一种快速增强动物自身免疫力的核酸＆中药复合水溶液的制备

技术领域

本发明属于保健品制备技术领域，尤其涉及一种增强动物自身免疫力的组合物、保健品制剂及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，研究发现胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(cytosine phosphate guanidineoligodeoxynucleotide,CpG ODNs)是一种新型疫苗佐剂。CpG ODNs除对非特异性免疫有影响外，还能提高共免疫抗原的特异性免疫应答，不仅提高细胞毒性T细胞反应，而且能提高免疫球蛋白的产量，因而已经引起人们的广泛关注。研究发现，CpG ODNs的作用受体是Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)。在机体免疫中，Toll样受体起连接非特异性免疫与特异性免疫的桥梁作用。CpG ODNs在各种免疫途径，如肌肉注射、皮下及黏膜途径(滴鼻，口服)等都有成功的报道，且适用于几乎所有的疫苗形式，并能够刺激特异性抗原反应增加5％～500％。

目前CpG ODNs是作为疫苗佐剂来应用的，对于CpG ODNs的其他用途尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种增强动物自身免疫力的组合物、保健品制剂及其制备方法和应用；本发明将所述胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸CpG ODNs、中药提取液和脂质体组合获得的组合物，能够增强动物干细胞中MHC-II的表达，能通过快速增强自身免疫细胞抗原呈递能力来提高动物的自身免疫反应。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种增强动物自身免疫力的组合物，包括CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液、中药水提液和脂质体；所述CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液、中药水提液和脂质体的体积比为(8～12)：(8000～12000)：(10～20)；

所述CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液的浓度为50～150ng/μL；

所述中药水提液为人参和苁蓉的水提液，以生药人参计，所述中药水提液的浓度为0.8～1.2g/mL，以生药苁蓉计，所述中药提取液的浓度为0.8～1.2g/mL。

优选的，所述组合物还包括无血清培养基，所述无血清培养基与中药水提液的体积比为(5～10)：(80～120)。

优选的，所述中药水提液中还包括浓度为0.008～0.012g/mL的甘露糖。

优选的，所述脂质体包括脂质体2000Plus和脂质体2000LTX；所述脂质体2000Plus和脂质体2000LTX的体积比为(30～40)：(90～110)。

本发明提供了所述的组合物的制备方法，包括以下步骤：将所述CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液和脂质体混合、静置后，再与中药水提液混合。

优选的，将所述CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液、无血清培养基和脂质体2000Plus混合、进行第一静置获得混合液，将所述混合液与脂质体2000LTX混合，进行第二静置后，与中药水提液混合，获得所述组合物。

优选的，所述第一静置的时间为4～6min，所述第一静置的温度为15～25℃；所述第二静置的时间为25～35min，所述第二静置的温度为15～25℃。

优选的，所述中药水提液的制备方法包括以下步骤：将所述人参和苁蓉用水浸泡、文火煮沸后，煎煮浓缩即得。

本发明提供了一种增强动物自身免疫力的保健品制剂，包括所述的组合物，所述保健品制剂为外用液体制剂。

本发明还提供了所述的组合物、所述的保健品制剂在制备提高动物干细胞中MHC-II表达的保健品中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的增强动物自身免疫力的组合物，包括CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液、中药水提液和脂质体；所述组合物能快速增强动物干细胞的MHC-II表达能力，能通过快速增强自身免疫细胞抗原呈递能力来提高动物的自身免疫反应。

进一步的，本发明提供的组合物将CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液与具有补益作用的中药水提液复配，具有绿色无残留、快速增强动物自身免疫反应的作用，所述组合物或者保健品制剂作为外用制剂，能够通过黏膜给药，具有极大的便利，能够弥补现有动物疫苗诱导期长(一般为7d)的滞后性的缺点，并且能够显著增加免疫反应强度。

本发明提供的组合物或者保健品制剂应用便利，适于在家畜、宠物等疫病防控方面规模化推广应用。

附图说明

图1为AFSC-II、RTSC-II检测前、后MHC-II基因相对表达量柱形示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种增强动物自身免疫力的组合物，包括CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液、中药水提液和脂质体；所述CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液、中药水提液和脂质体的体积比为(8～12)：(8000～12000)：(10～20)；所述CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液的浓度为50～150ng/μL；所述中药水提液为人参和苁蓉的水提液，以生药人参计，所述中药水提液的浓度为0.8～1.2g/mL，以生药苁蓉计，所述中药提取液的浓度为0.8～1.2g/mL。

在本发明中，所述组合物包括CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液，所述CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液的浓度优选为80～120ng/μL，更优选为90～110ng/μL，最优选为100ng/μL。本发明对所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列没有特殊限定，具有CpG寡聚结构即可；在本发明中，所述CpG寡聚脱氧核苷酸的长度优选为11～30bp；本发明对所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列种类没有特殊限定，所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列种类与实际应用效果成数量累加效应；在本发明具体实施过程中所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列种类为478种，详见表1记载。本发明对所述CpG寡聚脱氧核苷酸的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的人工合成方法即可。本发明将制备获得的CpG寡聚脱氧核苷酸溶于水制备CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液。在本发明中，所述水优选为无酶水。

在本发明中，所述组合物包括中药水提液，所述中药水提液为人参和苁蓉的水提液，以生药人参计，所述中药水提液的浓度优选为0.9～1.1g/mL，更优选为1.0g/mL，以生药苁蓉计，所述中药提取液的浓度优选为0.9～1.1g/mL，更优选为1.0g/mL。在本发明中，所述中药水提液中还包括浓度为0.008～0.012g/mL的甘露糖，更优选为0.01g/mL；所述甘露糖的作用是增强免疫力。在本发明中，所述中药水提液的制备方法包括以下步骤：将所述人参和苁蓉用水浸泡、文火煮沸后，煎煮浓缩即得。在本发明中，所述人参和苁蓉的质量比优选为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，更优选为1：1；所述人参与浸泡用水的质量比优选为1g：(8～12)mL，更优选为1g：10mL；在本发明中，所述浸泡的时间优选为2～4h，更优选为3h，所述浸泡的温度优选为15～25℃。本发明在所述浸泡后，优选的进行文火煮沸，所述文火煮沸的时间优选为50～70min，更优选为60min。本发明在所述文火煮沸后，优选的进行过滤，收集滤液。本发明对所述过滤的方法没有特殊限定，采用本领域常规的中药过滤方法即可。本发明在获得所述滤液后，将所述滤液与甘露糖混合进行煎煮浓缩；本发明对所述煎煮浓缩的时间没有限定，浓缩至限定的中药水提液的浓度即可。在本发明中，所述中药水提液具有增强免疫力的作用。

在本发明中，所述组合物包括脂质体，所述脂质体优选的包括脂质体2000Plus和脂质体2000LTX；所述脂质体2000Plus和脂质体2000LTX的体积比优选为(30～40)：(90～110)，更优选为(32～38)：(95～105)，最优选为35:100。在本发明中，所述脂质体2000Plus和脂质体2000LTX采用市售产品即可；所述脂质体2000Plus和脂质体2000LTX是CpG寡聚脱氧核苷酸的载体，易于携带CpG寡聚脱氧核苷酸进入细胞质以及细胞核，触发靶位基因的表达。在本发明中，所述脂质体2000Plus和脂质体2000LTX优选的购自Invitrogen公司。

在本发明中，所述组合物还包括无血清培养基，所述无血清培养基与中药水提液的体积比优选为(5～10)：(80～120)，更优选为(5～10)：100。在本发明中，所述无血清培养基优选为无血清培养基Opti-MEM，所述无血清培养基Opti-MEM优选的购自GIBCO公司。

在本发明的一个具体实施例中，所述组合物中CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液、中药水提液、无血清培养基、脂质体2000Plus和脂质体2000LTX的体积比优选为100：94765：5000：35：100。

本发明还提供了所述的组合物的制备方法，包括以下步骤：将所述CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液和脂质体混合、静置后，再与中药水提液混合。

在本发明中，优选的将所述CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液、无血清培养基和脂质体2000Plus混合、进行第一静置获得混合液，将所述混合液与脂质体2000LTX混合，进行第二静置后，与中药水提液混合，获得所述组合物。在本发明中，所述第一静置的时间优选为4～6min，更优选为5min；所述第一静置的温度优选为15～25℃；所述第二静置的时间优选为25～35min，更优选为28～32min，最优选为30min，所述第二静置的温度优选为15～25℃。本发明在制备获得所述组合物后，优选的将所述组合物装瓶、密封；所述组合物优选的置于3～5℃储存。

本发明还提供了一种增强动物自身免疫力的保健品制剂，包括所述的组合物，所述保健品制剂为外用液体制剂。在本发明中，所述保健品制剂优选为鼻腔外用药，具体可选为喷鼻剂或滴鼻剂；所述保健品制剂优选为眼部外用制剂，具体可选为滴眼液。本发明提供的所述保健品制剂能够通过黏膜给药，起效快，使用方便。

本发明还提供了所述的组合物、所述的保健品制剂在制备提高动物干细胞中MHC-II表达的保健品中的应用。在本发明中，所述组合物、保健品制剂能够快速显著提高干细胞的MHC-II基因表达量，具有快速增强动物机体自身免疫反应的作用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN)水溶液，设计合成478条CpG ODN(序列信息详见表1)，人工合成后溶于无酶水至终浓度为100ng/μL；

中药水提液：人参，苁蓉各取300g，洗净，放于3000mL无离子水中25℃浸泡3h后，进行文火煎煮1h，200目滤网过滤取滤汁加3g甘露糖(SIGMA公司)，继续煎煮浓缩至300mL；

无血清培养基Opti-MEM(购自GIBCO公司)；

脂质体：脂质体2000Plus和脂质体2000LTX(购自Invitrogen公司)

将100μL的CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液，5mL的无血清培养基Opti-MEM，35μL脂质体2000Plus，混均，25℃静置5min；添加100μL脂质体2000LTX，混均，静置30min，添加94.765mL中药水提液，混均。装瓶、密封，4℃储藏。

表1 CpG ODN序列信息

实施例2

CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN)水溶液，设计合成478条CpG ODN(序列信息详见表1)，人工合成后溶于无酶水至终浓度为75ng/μL；

中药水提液：人参，苁蓉各取200g，洗净，无离子水中25℃浸泡3h，2800mL无离子水文火煎煮1h，取汁加2.5g甘露糖(SIGMA公司)，继续煎煮浓缩至250mL；

无血清培养基Opti-MEM(购自GIBCO公司)；

脂质体：脂质体2000Plus和脂质体2000LTX(购自Invitrogen公司)

将80μL的CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液，4mL的无血清培养基Opti-MEM，30μL脂质体2000Plus，混均，25℃静置30min；添加80μL脂质体2000LTX，混均，静置25min，添加95.81mL中药水提液，混均。装瓶、密封，4℃储藏。

实施例3

CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN)水溶液，设计合成478条CpG ODN(序列信息详见表1)，人工合成后溶于无酶水至终浓度为125ng/μL；

中药水提液：人参，苁蓉各取400g，洗净，无离子水中25℃浸泡3h，3500mL无离子水文火煎煮1h，取汁加3.5g甘露糖(SIGMA公司)，继续煎煮浓缩至350mL；

无血清培养基Opti-MEM(购自GIBCO公司)；

脂质体：脂质体2000Plus和脂质体2000LTX(购自Invitrogen公司)

将120μL的CpG寡聚脱氧核苷酸水溶液，6mL的无血清培养基Opti-MEM，40μL脂质体2000Plus，混均，25℃静置6min；添加120μL脂质体2000LTX，混均，静置35min，添加93.72mL中药水提液，混均。装瓶、密封，4℃储藏。

实施例4

实施例1中制备的组合物对绵羊羊水干细胞及胎儿肾组织干细胞MHC-II基因的影响

干细胞来源：来源于本实验室分离的绵羊羊水干细胞和胎儿肾组织干细胞，系来源于同一只母羊；所述羊水干细胞和胎儿肾组织干细胞的分离和培养方法参见中国专利CN201310169114.4和CN201911167203.9的记载。羊水来源的干细胞(Amniotic fluid-derived stem cells，AFSC)表达MHC-II，不表达MHC-I，称之为AFSC-II，肾组织来源的多潜能干细胞(The renal tissue pluripotent stem cells,RTSC)表达MHC-II，不表达MHC-I，称之为RTSC-II。

溶液配制

培养液I：DMEM+1％(v/v)L-谷氨酰胺+1％(v/v)非必需氨基酸+1％(v/v)丙酮酸钠+0.3μLβ-巯基乙醇+5ng或500u/mL LIF+5ng/mLbFGF；

培养液II：培养液I+15％(v/v)FBS；

培养液III:培养液I+5％(v/v)FBS，用0.22μm的滤器过滤，4℃保存。

非必需氨基酸\L-谷氨酰胺均为GIBCO公司产品。

检测过程：提前24h，AFSC-II、RTSC-II细胞用0.05％胰酶消化液1mL，消化15s后重悬细胞，分别以5×10

Real Time PCR检测AFSC、RTSC标志基因的相对表达量

实验所用AFSC-II、RTSC-II细胞来源同一受孕中期母羊的羊水和胎儿并采用低浓度胰酶消化方法获得；提取AFSC-II、RTSC-II total RNA，反转录前进行基因组DNA去除反应，然后反转录合成其cDNA，采用TaKaRa SYBRPremix EX TaqTMII试剂盒实现；引物信息见表4，内参为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)；Real Time PCR按照TaKaRa SYBR Premix EXTaqTMII试剂盒说明进行，每个样品4个重复。

表2 基因组DNA去除反应

表3 两步法real time PCR标准程序

表4 Real Time PCR引物序列

结果：Real time PCR分析表明，AFSC-II，RTSC-II，经添加溶液A培养后其表达的主要组织相容性抗原MHC-II基因表达量为对照组的约1.01倍，经添加溶液B培养后其表达的主要组织相容性抗原MHC-II基因表达两为对照组的约1.12倍，在标准误差为±0.13的情况下，均未见明显增强作用。AFSC-II细胞经本发明提供的组合物培养后其表达的主要组织相容性抗原MHC-II基因表达量急剧增加，为对照组的3.17倍，而RTSC-II细胞经本发明提供的组合物培养后其表达的主要组织相容性抗原MHC-II基因表达量同样急剧增加，为对照细胞的3.06倍(图1)，另外对照组和实验组细胞均不表达或弱表达MHC-I。

由上述实施例可知，本发明提供的组合物能够在24h内快速增强绵羊羊水干细胞以及胎儿肾组织干细胞的MHC-II基因表达量，MHC-II仅在体内免疫细胞中表达，起呈递外源抗原的的重要作用，也是整个机体免疫反应的核心。可见本发明提供的组合物具有快速增强动物机体自身免疫反应的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。