄范围的受试者、相同或相似种族的受试者、相似的乳腺癌病史、相似的电离辐射治疗等。

在一个实施方案中，使用统计和结构分类的算法和其他方法来构建参考值。

在一个实施方案中，参考终值对应于在参考人群中测量的平均终值。在本发明的一个实施方案中，参考终值对应于在参考人群中测量的中位数终值。

在一个实施方案中，本发明的方法是计算机化的(或计算机实现的)。

在一个实施方案中，本发明的方法包括确定终值是高于参考终值，还是低于或等于所述参考终值。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括确定其中为受试者测量的终值可以定位的百分位数。根据该实施方案，在参考人群中测量的终值以分类至百分位数，其中针对参考人群的所有受试者获得的终值按照它们的数值以升序排列。在本发明的一个实施方案中，所述百分位数是受试者的百分位数，即，每个百分位数包括相同数量的受试者。因此，第一个百分位数对应于最低终值的受试者，而最后一个百分位数对应于最高终值的受试者。在一个实施方案中，当绘制三个百分位数时，每个百分位数命名为三分位数。在另一个实施方案中，当绘制四个百分位数时，每个百分位数被命名为四分位数。在另一个实施方案中，当绘制五个百分位数时，每个百分位数命名为五分位数。

本领域技术人员知道如何从在参考人群中获得的辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡值确定参考终值。这种方法的非限制性示例包括绘制ROC曲线以确定为具有副作用的受试者相对于没有副作用的受试者所测量的终值的截止值(AUROC)，其使得Se和Sp最大化。

在一个实施方案中，测定乳腺癌患者的终值将帮助医生为患者调整电离辐射治疗的剂量和顺序，以限制乳房晚期副作用，并任选地通过用其他治疗性方法取代电离辐射治疗来调整治疗。

在特定实施方案中，终值(例如，用多变量Cox函数获得)用于为患者选择适当的治疗，例如适当的电离辐射方案，或者用于在乳房切除术或保乳手术之间选择。

因此，可以根据风险水平讨论辐射量和处方剂量。在一个实施方案中，如果终值高于参考值，则存在在电离辐射治疗之后发展出电离辐射副作用(优选为乳房晚期副作用)的风险。在一个实施方案中，参考值的范围从约85到约95，例如，如约为85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95。在电离辐射副作用的风险高(优选是乳房晚期副作用)和最佳临床收益的复发风险低的情况下，不加强电离辐射治疗、不进行结节辐射、且每部分剂量低于2.5Gy将是不同的治疗可能性。

在一个实施方案中，该终值用于为乳腺癌患者选择适当的治疗，例如适当的电离辐射治疗剂量方案，其中：

-如果患者出现发展出乳房晚期副作用的风险，则将减少适当的电离辐射剂量方案(例如，如通过给与(delivery)部分乳腺超分割(hypofractionate)治疗)；

-如果患者出现发展出乳房晚期副作用的低风险或无风险，则可以增加适当的电离辐射剂量方案(例如，如通过给与超分割治疗(例如，5或16个分数(fraction)，其是此类治疗中常见的分数))。

在一个实施方案中，具有发展出乳房晚期副作用风险的患者从大约5％到大约15％(即，终值从大约85到约95％)，例如，如具有约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15％(即，终值分别为约为95、94、93、92、91、90、89、88、87、86或85％)风险的患者，这样的乳腺癌患者视为(高)风险患者。

在一个实施方案中，具有发展出乳房晚期副作用风险的患者小于约5％(即，终值高于约95％)，例如，如具有约1、2、3、4或5％(即，终值分别高于约99、98、97、96或95％)风险的患者，这样的乳腺癌患者视为低风险患者。

在另一个实施方案中，在保乳手术或乳房切除后立即进行乳房重建的决定中使用该终值。在一个实施方案中，如果所述终值范围从约85到约95％，例如，如约95、94、93、92、91、90、89、88、87、86或85％，将考虑在保乳手术或乳房切除之后立即进行乳房重建。

本发明的另一目的是一种对乳腺癌患者实施适应性患者护理的方法，其中所述方法包括：

-使用上述体外方法评估所述患者发展出电离辐射诱导的副作用的风险；

-根据患者发展出的电离辐射-诱导的副作用的风险，实施适应性患者护理。

在一个实施方案中，患者是高风险患者，并且适应性患者护理可以选自以下：减少电离辐射剂量方案、乳房切除、不进行增强电离辐射治疗、不进行结节辐射以及每部分剂量小于2.5Gy。

在一个实施方案中，患者是低风险患者，以及适应性患者护理可以选自以下：增加电离辐射剂量方案(例如，如通过给与超分割治疗)，以及保乳手术、或乳房切除后立即进行乳房重建。

因此，本发明的另一目的是用于实施本发明方法的计算机软件。

在一个实施方案中，本发明的体外方法由微处理器实施，所述微处理器包括软件，所述软件被配置成计算以下的组合所得的终值：测量辐射模拟剂诱导的T淋巴细胞凋亡、和至少两个临床参数(优选是辅助激素疗法和吸烟习惯)、以及任选的至少一个生化标记物。

在一个实施方案中，本发明的体外方法由微处理器实施，所述微处理器包括软件，所述软件被配置成计算以下组合所得的终值：测量辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡、和至少两个临床参数(优选是辅助激素疗法和吸烟习惯)、以及任选的至少一个生化标记物。

本发明的另一目的针对一种系统，所述系统包括机器-可读存储，例如计算机和/或计算器，以及配置为计算所述数学函数(特别是所述多变量Cox函数)的处理器。该系统可以专用于执行根据本发明的方法。

在特定实施方案中，所述系统还包括用于实施软件的模块以用于以下：构建诺模图(对于每个参数(包括主效应、相互作用和分段线性效应)在0-100之间的线性预测因子)、以及计算受试者发展出电离辐射-诱导的副作用风险(对应于终值)。

在一个实施方案中，本发明的体外方法因此包括：

-对于参考人群的所有受试者，使T细胞接触至少辐射模拟剂，以及测量辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡；

-任选地测量参考人群的所有受试者的至少一个生化标记物；

-对于参考人群的所有受试者，测量至少两个临床参数，优选是辅助激素疗法和吸烟；

-Cox回归模型下的单变量分析(对每个参数逐一估计，以选出p-值≤0.2的所有显著参数)；

-Cox回归模型下的多变量分析(估算包括单变量分析的所有选择的参数+添加任选的临床相关的非-显著参数)；

-选择显著参数和/或临床相关参数以获得最终模型，提取其线性预测因子以估计发展出电离辐射-诱导副作用的风险(概率)；将线性预测因子集成到软件中；

-根据Lasonos等人2008，执行软件以建立诺模图(每个参数的线性预测因子在0-100之间，所述参数包括主效应、相互作用和分段线性效应)。因此，这代表着通过根据每个单独的参数计算每个乳腺癌患者在电离辐射后的终值，给出发展出电离辐射-诱导的副作用的风险(概率)。

因此，在一个实施方案中，本发明包括在诺模图上可视化乳腺癌受试者获得的终值。诺模图是一种普及的可视化绘图以显示事件发生的预测概率，以用于决策支持。

在一个实施方案中，为了在拟合Cox多变量模型之后构建该诺模图，根据Lasonos等人(2008)描述的方法获得线性预测因子。因此，本发明的另一目的是一种实现所述数学组合(优选，所述多变量Cox函数)的用户友好的界面，即诺模图、计算机或计算器，以帮助医生解释在电离辐射治疗期间和/或之后发展出电离辐射-诱导的副作用(例如，乳房晚期副作用)的风险。因此，本发明包含实现本发明的数学函数的诺模图(优选为根据本发明的多变量Cox函数)。

如本文所使用的，“诺模图”指的是来自本文所述的数学函数的预测公式的图形表示，例如，如允许估计在受试者中发展出电离辐射-诱导副作用的风险的多变量Cox模型。在一个实施方案中，所述诺模图基于一个或多个容易获得的参数，包括但不限于辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡、辅助激素疗法、和吸烟。

诺模图的用处在于，它在用户友好的图形界面中将预测的概率映射为从0到100的范围内的分。各种协变量累积的总分对应于患者的预测风险。

根据一个实施方案，本发明的方法包括将在步骤b)、在步骤c)以及任选地在步骤d)获得的数据实施到计算机或计算器，其将计算数学组合(优选是多变量Cox回归)以及发展出电离辐射诱导副作用的风险。因此，通过医生获得的数据是更加容易可判读的(interpretable)，并将允许在决定适应性患者护理的过程中改进。

本发明的另一目的是一种用于实施本发明的方法的试剂盒，特别是用于收集受试者的数据，以进一步用于使用本发明的方法检测乳腺癌受试者中发展出电离辐射-诱导副作用的风险，其中该试剂盒包括：

-一种盒/容器和袋，其适用于生物运输含有T细胞的样本(特别是血液样本)，以及任选的用于分离T细胞的试剂；

-用于测量辐射模拟剂-诱导的T细胞凋亡的试剂，以及任选的本文限定的至少一种生化标记物；以及

-由患者和/或护士和/或医生完成的表格，这些表格是为实施本发明的方法特别设计和必需的。

例如，表格可包含特定问题，其旨在收集运行预测分析所必须的信息，例如年龄、患者是否已经或将接受辅助治疗(例如，化疗或激素疗法)、吸烟习惯以及回收含有T细胞样本的日期和时间。

因此，本发明的另一目的是一种在使用本发明的方法的受试者中，用于检测发展出电离辐射-诱导的副作用(优选是乳房晚期副作用)的风险的试剂盒，其中所述试剂盒包括：

-试剂，如本发明定义的用于测定辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡的试剂；

-任选地装置(means)，其用于收集关于根据本发明的至少两个临床参数(优选辅助激素疗法和吸烟习惯)的信息，例如调查；

-任选地装置，其用于测量根据本发明的至少一个生化标记物；以及

-任选地，根据本发明的诺模图。

在一个实施方案中，本发明定义的用于测定辐射模拟剂-诱导的T淋巴细胞凋亡的试剂对应于以下所需的一些或全部特定试剂：

-在至少一种辐射模拟剂(例如，如适合于培养T细胞的培养介质)和所述辐射模拟剂(例如，如博莱霉素)存在的情况下，运行如上所述的T细胞培养步骤；

-运行凋亡测量分析(例如，使用流式细胞仪)，例如，如碘化丙啶、荧光染料偶联-膜联蛋白、YO-PRO染料、PO-PRO染料、刃天青染料、赫斯特染料、荧光染料偶联-半胱天冬酶。

在一个实施方案中，根据本发明的用于测定至少一个生化标记物值的试剂，对应于在独立实验室中运行蛋白质和/或基因生物敏感性测量分析所需的一些或全部特定试剂。

在一个实施方案中，用于收集根据本发明的至少两个临床参数的信息的方式，对应于待由患者和/或护士和/或医生填写的特定表格，这些表格是特定设计的，并且是运行本发明的方法和诺模图分析必需的。在优选实施方案中，这些表格可以包含旨在收集运行预测分析所需信息的特定问题，诸如患者是否已经接受或将接受辅助治疗(例如，化疗、激素疗法)、以及吸烟习惯。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明。

材料和方法

血液样本

血液样本购自Etablissement

培养条件

在添加有20％胎牛血清(FCS)(EuroBio，法国)具有glutamax(Fisher Science，法国)的RPMI-1640中培养血细胞。实验过程中，细胞保持在37℃和5％的CO

产品

按制造商说明，将产品博莱霉素(EuroMedex)以50mg/mL溶解在无菌MilliQ水中，并储存在-80℃。

辐射-诱导CD8 T-淋巴细胞凋亡(RILA)程序

该操作方案改编自Ozsahin等人(Ozsahin，Crompton等人，2005)的研究。

在放射治疗(RT)之前，对每个患者在5-mL肝素化试管中采集一份血液样本。采血20或24小时后，将200μl的血液等分至含有2ml的RPMI-20％FCS的6孔板中。所有试验均以0和8Gy一式三份进行。在血细胞培养24小时后，使用Xenx辐射平台(XStrahl，UK)提供离体辐射。然后，将板立即在37℃(5％CO

然后将样本以300g离心5分钟。将沉淀重悬在含有10μl抗人CD8-FITC抗体的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中(Becton Dickinson，美国)，室温下孵育20分钟。然后，加入4ml(在水中1：10稀释的)裂解缓冲液(Becton Dickinson，美国)来裂解红血细胞。室温孵育另外20分钟时间后，将样本以300g离心5分钟后，用3ml的PBS洗涤沉淀。将沉淀悬浮在200μl的PBS中，所述PBS含有25μg/ml的碘化丙啶(Sigma，法国)和5μl的10mg/ml的RNA酶A(Qiagen，法国)。在接下来的几个小时内，使用CytoFlex(Beckman Coulter，美国)通过流式细胞术对样本进行分析。

博莱霉素-诱导CD8 T-淋巴细胞凋亡的方法

对血液样本的辐射和治疗

将不同辐射剂量(0Gy、6Gy、8Gy和10Gy)和不同博莱霉素浓度(50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL)施加至等分的相同血液样本中。

如前所述进行辐射和培养。在辐射后48小时使用如前所述的相同操作方案进行染色。

对于博莱霉素治疗，测试了2种方案：

-血细胞培养24小时后治疗：

在血液采集后约24小时，将200μL血液等分至含有2mL的RPMI-20％FCS的6孔板内。在血细胞培养后24小时，通过直接将博莱霉素加入到孔中，进行不同浓度的博莱霉素处理。如上所述，在博莱霉素处理后48小时(因此，博莱霉素与细胞接触少于50小时后)，进行染色检测凋亡。

-血细胞培养过程中治疗：

在血液采集后约24小时，将200μL血液等分至含有2mL的RPMI-20％FCS-博来霉素的6孔板内。在细胞培养开始前，新鲜制备含有不同浓度博莱霉素的细胞培养介质。在博莱霉素与血细胞孵育至少50小时(通常多于约60小时，特别是65至75小时之间)后，如上所述对样本进行染色以进行流式细胞术分析。

统计分析

采用固定截距、固定斜率和随机截距的两种混合线性模型，根据化合物或以格雷(Gray)计的辐射剂量，对RILA比率演化(evolution)进行建模。

使用R软件(版本3.3.1)进行分析。

结果

长期博莱霉素治疗诱导的T淋巴细胞凋亡率与8Gy辐射相似

本研究的目的是确定博莱霉素的使用条件，以获得与8Gy辐射相似的T淋巴细胞凋亡率。

在相同血样上测试以下两种处理条件：在细胞培养24小时后或从细胞培养开始后，用几种博莱霉素浓度处理血细胞。用8Gy辐射血液样本进行对照实验。

表1中描述的结果代表所有实验。用浓度在50μg/mL到500μg/mL之间的博莱霉素处理血液样本。当在血细胞培养24h后进行处理时，不加任何博莱霉素浓度，作用时间小于50h，即可诱导8Gy辐射后观察到的凋亡率。

相反，当在血细胞培养开始时施加处理时，在博莱霉素浓度低于300μg/mL的情况下实现辐射后获得的凋亡率。这些结果表明，处理必须进行持续至少50小时(例如，如从细胞培养开始的处理)，才能获得与8Gy辐射相似的T淋巴细胞凋亡率。在不愿拘泥于任何理论的情况下，揭示博莱霉素可需要更多的时间才能诱导与8Gy辐射相同的T淋巴细胞凋亡率。需要注意的是，博莱霉素与细胞接触的持续时间可能随博莱霉素浓度的不同而不同，但应该足够长(即，超过50小时)，以便能够重现RILA中观察到的凋亡水平。

然而，优选使用低浓度的博莱霉素，因为其是昂贵的化合物。

表1：在细胞培养期间或24小时后对相同血液样本进行博莱霉素处理的比较。

该表清楚地表明，从细胞培养开始将细胞暴露至博莱霉素(从而延长了细胞暴露至该化合物)，导致T淋巴细胞的凋亡水平高于从培养开始后24小时才添加博莱霉素的凋亡水平。可以看出，无论博莱霉素的浓度是多少，暴露时间的延长导致凋亡的大幅提高。

确定博莱霉素处理与辐射之间的相关性

为了表征博莱霉素处理与辐射之间的相关性，对相同血液样本施加不同浓度的博莱霉素和不同的辐射剂量。根据辐射剂量(Gy)和博莱霉素浓度，T淋巴细胞凋亡率的响应方式呈线性关系(数据未显示)。

根据辐射(Gy)的凋亡率模型：

根据化合物(μg/mL)的凋亡率模型：

上述两个模型的组合允许确定待应用于模拟辐射(x

通过对10名供体进行RILA测量，可以估计出该数学公式的不同参数。由该公式得到的参数可以在给定的暴露持续时间和博莱霉素浓度下进行计算。

用上述公开的等式测定的博莱霉素浓度在40份血液样本上得到验证。对于每个血液样本，在8Gy辐射(如上披露的RILA程序)之后、或通过135-160μg/mL的博莱霉素处理后，获得T淋巴细胞凋亡率，暴露的持续时间在65至75小时(约70-72小时)之间。

对于相同供体，通过计算变异系数(CV)，比较两种处理获得的凋亡率。这两个条件之间的CV是根据以下公式计算的：CV＝(标准偏差/平均凋亡)×100。

这40名供体的平均CV为6.5％。该百分比低于10％，这代表了RILA测定的实验变异。

但这些结果后来在更多(多于100个)或供体上重现。还需要注意的是，用于这些试验的博莱霉素批次与用于确定暴露持续时间的上述测定的批次不同。根据批次的不同，可以观察到有效浓度的变化，因此必须验证使用的任何新批次博莱霉素的有效浓度，以便调整浓度。然而，暴露的持续时间仍必须保持超过50小时。

因此，这些结果表明，用博莱霉素作为辐射模拟剂可以重现辐射的凋亡后果，并且辐射模拟剂的接触时间应超过50小时。