表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白的重组腺病毒及其用途

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白的重组腺病毒及其用途。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为全球重要的传染病，是危害人类健康的第一杀手。卡介苗(BCG)是目前预防结核病的唯一疫苗，但其只对儿童结核病有保护效果，而对成人结核病没有保护效果，研制新型结核病疫苗是全球重要的亟待解决的公共卫生问题。以腺病毒作为载体表达结核分枝杆菌抗原，目前已被广泛用于结核病新型疫苗的研究。然而，当前研究的以腺病毒为载体的新型疫苗中，表达的结核分枝杆菌抗原较为单一，针对结核分枝杆菌的免疫保护力不够强，尤其是针对机体内结核分枝杆菌的休眠菌，缺乏特异性识别，不能产生免疫保护效果。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白的重组腺病毒及其用途。

本发明的目的之一是提供结核分枝杆菌多阶段抗原融合基因，所述融合基因为Ag85B-ESAT-6和Rv2031c-Rv2626c，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示。

本发明的目的之二是提供结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白，所述融合蛋白包括Ag85B-ESAT-6和Rv2031c-Rv2626c，由所述融合基因编码，所述Ag85B-ESAT-6和Rv2031c-Rv2626c的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示。

本发明的目的之三是提供一种重组载体，所述的重组载体为包括所述融合基因以及EF1启动子的pAdTrack-CMV载体，命名为pAdTrack-AE-EF1-R2载体，所述EF1启动子序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步的，所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：

将Ag85B-ESAT-6融合基因插入pAdTrack-CMV载体KpnI和PvuI位点之间，将EF1启动子插入同一个pAdTrack-CMV载体的PvuI和AluI位点之间，将Rv2031c-Rv2626c融合基因插入同一个pAdTrack-CMV载体AluI和XhoI位点之间，后将pAdTrack-CMV载体转化至DH5α感受态细胞，经抗性筛选、平板挑菌和阳性克隆鉴定，得到重组载体。

本发明的目的之四是提供一种表达所述融合基因的重组腺病毒。

进一步的，所述重组腺病毒的制备方法包括如下步骤：

将所述重组载体和骨架质粒pAdeasy-1共转染宿主细胞，培养并收获、纯化从所述细胞中释放的重组腺病毒。

进一步的，所述宿主细胞为HEK293细胞。

更进一步的，将所述重组腺病毒进行扩大培养，并对培养产物进行纯化。

本发明的目的之五是提供所述重组腺病毒在制备用于预防结核分枝杆菌感染和预防结核病的疫苗中的用途。进一步的，所述重组腺病毒被制备为滴鼻剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明构建的重组腺病毒中，同时表达四种结核分枝杆菌抗原，包括2种结核分枝杆菌增殖期的优势抗原，2种结核分枝杆菌休眠期的优势抗原，不仅针对结核分枝杆菌的特异性更强，而且诱发的保护性免疫将更加全面，既能够针对增殖期的结核分枝杆菌，也能够针对休眠期的结核分枝杆菌，将产生更好的抗结核分枝杆菌的免疫保护效果。

附图说明

图1为实施例1的pAdTrack-CMV图谱信息。

图2为实施例2重组腺病毒表达目的融合基因Ag85B-ESAT-6(A)和Rv2031c-Rv2626c(B)的基因表达水平。

图3为实施例2重组腺病毒在巨噬细胞中目的蛋白表达的间接免疫荧光。

图4为实施例3小鼠肺泡灌洗液中sIgA的含量；

图5为实施例3小鼠外周血清中结核抗原特异性抗体的水平；A：AE抗原特异性抗体的水平。

图6为实施例3各组小鼠脾淋巴细胞的抗原特异性增殖。****,双因素方差分析组间因素比较，P<0.0001；#，与BCG组相比，P<0.05。

图7为实施例3各组小鼠肺泡灌洗液中的TRM细胞数量。#，与BCG组CD8

图8为实施例3各组小鼠肺组织中的TRM细胞数量。##，与BCG组CD8

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、重组腺病毒载体的构建

一、主要实验试剂与设备如下表所示：

表1主要实验试剂与设备

二、实验内容

1、AE和R2重组腺病毒载体(pAdTrack-AE-EF1-R2)的构建

(1)合成EF1启动子DNA序列：由上海汉恒生物公司合成，核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

(2)pAdTrack-CMV(图1所示)载体37℃酶切，胶回收；

(3)设计引物，从分别含有AE和R2的质粒pPRO EXHTb-AEAg85B-ESAT6(许承明.融合蛋白亚单位疫苗对结核分枝杆菌感染豚鼠和小鼠免疫治疗效果的初步评价.硕士学位论文,西安：第四军医大学,2014.)、pDE22-Rv2031c-Rv2626c(罗泰来.表达Rv2031c-Rv2626c融合蛋白重组耻垢分枝杆菌的生物学和免疫学特性研究.硕士学位论文,西安：第四军医大学,2012)中扩增AE和R2目的基因片段后回收。引物序列如下：

AE-F：cagatccgctagagatctggtaccgccaccATGACCGCGGGCGCGTTCT，如SEQ

ID NO.6所示；

AE-R：ggcaccggagcgatcgcagatcctTCTATGCGAACATCCCAGTGA，如SEQ ID NO.7所示；

R2-F：aagctgtgaccggcgcctacGCCACCATGGCCACCACCCTTCCCGT，如SEQ ID NO.8所示；

R2-R：ataaacaagttaagcttaggctcgagCTAGCTGGCGAGGGCCATGG，如SEQ ID NO.9所示；

PCR扩增体系及程序见表2和表3。

表2 PCR扩增体系

表3 PCR扩增程序

其中，A-C，27个循环。

(3)将上述合成的EF1启动子片段、AE和R2目的片段与酶切后的pAdTrack-CMV载体连接，将Ag85B-ESAT-6融合基因通过KpnI和PvuI双酶切位点克隆至pAdTrack-CMV载体CMV启动子下游，将EF1启动子通过PvuI和AluI双酶切位点克隆至同一个pAdTrack-CMV载体Ag85B-ESAT-6融合基因下游，将Rv2031c-Rv2626c融合基因克隆通过AluI和XhoI双酶切位点至同一个pAdTrack-CMV的EF1启动子下游，连接反应体系(20μl)如表4所示。反应体系置于50℃水中，温浴20min。

表4连接反应体系

(4)将上述连接产物转化感受态细胞DH5α，然后涂布于含Amp抗生素的筛选平板上，37℃培养16～24小时。

(5)重组阳性克隆的筛选鉴定：挑取上述筛选平板上的阳性克隆，并接种至LB液体培养基中，37℃、230rpm/min摇菌培养14小时。用PCR法鉴定菌液，并将PCR阳性菌液送测序公司进行测序，测序正确命名为pAdTrack-AE-EF1-R2。

实施例2重组腺病毒的包装和纯化

1.主要实验试剂

人胚肾细胞系HEK293 cell购于汉恒生物公司；DMEM购于Hyclone公司；LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品；胎牛血清、胰酶购于Hyclone公司；60mm培养皿、10cm培养皿、96孔板、移液管(5ml，10ml)、15ml及50ml离心管均购自NEST公司；双抗购自invitrogen公司；滤膜滤器购自Millipore公司。

2.实验内容

2.1重组腺病毒载体的包装，收毒及扩增；

(1)大量制备pAdTrack-AE-EF1-R2重组质粒：将对数生长期的pAdTrack-AE-EF1-R2重组DH5α菌液2ml加入100mL含100ug/ml Amp的LB培养基中，37℃，300rpm震荡摇菌过夜，用大提质粒试剂盒根据说明书提(2)铺细胞：转染前一天，将HEK293细胞接种于60mm培养皿，培养基为DMEM+10％Hyclon胎牛血清，置37℃含5％CO

(3)转染：待细胞生长至底面积的长满到70～80％时，pAdTrack-AE-EF1-R2及骨架质粒pAdeasy-1，用LipofiterTM转染试剂进行转染。转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。

(4)收毒(P1)：每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。将60mm培养皿中所有细胞及培养液收于15ml离心管中。

(5)冻融：打开恒温水浴锅至37℃，将15ml离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为重组腺病毒第一代毒种(P1)，将作为随后大量病毒扩增的毒种。

(7)扩增：从P1代病毒上清中取2ml感染一个10cm的细胞培养皿的细胞。余下的病毒上清放入外旋的冻存管中-80℃保留，做为毒种保留。

(8)收毒(P2)：病毒扩增两天后待所有细胞脱落底面即可进行收毒，将细胞连同培养液一同收入15ml离心管中，依据前面的冻融方法，冻融三次，取上清进行下一代扩增或于-80℃保存。以后每代的病毒扩增及收毒都如此反复进行。

2.2重组腺病毒的纯化：采用CsCl法对重组腺病毒进行纯化。首先将8mlCsCl 1.4加入离心管中，然后再继续缓慢加入10ml CsCl 1.2，最后在其上部缓慢加入约20ml的病毒溶液。配平离心管，并进行超速离心，100000×g，90min，4℃，减速度为0。离心结束后，吸弃离心管上部的废液，采用穿刺法在离心管的蓝白色条带下方吸出病毒溶液。用TE溶液稀释所收集的病毒溶液，并用CsCl对病毒溶液再一次进行纯化。纯化结束后，用200×体积的透析缓冲液，透析病毒溶液三次，间隔一小时换一次液。透析结束后测滴度并分装-80℃保存病毒。

实施例3、AE和R2在重组腺病毒中的表达

(1)基因水平的表达：将重组腺病毒瞬时转染293细胞，MOI＝5。48小时后，采用AE和R2特异性引物，RT-PCR方法检测重组腺病毒表达目的基因的水平，结果如图2所示，与内参基因相比，AE和R2目的基因均可以得到特异性的表达

(2)蛋白水平的表达：将重组腺病毒瞬时转染小鼠Raw264.7巨噬细胞，MOI＝5。48小时后，利用anti-Ag85B、anti-ESAT-6、anti-Rv2031c、Rv2626c四种结核分枝杆菌抗原的单克隆抗体，间接免疫荧光法检测AE和R2目的蛋白的表达。同时，以腺病毒空载体(AdC)转染的巨噬细胞作为对照。结果如图3所示，A：腺病毒空载体(AdC)瞬时转染的巨噬细胞细胞，经anti-Ag85B mAb、anti-ESAT-6mAb、anti-Rv2031c、anti-Rv2626c四种抗体混合物检测的间接免疫荧光。B-E为重组腺病毒感染巨噬细胞，B：anti-Ag85B mAb检测AE蛋白表达的间接免疫荧光，C：anti-ESAT-6mAb检测AE蛋白表达的间接免疫荧光，D：anti-Rv2031c mAb检测R2蛋白表达的间接免疫荧光，E：anti-Rv2626c mAb检测R2蛋白表达的间接免疫荧光。结果表明，重组腺病毒可以在巨噬细胞中特异性表达目的蛋白AE和R2。

实施例3

不同构建重组腺病毒在小鼠模型上的免疫学评价

将1×10

(1)肺泡盥洗液中sIgA水平的测定：结果如图4所示，AdM免疫小鼠的肺泡盥洗液中的sIgA水平高于Blank组和AdC组的(P<0.05)，但与BCG组相比，无统计学差异(P>0.05)。

(2)外周血中结核分枝杆菌抗原特异性抗体水平：采用ELISA方法检测各组小鼠外周血中针对结核分枝杆菌融合抗原AE(Ag85B-ESAt-6)和R2(Rv2031c-Rv2626c)的特异性抗体水平，结果如图5所示。Ad-AE-R2经滴鼻免疫小鼠后，能够诱生小鼠外周血中产生抗AE、R2融合抗原的特异性抗体，而且抗体水平明显高于Blank组和Adc组小鼠的(P<0.05)。与BCG组相比，Ad-AE-R2诱生小鼠产生的针对AE融合蛋白抗原的特异性抗体水平相对较低(P<0.05)，但其诱生小鼠产生的针对R2融合蛋白抗原的特异性抗体水平则高于BCG免疫小鼠的(P<0.05)。

(3)脾淋巴细胞的抗原特异性增殖：无菌分离小鼠脾淋巴细胞，用AE、R2、AE+R2及BCG菌体蛋白等结核分枝杆菌特异性抗原进行刺激，CCK8方法检测细胞的抗原特异性增殖指数，双因素方差分析方法进行统计学分析。结果如图6所示，Ad-AE-R2免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖指数SI与其他各组的相比，组间因素具有非常显著的统计学差异(P<0.0001)。经不同特异性抗原刺激后，Ad-AE-R2免疫组小鼠的脾淋巴细胞均能发生特异性增殖，尤其是在R2抗原和AE+R2抗原刺激后，该组小鼠的脾淋巴细胞增殖指数SI明显高于BCG免疫组的(P<0.05)，表明与BCG相比，Ad-AE-R2能够诱生小鼠产生更强的针对AE和R2融合抗原的特异性细胞免疫，对结核分枝杆菌将具有更强的免疫保护性。

(4)肺泡灌洗液中组织记忆性T细胞(TRM)的诱生：检测免疫小鼠在免疫后不同时间点肺泡灌洗液中TRM细胞的比例和数量。结果如图7所示，与BCG免疫组相比，Ad-AE-R2和Adc免疫组在初始免疫后3周均能在肺泡灌洗液中诱生较高数量的TRM(P<0.01)，TRM的细胞类型以CD8

(5)肺组织中TRM的诱生：检测小鼠在免疫后不同时间点肺组织中TRM细胞的比例和数量。结果如图8所示，与BCG免疫组相比，Ad-AE-R2在免疫后3周就能在小鼠肺组织中诱生大量的TRM(P<0.01)，TRM的细胞类型以CD8

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 中国人民解放军空军军医大学

<120> 表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白的重组腺病毒及其用途

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaccgcgg gcgcgttctc ccggccgggg ctgccggtcg agtacctgca ggtgccgtcg 60

ccgtcgatgg gccgcgacat caaggttcag ttccagagcg gtgggaacaa ctcacctgcg 120

gtttatctgc tcgacggcct gcgcgcccaa gacgactaca acggctggga tatcaacacc 180

ccggcgttcg agtggtacta ccagtcggga ctgtcgatag tcatgccggt cggcgggcag 240

tccagcttct acagcgactg gtacagcccg gcctgcggta aggctggctg ccagacttac 300

aagtgggaaa ccttcctgac cagcgagctg ccgcaatggt tgtccgccaa cagggccgtg 360

aagcccaccg gcagcgctgc aatcggcttg tcgatggccg gctcgtcggc aatgatcttg 420

gccgcctacc acccccagca gttcatctac gccggctcgc tgtcggccct gctggacccc 480

tctcagggga tggggcctag cctgatcggc ctcgcgatgg gtgacgccgg cggttacaag 540

gccgcagaca tgtggggtcc ctcgagtgac ccggcatggg agcgcaacga ccctacgcag 600

cagatcccca agctggtcgc aaacaacacc cggctatggg tttattgcgg gaacggcacc 660

ccgaacgagt tgggcggtgc caacataccc gccgagttct tggagaactt cgttcgtagc 720

agcaacctga agttccagga tgcgtacaac gccgcgggcg ggcacaacgc cgtgttcaac 780

ttcccgccca acggcacgca cagctgggag tactggggcg ctcagctcaa cgccatgaag 840

ggtgacctgc agagttcgtt aggcgccggc atcgatggtg gctcaggtgg ctccggtgga 900

ggcggaagcg gcggtggagg atcaacagag cagcagtgga atttcgcggg tatcgaggcc 960

gcggcaagcg caatccaggg aaatgtcacg tccattcatt ccctccttga cgaggggaag 1020

cagtccctga ccaagctcgc agcggcctgg ggcggtagcg gttcggaggc gtaccagggt 1080

gtccagcaaa aatgggacgc cacggctacc gagctgaaca acgcgctgca gaacctggcg 1140

cggacgatca gcgaagccgg tcaggcaatg gcttcgaccg aaggcaacgt cactgggatg 1200

ttcgcatag 1209

<210> 2

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggccacca cccttcccgt tcagcgccac ccgcggtccc tcttccccga gttttctgag 60

ctgttcgcgg ccttcccgtc attcgccgga ctccggccca ccttcgacac ccggttgatg 120

cggctggaag acgagatgaa agaggggcgc tacgaggtac gcgcggagct tcccggggtc 180

gaccccgaca aggacgtcga cattatggtc cgcgatggtc agctgaccat caaggccgag 240

cgcaccgagc agaaggactt cgacggtcgc tcggaattcg cgtacggttc cttcgttcgc 300

acggtgtcgc tgccggtagg tgctgacgag gacgacatta aggccaccta cgacaagggc 360

attcttactg tgtcggtggc ggtttcggaa gggaagccaa ccgaaaagca cattcagatc 420

cggtccacca acgatatcgg tggcggtagc ggcggtggct ccggcggtgg cagcggtggc 480

ggtagcacca ccgcacgcga catcatgaac gcaggtgtga cctgtgttgg cgaacacgag 540

acgctaaccg ctgccgctca atacatgcgt gagcacgaca tcggcgcgtt gccgatctgc 600

ggggacgacg accggctgca cggcatgctc accgaccgcg acattgtgat caaaggcctg 660

gctgcgggcc tagacccgaa taccgccacg gctggcgagt tggcccggga cagcatctac 720

tacgtcgatg cgaacgcaag catccaggag atgctcaacg tcatggaaga acatcaggtc 780

cgccgtgttc cggtcatctc agagcaccgc ttggtcggaa tcgtcaccga agccgacatc 840

gcccgacacc tgcccgagca cgccattgtg cagttcgtca aggcaatctg ctcgcccatg 900

gccctcgcca gctag 915

<210> 3

<211> 402

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu

1 5 10 15

Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln

20 25 30

Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg

35 40 45

Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu

50 55 60

Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val Gly Gly Gln

65 70 75 80

Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly

85 90 95

Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln

100 105 110

Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile

115 120 125

Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala Ala Tyr His

130 135 140

Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro

145 150 155 160

Ser Gln Gly Met Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala

165 170 175

Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala

180 185 190

Trp Glu Arg Asn Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu Val Ala Asn

195 200 205

Asn Thr Arg Leu Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Asn Glu Leu

210 215 220

Gly Gly Ala Asn Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser

225 230 235 240

Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn

245 250 255

Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp

260 265 270

Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly

275 280 285

Ala Gly Ile Asp Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

290 295 300

Gly Gly Gly Ser Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala

305 310 315 320

Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu

325 330 335

Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly

340 345 350

Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr

355 360 365

Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser

370 375 380

Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met

385 390 395 400

Phe Ala

<210> 4

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ala Thr Thr Leu Pro Val Gln Arg His Pro Arg Ser Leu Phe Pro

1 5 10 15

Glu Phe Ser Glu Leu Phe Ala Ala Phe Pro Ser Phe Ala Gly Leu Arg

20 25 30

Pro Thr Phe Asp Thr Arg Leu Met Arg Leu Glu Asp Glu Met Lys Glu

35 40 45

Gly Arg Tyr Glu Val Arg Ala Glu Leu Pro Gly Val Asp Pro Asp Lys

50 55 60

Asp Val Asp Ile Met Val Arg Asp Gly Gln Leu Thr Ile Lys Ala Glu

65 70 75 80

Arg Thr Glu Gln Lys Asp Phe Asp Gly Arg Ser Glu Phe Ala Tyr Gly

85 90 95

Ser Phe Val Arg Thr Val Ser Leu Pro Val Gly Ala Asp Glu Asp Asp

100 105 110

Ile Lys Ala Thr Tyr Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Ser Val Ala Val

115 120 125

Ser Glu Gly Lys Pro Thr Glu Lys His Ile Gln Ile Arg Ser Thr Asn

130 135 140

Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Thr Thr Ala Arg Asp Ile Met Asn Ala Gly Val Thr Cys Val

165 170 175

Gly Glu His Glu Thr Leu Thr Ala Ala Ala Gln Tyr Met Arg Glu His

180 185 190

Asp Ile Gly Ala Leu Pro Ile Cys Gly Asp Asp Asp Arg Leu His Gly

195 200 205

Met Leu Thr Asp Arg Asp Ile Val Ile Lys Gly Leu Ala Ala Gly Leu

210 215 220

Asp Pro Asn Thr Ala Thr Ala Gly Glu Leu Ala Arg Asp Ser Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gln Glu Met Leu Asn Val Met Glu

245 250 255

Glu His Gln Val Arg Arg Val Pro Val Ile Ser Glu His Arg Leu Val

260 265 270

Gly Ile Val Thr Glu Ala Asp Ile Ala Arg His Leu Pro Glu His Ala

275 280 285

Ile Val Gln Phe Val Lys Ala Ile Cys Ser Pro Met Ala Leu Ala Ser

290 295 300

<210> 5

<211> 546

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 60

cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120

aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180

gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240

acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg 300

ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac 360

tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct 420

cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca 480

actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc tgtgaccggc 540

gcctac 546

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cagatccgct agagatctgg taccgccacc atgaccgcgg gcgcgttct 49

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcaccggag cgatcgcaga tccttctatg cgaacatccc agtga 45

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagctgtgac cggcgcctac gccaccatgg ccaccaccct tcccgt 46

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ataaacaagt taagcttagg ctcgagctag ctggcgaggg ccatgg 46