构建孤独症的动物模型的方法及相应应用

技术领域

本发明涉及医药研究领域，具体涉及一种制备弓形虫可溶性复合物的方法、一种使用该复合物构建孤独症动物模型的方法，以及一种应用该动物模型进行治疗孤独症药物筛选的方法及应用。

背景技术

孤独症是一种神经发育谱系障碍，属于精神疾病；该疾病的病因及病理机制十分复杂，核心症状为社会交流障碍、语言交流障碍及重复刻板行为。一般认为，孤独症由环境、生物(感染)和遗传等因素共同作用而引起的，但具体致病机制尚未完全阐明。目前，人们对孤独症的药物的研究、筛选主要基于孤独症动物模型，但至今没有切实有效的针对核心症状的药物获得批准。

现有的孤独症模式动物构建方法主要包括遗传学方法(如编码突触黏附蛋白神经配蛋白和神经连接蛋白类基因以及Shank3等基因的突变)、化学因素诱导方法(如丙戊酸、沙利度胺等)以及生物因素诱导方法(丙酸、肠道菌群等)。近年来，大量的临床与基础研究表明妊娠期接触病原体诱导产生的母体免疫激活(maternal immune activation，MIA)会对发育中的胎儿/胎鼠产生影响，是诱导子代罹患孤独症等精神疾病的重要诱因。因此，科学家采用细菌模拟物LPS或病毒模拟物Poly(I:C)来诱导孕鼠MIA造子代孤独症模型。然而这两种制剂虽然够诱导机体固有免疫激活，但是它们具有不能真正模拟病原体感染机体后诱导的全谱系免疫应答的缺陷。

发明内容

本发明的主要目的是针对以上存在的问题，提供一种制备弓形虫可溶性复合物的方法、一种使用该复合物构建孤独症动物模型的方法，以及一种应用该动物模型进行孤独症药物筛选的方法及应用。

本发明提供了一种制备弓形虫可溶性复合抗原的方法，包括以下步骤：

1)刚地弓形虫速殖子(RH株)的复苏与HeLa细胞传代。显微镜下对刚地弓形虫速殖子进行观察速殖子增殖与裂解情况。当大部分HeLa细胞被虫体裂解，并且速殖子活力比较好的时候，就可以吸取1ml含有速殖子的细胞培养上清，1500rpm/min离心5min。

2)用完全培养基重悬沉淀，并加入到新鲜HeLa细胞中。反复几次。将含有速殖子的培养液经过滤用的滤器和0.22μm的滤膜，加入PBS重悬后，再无菌注射器反复吹打，使细胞中的速殖子释放，过0.22μm的无菌滤膜后高速离心，弃上清后用2ml无菌PBS重悬。

3)将重悬液放在4℃和﹣20℃反复冻融3次，然后以350瓦的功率进行超声破碎。

4)将产物置于4℃，12000rpm/min，离心20分钟，吸取上清为弓形虫速殖子抗原。

本发明提供了一种采用弓形虫可溶性复合物诱导子代动物产生孤独症核心症状的方法，包括以下步骤：

1)将制备好的STAg抗原以90μg/只小鼠以及对照PBS于孕鼠E14.5天腹腔注射，3天后，收集孕鼠的脾脏，制备脾脏淋巴细胞，进行染色后采用流式细胞术检测常见T细胞亚型(Th1、Th2、Th17、Treg细胞)以明确孕鼠的MIA水平。

2)上述孕鼠的子代出生(7-8周龄)后，采用三厢社交实验(three chamber freeexploring test)、旷场实验(open filed)、高架十字高架迷宫(elevated plus maze)、重复梳理动作(grooming)以及埋弹珠(marble burying)实验去观察小鼠的孤独症相关的行为。

经验证，由上述STAg注射的孕鼠子代可显著产生孤独症症状，具体表现为，社会交流障碍、重复刻板行为及孤独症常见伴发的焦虑症状。

本发明还提供了一种采用上述弓形虫可溶性复合物构建的孤独症动物模型在研发孤独症治疗药物中的应用方法，包括以下步骤：

1)将制备好的STAg抗原以90μg/只小鼠以及对照PBS于孕鼠E14.5天腹腔注射，待孕鼠的子代出生(2周龄)后，采用PBS、西格列汀(Sitagliptin，100mg/kg)、吡格列酮(Pioglitazone，100mg/kg)分别腹腔注射子代病鼠；

2)上述治疗小鼠3周后，采用三厢社交实验(three chamber free exploringtest)、旷场实验(open filed)、高架十字高架迷宫(elevated plus maze)、重复梳理动作(grooming)以及埋弹珠(marble burying)实验去观察小鼠的孤独症相关的行为。

附图说明

图1a～1b显示社交互动(social interaction)行为学实验的结果，其中图1a中，将被试小鼠分别与陌生的同年龄(age-matched)小鼠置于检测箱内，记录被试小鼠社交互动的时间；图1b中检测被试小鼠与幼年陌生小鼠(juvenile mouse)的社交互动时间。

图2a～2b显示三厢社交实验的结果，用于检测社交倾向性，其中，被试小鼠置于三厢的中厢，一侧(厢)为空笼(E)，另一侧为装有陌生鼠的小笼(S1)，被试小鼠可以嗅探(sniffing)笼中的小鼠，通过比较被试小鼠嗅探E和S1的时间可以判断小鼠的社交倾向性。

图3a～3b显示用于检测被试小鼠的重复刻板行为的行为学测试的结果，其中，图3a为重复梳理动作(grooming)；图3b为埋弹珠(marble burying)的次数，均是公认反映重复刻板行为的行为学指标。

图4a～4b分别为旷场实验(open filed)和十字高架迷宫(elevated plus maze)的结果，用于检测小鼠的焦虑水平。由于鼠类趋暗的天性，在旷场中心和十字高架迷宫的开臂里停留的时间越短说明焦虑水平越高。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

为了解决现有技术的问题，本发明着眼于一种寄生于人和温血动物有核细胞内的危害严重的机会致病性原虫—刚地弓形虫，因为其在我国乃至世界普遍易感，全球约1/3人口感染，影响范围深远。本发明从中提取制备了弓形虫速殖子STAg抗原复合物，替代细菌模拟物LPS以及病毒模拟物poly(I:C)。通过研究发现，在小鼠E14.5孕期注射20μg～500μg区间的STAg以及PBS对照剂，3天后发现STAg可以有效激活孕鼠的母体免疫激活，例如，可以体现在孕鼠脾脏促炎型Th1细胞、Th17细胞比例升高。

与此一致，本发明发现上述子代成年小鼠自发进入到旷场中央区的时间减少、进入开臂的活动时间减少、主动接近陌生小鼠的时间显著降低，而埋珠的数量显著增加，表明采用上述弓形虫速殖子抗原造模的方法能够有效导致该孤独症小鼠模型出现孤独症的核心症状。

截至目前为止，没有任何关于采用弓形虫可溶性复合物构建孤独症动物模型的报道。

在本实施例中，采用小鼠为模式实验动物，提供了一种采用上述STAg用于构建孤独症小鼠模型的实施方案，具体操作步骤如下：

(1)制备弓形虫STAg抗原

(1-1)刚地弓形虫速殖子(RH株)的复苏与细胞传代将保存在液氮中的刚地弓形虫速殖子在37℃中水浴箱中快速复苏，复苏的液体用5ml完全培养基清洗三次，每次离心1500转，5分钟。最后一次离心后弃去上清，用1ml完全培养基重悬。

(1-2)显微镜下对刚地弓形虫速殖子进行计数。

(1-3)弃去HeLa细胞培养皿中的陈旧培养基，加入含2×10

(1-4)10min后加入5ml完全培养基进行培养。

(1-5)每天用显微镜观察速殖子增殖与裂解情况。当大部分HeLa细胞被虫体裂解，并且速殖子活力比较好的时候，就可以吸取1ml含有速殖子的细胞培养上清，1500rpm/min离心5min。用1～2ml完全培养基重悬沉淀，并加入到新鲜HeLa细胞中。

(1-6)可以保留一部分含有速殖子的细胞培养液可以在4℃冰箱中保存一周，用于下次传代培养。

(1-7)剩余的含有速殖子的培养液冻存在﹣80℃冰箱中，用于提取抗原。

(1-8)将冻存在﹣80℃冰箱中含有速殖子的培养液放在4℃冰箱中融化。

(1-9)准备过滤用的滤器和0.22μm的滤膜，滤器用酒精浸泡30min，再用紫外灯照30min。滤膜用紫外灯照30min。

(1-10)将融化好的培养液以4℃，2000rpm/min，离心10分钟。

(1-11)弃上清，用20ml无菌PBS重悬。

(1-12)取5ml重悬液体放入15ml离心管中，用5ml无菌注射器反复吹打，使细胞中的速殖子释放，吹打好的液体转入50ml离心管中。

(1-13)过0.22μm的无菌滤膜，过滤的液体转入新的50ml离心管中。

(1-14)过滤液以4℃，2000rpm/min的速度离心30分钟后，弃上清。用2ml无菌PBS重悬。

(1-15)将重悬液放在4℃和﹣20℃反复冻融3次，然后以350瓦的功率进行超声破碎。超声3秒，间隔3秒，60次为一个循环。每个循环间隔10分钟，一共4个循环。

(1-16)将产物置于4℃，12000rpm/min，离心20分钟，吸取上清为弓形虫速殖子抗原。分装后于﹣20℃保存备用。

(2)STAg注射造模

(2-1)在E14.5天给孕鼠腹腔注射90μg的STAg，同等体积的无菌PBS作为对照组注射。

(2-2)将实验小鼠分为以下四组：PBS，STAg，STAg+Sitagliptin，STAg+Pioglitazone。

(3)子代小鼠进行孤独症相关行为学检测。

(3-1)如图1a所示，孤独症病鼠[STAg组]与同年龄陌生小鼠(7-8周龄)的社交互动时间(social interaction time)显著低于健康对照小鼠(PBS组)。类似地，如图1b所示，孤独症病鼠[STAg组]与幼年陌生小鼠(3～4周龄)的社交互动时间(social interactiontime)显著低于健康对照小鼠(PBS组)。

(3-2)如图2a～2b所示所示，孤独症病鼠[STAg组]嗅探三厢社交实验中的空笼(E)的时间与嗅探装有陌生鼠(S1)笼子的时间无显著差异。而健康对照小鼠(PBS组)用于嗅探装有陌生鼠(S1)笼子的时间则显著大于嗅探空笼(E)的时间。

(3-3)如图3a所示，孤独症病鼠[STAg组]用于重复梳理动作(grooming)的时间与健康对照小鼠(PBS组)相比显著增加。此外，如图3b所示，孤独症病鼠[STAg组]埋弹珠(marble burying)的次数显著高于健康对照小鼠(PBS组)。说明该病鼠有重复刻板动作的症状。

(3-4)如图4a所示，在旷场实验(open filed)中孤独症病鼠[STAg组]处于旷场中心的时间(time spent in center)显著低于健康对照小鼠(PBS组)。说明该病鼠有焦虑症状。如图4b所示，在十字高架迷宫(elevated plus maze)实验中，孤独症病鼠[STAg组]处于开臂的时间(time spent in open arms)显著低于健康对照小鼠(PBS组)。说明该病鼠有焦虑症状。

(4)针对上述孤独症病鼠，采用多种药物进行治疗，以筛选有效药物。

(4-1)如图1a所示，孤独症病鼠[STAg组]接受PBS、西格列汀、吡格列酮腹腔注射(100mg/kg)治疗后3周，结果发现西格列汀[STAg+Sitagliptin]、吡格列酮[STAg+Pioglitazone]输注治疗的病鼠的社交互动时间则显著上调，接近健康对照组。说明西格列汀以及吡格列酮治疗可以有效缓解孤独症的社交互动缺陷，而且吡格列酮比西格列汀的治疗效果要明显。类似地，如图1b所示，孤独症病鼠[STAg组]接受PBS、西格列汀、吡格列酮腹腔注射(100mg/kg)治疗后3周，结果发现西格列汀[STAg+Sitagliptin]、吡格列酮[STAg+Pioglitazone]输注治疗病鼠的的社交互动时间则显著上调，接近健康对照组。再次说明西格列汀以及吡格列酮可以有效缓解孤独症的社交互动缺陷，且吡格列酮比西格列汀的治疗效果要明显。

(4-2)如图2a～2b所示，孤独症病鼠[STAg组]接受PBS、西格列汀、吡格列酮腹腔注射(100mg/kg)治疗后3周，结果发现西格列汀[STAg+Sitagliptin]、吡格列酮[STAg+Pioglitazone]输注治疗后小鼠的嗅探空笼(E)和嗅探装有陌生鼠(S1)笼子的时间则接近于健康对照组。说明西格列汀以及吡格列酮治疗能够有效缓解孤独症的社交互动缺陷。

(4-3)如图3a所示，孤独症病鼠[STAg组]接受PBS、西格列汀、吡格列酮腹腔注射(100mg/kg)治疗后3周，结果发现西格列汀[STAg+Sitagliptin]、吡格列酮[STAg+Pioglitazone]输注治疗后小鼠用于重复梳理动作的时间则接近于健康对照组。说明西格列汀以及吡格列酮治疗可以有效缓解孤独症的重复刻板行为的症状，而且吡格列酮比西格列汀的治疗效果要明显。

(4-4)如图3b所示，孤独症病鼠[STAg组]接受PBS、西格列汀、吡格列酮腹腔注射(100mg/kg)治疗后3周，结果发现西格列汀[STAg+Sitagliptin]、吡格列酮[STAg+Pioglitazone]输注治疗后小鼠埋弹珠的次数则接近于健康对照组。说明西格列汀以及吡格列酮治疗可以有效缓解孤独症的重复刻板行为的症状。

(4-5)如图4a所示，在旷场实验(open filed)中孤独症病鼠[STAg组]接受PBS、西格列汀、吡格列酮腹腔注射(100mg/kg)治疗后3周，结果发现西格列汀[STAg+Sitagliptin]、吡格列酮[STAg+Pioglitazone]输注治疗后小鼠处于旷场中心的时间则接近于健康对照组。说明西格列汀以及吡格列酮治疗可以有效缓解孤独症伴发的焦虑症状。如图4b所示，在十字高架迷宫(elevated plus maze)实验中，孤独症病鼠[STAg组]接受PBS、西格列汀、吡格列酮腹腔注射(100mg/kg)治疗后3周，结果发现西格列汀[STAg+Sitagliptin]、吡格列酮[STAg+Pioglitazone]输注治疗后小鼠处于开臂的时间则接近于健康对照组。说明西格列汀以及吡格列酮治疗可以有效缓解孤独症伴发的焦虑症状。

综上，(1)采用本发明中STAg可有效构建孤独症小鼠模型的社会交流障碍、重复刻板行为及孤独症常见伴发的焦虑症状；(2)STAg构建的孤独症小鼠模型可应用于药物筛选。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。