一种曲唑酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种曲唑酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。

背景技术

曲唑酮为抗抑郁药。用于治疗各种类型的抑郁症和伴有抑郁症状的焦虑症以及药物依赖者戒断后的情绪障碍。服用曲唑酮常见不良反应为嗜睡、疲乏、头昏、失眠、紧张和震颤等；以及视物模糊、口干、便秘。少见体位性低血压(进餐时同时服药可减轻)、心动过速、恶心、呕吐和腹部不适。极少数病人出现肌肉骨骼疼痛和多梦。

临床研究中曾报道一些不良反应可能与盐酸曲唑酮的使用有关：静坐不能、过敏反应、贫血、胃胀气、排尿异常、性功能障碍和月经异常等。

目前，对曲唑酮的检测主要依靠气相色谱-质谱联用法（GC-MS)、液相色谱四级杆飞行时间质谱仪（Q-TOF LC/MS）、核磁共振氢谱（H NMR）、核磁共振碳谱（13C NMR）、核磁共振氟谱（19F NMR）、红外光谱（IR）等方法，但都存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作的缺点，不能达到现代检测对快速、准确的要求。因此建立快速、灵敏、准确的检测技术是很有必要的。

免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。但是，由于包括曲唑酮在内的大多数小分子化合物（分子量小于1000），不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，故小分子物质被称为半抗原。通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位置上带上端部为活性基团的连接臂，再与大分子载体结合，生成半抗原-载体偶联物（即人工抗原），人工抗原可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。

现有技术中还未有曲唑酮人工半抗原、人工抗原的相关报道。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中对曲唑酮的检测存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作的缺点，不能达到现代检测对快速、准确的要求，提供了一种曲唑酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用以克服上述缺陷。

为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：

本发明的第一个目的在于提供了一种曲唑酮人工半抗原，

其分子结构式如（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）。

本发明中的曲唑酮人工半抗原其通过将曲唑酮的特征结构进行修饰，在远离其主要活性基团的端位上引入了新的活性基团，这样既可以最大限度的保留其特征结构，又提供了可以与载体蛋白偶联的活性位点，可作为抗原决定簇。

本发明的第一个目的在于提供了一种曲唑酮人工半抗原的制备方法，

包括以下步骤：

（1）将吡啶三唑酮与氢化钠反应，反应结束后与一氯三碘丙烷继续反应，得到产物A；

（2）将产物A与1-（3-甲氧基苯基）哌嗪盐酸盐反应，得到黄色油状物B；

（3）将黄色油状物B加酸水解，得到白色轻质固体C；

（4）将白色轻质固体C与氢化钠、溴乙酸乙酯反应，得到黄色油状物D；

（5）将黄色油状物D与碱液发生水解反应，反应结束后，调节溶液pH至酸性，经萃取纯化后得到白色固体Ⅰ，即权利要求1所述的曲唑酮人工半抗原。

通过上述方法，在曲唑酮的卤素位点上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能较大程度地保留曲唑酮的特征结构，又提供了可以与载体蛋白偶联的活性位点。

与采用环状的连接臂相比，本发明所采用的连接臂为链状，可以尽可能的降低免疫时T细胞对连接臂识别度，这样免疫得到的抗体对曲唑酮的特异性和亲合力更强。

作为优选，所述步骤（1）中：

氢化钠的物质的量与吡啶三唑酮相同，与氢化钠反应温度为70~85℃，反应时间0.5~2h；

一氯三碘丙烷的物质的量为吡啶三唑酮的1~2倍，与一氯三碘丙烷反应为95~105℃，反应时间15~24h。

作为优选，所述步骤（2）中：

产物A与1-（3-甲氧基苯基）哌嗪盐酸盐的摩尔比为1：（1~2），反应温度105~115℃，回流反应3~8小时。

作为优选，所述步骤（4）中：

氢化钠的物质的量与白色轻质固体C相同；

溴乙酸乙酯的物质的量为白色轻质固体C的1~3倍；

反应温度为55~70℃，回流反应0.5~2h。

作为优选，曲唑酮人工半抗原的制备方法具体步骤如下：

(1) 将吡啶三唑酮溶于DMF中，置于三口圆底烧瓶中，左口通入氮气，中间口接冷凝管和干燥管，右口塞橡胶塞，置于80℃油浴中，随后加入等物质的量的氢化钠，搅拌反应1小时，然后加入1.5倍物质的量的一氯三碘丙烷，升温至100℃反应6小时，缓慢冷却至室温继续搅拌反应18小时，此时反应液为黄色浊液；

结束反应，过滤得黄色澄清溶液，减压蒸干溶剂得黄色油状残渣，向黄色油状残渣中加入饱和的碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，分别用纯化水和饱和的食盐水洗涤有机相，收集有机相，干燥、过滤、减压蒸干溶剂得黄色油状物，

经柱色谱分离得到纯净的产物A。

(2) 将上步得到的纯净产物A与1-（3-甲氧基苯基）哌嗪盐酸盐按摩尔比1：1.5溶于甲苯中，再加入三乙胺，此时为土黄色透明溶液，置于111℃油浴中回流反应6小时；

结束反应，冷却至室温，分别用纯化水和饱和的食盐水洗涤反应液，收集有机相，干燥、过滤、减压蒸干得黄色油状物，再经过柱色谱分离得黄色油状物B。

(3)将上步黄色油状物溶于48%的氢溴酸中，置于100℃油浴中，回流反应4小时；结束反应，冷却至室温，减压蒸干溶剂得橙色油状残渣，向油状残渣中加入纯化水，用1N的氢氧化钠水溶液调节溶液的pH=7，过程中有大量的类白色沉淀产生，然后用乙酸乙酯萃取，收集有机相，干燥、过滤、减压蒸干溶剂得灰白色轻质固体，经薄层色谱分离得白色轻质固体C。

（4）将白色轻质固体C溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入氢化钠和2倍物质的量的溴乙酸乙酯，置于60℃的油浴中搅拌回流反应1小时，随后转移至室温搅拌反应15小时；结束反应，减压蒸干溶剂，加入纯化水和乙酸乙酯萃取，收集有机相，干燥、过滤、减压蒸干溶剂得黄色油状物D。

（5）将上步黄色油状物D溶于四氢呋喃、甲醇和1N的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌反应15小时；结束反应，减压蒸去有机溶剂，用2N的盐酸调节溶液的pH=2，用乙酸乙酯萃取，收集有机相干燥、过滤、减压蒸干溶剂得淡黄色固体，经薄层色谱分离得白色固体Ⅰ，即权利要求1所述的曲唑酮人工半抗原。

本发明的第三个目的在于，提供了一种曲唑酮人工抗原，

其分子结构式如（Ⅱ）所示：

（Ⅱ）

其中，BSA为牛血清蛋白。

本发明的第四个目的在于，提供了所述曲唑酮人工抗原的制备方法，其特征在于，

所述曲唑酮人工抗原通过活泼酯法使权利要求1所述的曲唑酮人工半抗原与牛血清蛋白结合，获得曲唑酮人工抗原。

作为优选，具体地，采用活泼酯法制备曲唑酮人工抗原时，包括以下步骤：

（a）将曲唑酮人工半抗原Ⅰ与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以摩尔比为1∶1.35~1.5∶1.35~1.5溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液；

（b）将上步上清液滴加到牛血清蛋白溶液中，混合液置于4℃下静置过夜，经透析、离心取上清液，获得曲唑酮人工抗原。

作为优选，本发明中牛血清蛋白溶液是将牛血清蛋白溶于0.01M的磷酸缓冲液中制成的。

步骤（b）中，所述牛血清蛋白溶液的浓度为5mg/ml，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5。

本发明选用的牛血清蛋白（BSA）作为大分子载体，与其他载体蛋白相比，具有以下优点：①BSA具有583个氨基酸残基，较容易与曲唑酮半抗原发生偶联，可制得不同偶联比的曲唑酮人工抗原，且具有较高的免疫原性；②BSA经济实惠，成本低；③BSA的化学性质比较稳定，在不同的pH值和离子强度下有很好的溶解度，适合长期储存。

本发明还提供了所述曲唑酮人工抗原在制备抗曲唑酮抗体中的应用。

本发明还提供了一种抗曲唑酮抗体，是由所述曲唑酮人工抗原经动物免疫得到的、可与曲唑酮发生特异性免疫反应的球蛋白。

本发明还提供了所述抗曲唑酮抗体在检测曲唑酮中的应用。

试验发现，将所述曲唑酮人工抗原免疫新西兰白兔，获得的免疫血清的效价为1∶80000。表明本发明的曲唑酮人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗曲唑酮抗体，该抗曲唑酮抗体可用于曲唑酮的免疫检测和分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的曲唑酮人工半抗原最大程度地保留了曲唑酮的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的曲唑酮人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗曲唑酮抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1∶80000，可用于对曲唑酮进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

附图说明

图1为本发明曲唑酮人工抗原的制备流程图；

其中， DMF表示N，N-二甲基甲酰胺，TEA表示三乙胺，THF表示四氢呋喃，NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺，DCC表示二环己基碳二亚胺，BSA表示牛血清蛋白，下同。

图2为本发明曲唑酮人工半抗原Ⅰ的液相色谱图；

其中，mAU表示毫吸光度单位，min表示分钟。

图3为本发明曲唑酮半抗原Ⅰ的ESI-MS分析谱图；

其中，Intens.表示信号强度；m/z表示荷质比。

图4为牛血清蛋白（BSA）、曲唑酮人工半抗原Ⅰ、曲唑酮人工抗原Ⅱ的紫外扫描图；

其中，Abs表示吸光度，WL（nm）表示波长（nm）。

图5为对比例1曲唑酮人工抗原Ⅳ的制备流程图。

图6为对比例2曲唑酮人工抗原Ⅴ的制备流程图；

其中，BGG表示牛丙种球蛋白。

图7为对比例3曲唑酮人工抗原Ⅵ的制备流程图。

图8为对比例4曲唑酮人工抗原Ⅶ的制备流程图。

图9为对比例5曲唑酮人工抗原Ⅷ的制备流程图。

图10为对比例6曲唑酮人工抗原Ⅸ的制备流程图。

图11为对比例7曲唑酮人工抗原Ⅹ的制备流程图。

具体实施方式

下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施一种曲唑酮人工抗原的制备方法（反应历程如图1），包括以下步骤：

（1）人工半抗原Ⅰ的制备：

①称取吡啶三唑酮1g（7.41mmol）于50ml三口圆底烧瓶中，加入10mlN,N-二甲基甲酰胺，左口通入氮气，中间口接冷凝管和干燥管，右口塞橡皮塞，此时溶液为黄色悬浊液，置于油浴中缓慢加热到80℃，此时溶液为黄色透明溶液。接着加入60%的氢化钠296mg（7.41mmol），此时有大量的沉淀产生，反应物继续在80℃下回流搅拌反应1小时，然后用注射器从右口缓慢加入1-氯-3-碘丙烷1.2ml（11.12mmol），随后将反应液加热至100℃回流搅拌反应6小时，最后转移至室温搅拌反应18小时，此时为橙黄色浊液。

结束反应，过滤，用2mlN,N-二甲基甲酰胺洗涤沉淀，得到的滤液被减压蒸干，得到橙黄色油状残渣，向该残渣中加入30ml饱和的碳酸氢钠溶液，用30ml*2的乙酸乙酯萃取，合并有机相，分别用30ml的纯化水和30ml饱和的食盐水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干得橙黄色油状物。

该橙黄色油状物经柱色谱分离得橙色黏稠物A821mg（3.88mmol），该柱色谱使用200目到300目的硅胶，柱子内径3cm，硅胶高度为25cm到30cm，溶剂为二氯甲烷，展开剂为乙酸乙酯：氨水=10ml：3滴，淋洗剂为乙酸乙酯：石油醚=50:1，20:1，10:1，5:1......，产物的Rf=0.7。

②将上步橙色黏稠物A821mg（3.88mmol）溶于14ml甲苯中，置于50ml单口圆底烧瓶中，为橙色透明溶液，再加入1-（3-甲氧基苯基）哌嗪盐酸盐1.330g（5.82mmol）和三乙胺1.09ml（7.76mmol），置于111℃油浴中，回流搅拌反应6小时，此时溶液为土黄色澄清溶液。

结束反应，冷却至室温，分别用30ml纯化水和20ml饱和的食盐水洗涤甲苯相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得深黄色油状物。

该深黄色油状物经柱色谱分离得深黄色油状物B625mg（1.70mmol）。该柱色谱使用200目到300目的硅胶，柱子内径3cm，硅胶高度为25cm到30cm，溶剂为二氯甲烷，展开剂为乙酸乙酯：氨水=10ml：3滴，淋洗剂为乙酸乙酯：无水乙醇=10:1，10:2，10:3......，产物的Rf=0.2。

③将上步深黄色油状物B625mg（1.70mmol）溶于13ml48%的氢溴酸中，置于50ml单口圆底烧瓶中，于100℃油浴中，回流搅拌反应4小时；结束反应，冷却至室温，减压蒸干溶剂得橙色油状残渣，加入13ml纯化水，用1N的氢氧化钠水溶液调节溶液的pH=7，过程中有大量的类白色沉淀产生，然后用20ml*4乙酸乙酯萃取，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干溶剂得灰白色轻质固体，该固体经薄层色谱（溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为乙酸乙酯：乙醇=10:1，产物Rf=0.3）分离得白色轻质固体C472mg（1.34mmol）。

④将上步白色轻质固体C472mg（1.34mmol）置于50ml单口圆底烧瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺5ml，再加入60%氢化钠53mg（1.34mmol）和溴乙酸乙酯297μL（2.68mmol），置于60℃的油浴中搅拌回流反应1小时，随后转移至室温搅拌反应15小时；结束反应，减压蒸干溶剂，得到淡黄色油状物，加入20ml纯化水，用20ml*3乙酸乙酯萃取，取有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干溶剂得淡黄色油状物D418mg（0.95mmol）。

⑤将上步淡黄色油状物D418mg（0.95mmol）置于50ml单口圆底烧瓶中，加入8.5ml四氢呋喃、6ml甲醇和21.5ml1N的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌反应15小时；结束反应，减压蒸去有机溶剂，用2N的盐酸调节溶液的pH=2，用20ml*3乙酸乙酯萃取，收集有机相干燥、过滤、减压蒸干溶剂得淡黄色固体，经薄层色谱(溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95%乙醇：1，4-二氧六环：氨水=10:8:1:1，产物Rf=0.2)分离得白色固体Ⅰ282mg（0.69mmol），即权利要求1所述的曲唑酮人工半抗原Ⅰ。

曲唑酮人工半抗原Ⅰ的液相色谱图见图2（紫外检测器，波长220nm）。

从图2可以看出经过纯化得到的曲唑酮人工半抗原Ⅰ的纯度达到99%以上。

曲唑酮半抗原Ⅰ的ESI-MS分析谱图见图3。从图3可以看出本实施例得到的曲唑酮人工半抗原Ⅰ的分子离子峰的质荷比（m/z）为411.45，与其理论分子量吻合，可以确定步骤⑤得到的最终化合物就是本发明所设计的曲唑酮人工半抗原。

（2）曲唑酮人工抗原Ⅱ的制备：

⑥将曲唑酮人工半抗原Ⅰ282mg（0.69mmol）置于50ml圆底烧瓶中，加入 N，N-二甲基甲酰胺（DMF）14.1ml溶解，再加入N-羟基琥珀酰亚胺107mg（0.93mmol）和二环己基碳二亚胺192mg（0.93mmol），25℃搅拌反应18小时；反应结束后有大量白色沉淀产生，以10000r/min、4℃离心10分钟，弃沉淀，取上清液，备用。

⑦称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到0.01M、 pH为7.4的PBS缓冲液。

⑧称取0.350g牛血清蛋白溶于70ml 步骤⑦的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。

⑨在快速搅拌下，将步骤⑥的上清液缓慢滴加到⑧的牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。

⑩将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑦的PBS缓冲液透析7次，透析结束后，以10000r/min、4℃离心15分钟，弃沉淀，取上清液即得到人工抗原Ⅱ。

曲唑酮人工抗原Ⅱ制备前后的紫外扫描图见图4。其中，曲线a为曲唑酮人工半抗原的紫外扫描图，曲线b为牛血清蛋白的紫外扫描图，曲线c为曲唑酮人工抗原的紫外扫描图。曲唑酮人工抗原的最大吸收峰与曲唑酮半抗原和牛血清蛋白相比均出现了明显的变化，说明曲唑酮人工抗原的合成获得成功。

实施例2

本实施一种曲唑酮人工抗原的制备方法（反应历程如图1），包括以下步骤：

（1）人工半抗原Ⅰ的制备：

①称取吡啶三唑酮1g（7.41mmol）于50ml三口圆底烧瓶中，加入10mlN,N-二甲基甲酰胺，左口通入氮气，中间口接冷凝管和干燥管，右口塞橡皮塞，此时溶液为黄色悬浊液，置于油浴中缓慢加热到80℃，此时溶液为黄色透明溶液。接着加入60%的氢化钠296mg（7.41mmol），此时有大量的沉淀产生，反应物继续在70℃下回流搅拌反应2小时，然后用注射器从右口缓慢加入1-氯-3-碘丙烷0.8ml（7.41mmol），随后将反应液加热至95℃回流搅拌反应6小时，最后转移至室温搅拌反应24小时，此时为橙黄色浊液。

结束反应，过滤，用2mlN,N-二甲基甲酰胺洗涤沉淀，得到的滤液被减压蒸干，得到橙黄色油状残渣，向该残渣中加入30ml饱和的碳酸氢钠溶液，用30ml*2的乙酸乙酯萃取，合并有机相，分别用30ml的纯化水和30ml饱和的食盐水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干得橙黄色油状物。

该橙黄色油状物经柱色谱分离得橙色黏稠物A905mg（4.28mmol），该柱色谱使用200目到300目的硅胶，柱子内经3cm，硅胶高度为25cm到30cm，溶剂为二氯甲烷，展开剂为乙酸乙酯：氨水=10ml：3滴，淋洗剂为乙酸乙酯：石油醚=50:1，20:1，10:1，5:1......，产物的Rf=0.7。

②将上步橙色黏稠物A905mg（4.28mmol）溶于15.5ml甲苯中，置于50ml单口圆底烧瓶中，为橙色透明溶液，再加入1-（3-甲氧基苯基）哌嗪盐酸盐0.98g（4.28mmol）和三乙胺1.20ml（8.56mmol），置于105℃油浴中，回流搅拌反应8小时，此时溶液为土黄色澄清溶液。

结束反应，冷却至室温，分别用30ml纯化水和20ml饱和的食盐水洗涤甲苯相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得深黄色油状物。

该深黄色油状物经柱色谱分离得深黄色油状物B682mg（1.86mmol）。该柱色谱使用200目到300目的硅胶，柱子内经3cm，硅胶高度为25cm到30cm，溶剂为二氯甲烷，展开剂为乙酸乙酯：氨水=10ml：3滴，淋洗剂为乙酸乙酯：无水乙醇=10:1，10:2，10:3......，产物的Rf=0.2。

③将上步深黄色油状物B682mg（1.86mmol）溶于13ml48%的氢溴酸中，置于50ml单口圆底烧瓶中，于100℃油浴中，回流搅拌反应4小时；结束反应，冷却至室温，减压蒸干溶剂得橙色油状残渣，加入13ml纯化水，用1N的氢氧化钠水溶液调节溶液的pH=7，过程中有大量的类白色沉淀产生，然后用20ml*4乙酸乙酯萃取，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干溶剂得灰白色轻质固体，该固体经薄层色谱（溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为乙酸乙酯：乙醇=10:1，产物Rf=0.3）分离得白色轻质固体C。

④将上步白色轻质固体C500mg（1.42mmol）置于50ml单口圆底烧瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺5ml，再加入60%氢化钠56mg（1.42mmol）和溴乙酸乙酯157.3μL（1.42mmol），置于55℃的油浴中搅拌回流反应2小时，随后转移至室温搅拌反应15小时；结束反应，减压蒸干溶剂，得到淡黄色油状物，加入20ml纯化水，用20ml*3乙酸乙酯萃取，取有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干溶剂得淡黄色油状物D。

⑤将上步淡黄色油状物D445mg（1.01mmol）置于50ml单口圆底烧瓶中，加入9ml四氢呋喃、6.5ml甲醇和23ml1N的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌反应15小时；结束反应，减压蒸去有机溶剂，用2N的盐酸调节溶液的pH=2，用20ml*3乙酸乙酯萃取，收集有机相干燥、过滤、减压蒸干溶剂得淡黄色固体，经薄层色谱(溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95%乙醇：1，4-二氧六环：氨水=10:8:1:1，产物Rf=0.2)分离得白色固体Ⅰ301mg（0.74mmol），即权利要求1所述的曲唑酮人工半抗原Ⅰ。

（2）曲唑酮人工抗原Ⅱ的制备：

⑥将曲唑酮人工半抗原Ⅰ301mg（0.74mmol）置于50ml圆底烧瓶中，加入 N，N-二甲基甲酰胺（DMF）15.05ml溶解，再加入N-羟基琥珀酰亚胺128mg（1.11mmol）和二环己基碳二亚胺229mg（1.11mmol），20℃搅拌反应20小时；反应结束后有大量白色沉淀产生，以10000r/min、4℃离心10分钟，弃沉淀，取上清液，备用。

⑦称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到0.01M、 pH为7.4的PBS缓冲液。

⑧称取0.375g牛血清蛋白溶于75ml 步骤⑦的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。

⑨在快速搅拌下，将步骤⑥的上清液缓慢滴加到⑧的牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5，得到的混合液在1℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。

⑩将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑦的PBS缓冲液透析7次，透析结束后，以10000r/min、4℃离心15分钟，弃沉淀，取上清液即得到人工抗原Ⅱ。

实施例3

本实施一种曲唑酮人工抗原的制备方法（反应历程如图1），包括以下步骤：

（1）人工半抗原Ⅰ的制备：

①称取吡啶三唑酮1g（7.41mmol）于50ml三口圆底烧瓶中，加入10mlN,N-二甲基甲酰胺，左口通入氮气，中间口接冷凝管和干燥管，右口塞橡皮塞，此时溶液为黄色悬浊液，置于油浴中缓慢加热到80℃，此时溶液为黄色透明溶液。接着加入60%的氢化钠296mg（7.41mmol），此时有大量的沉淀产生，反应物继续在85℃下回流搅拌反应0.5小时，然后用注射器从右口缓慢加入1-氯-3-碘丙烷（1~2倍）1.6ml（14.82mmol），随后将反应液加热至105℃回流搅拌反应6小时，最后转移至室温搅拌反应15小时，此时为橙黄色浊液。

结束反应，过滤，用2mlN,N-二甲基甲酰胺洗涤沉淀，得到的滤液被减压蒸干，得到橙黄色油状残渣，向该残渣中加入30ml饱和的碳酸氢钠溶液，用30ml*2的乙酸乙酯萃取，合并有机相，分别用30ml的纯化水和30ml饱和的食盐水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干得橙黄色油状物。

该橙黄色油状物经柱色谱分离得橙色黏稠物A743mg（3.51mmol），该柱色谱使用200目到300目的硅胶，柱子内径3cm，硅胶高度为25cm到30cm，溶剂为二氯甲烷，展开剂为乙酸乙酯：氨水=10ml：3滴，淋洗剂为乙酸乙酯：石油醚=50:1，20:1，10:1，5:1......，产物的Rf=0.7。

②将上步橙色黏稠物A743mg（3.51mmol）溶于13ml甲苯中，置于50ml单口圆底烧瓶中，为橙色透明溶液，再加入1-（3-甲氧基苯基）哌嗪盐酸盐1.60g（7.02mmol）和三乙胺0.99ml（7.02mmol），置于115℃油浴中，回流搅拌反应3小时，此时溶液为土黄色澄清溶液。

结束反应，冷却至室温，分别用30ml纯化水和20ml饱和的食盐水洗涤甲苯相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得深黄色油状物。

该深黄色油状物经柱色谱分离得深黄色油状物B。该柱色谱使用200目到300目的硅胶，柱子内径3cm，硅胶高度为25cm到30cm，溶剂为二氯甲烷，展开剂为乙酸乙酯：氨水=10ml：3滴，淋洗剂为乙酸乙酯：无水乙醇=10:1，10:2，10:3......，产物的Rf=0.2。

③将上步深黄色油状物B568mg（1.54mmol）溶于12ml48%的氢溴酸中，置于50ml单口圆底烧瓶中，于100℃油浴中，回流搅拌反应4小时；结束反应，冷却至室温，减压蒸干溶剂得橙色油状残渣，加入13ml纯化水，用1N的氢氧化钠水溶液调节溶液的pH=7，过程中有大量的类白色沉淀产生，然后用20ml*4乙酸乙酯萃取，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干溶剂得灰白色轻质固体，该固体经薄层色谱（溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为乙酸乙酯：乙醇=10:1，产物Rf=0.3）分离得白色轻质固体C。

④将上步白色轻质固体C415mg（1.18mmol）置于50ml单口圆底烧瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺4.4ml，再加入60%氢化钠47mg（1.18mmol）和溴乙酸乙酯392μL（3.53mmol），置于70℃的油浴中搅拌回流反应0.5小时，随后转移至室温搅拌反应15小时；结束反应，减压蒸干溶剂，得到淡黄色油状物，加入20ml纯化水，用20ml*3乙酸乙酯萃取，取有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干溶剂得淡黄色油状物D。

⑤将上步淡黄色油状物D375mg（0.85mmol）置于50ml单口圆底烧瓶中，加入7.6ml四氢呋喃、5.4ml甲醇和19.3ml1N的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌反应15小时；结束反应，减压蒸去有机溶剂，用2N的盐酸调节溶液的pH=2，用20ml*3乙酸乙酯萃取，收集有机相干燥、过滤、减压蒸干溶剂得淡黄色固体，经薄层色谱(溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95%乙醇：1，4-二氧六环：氨水=10:8:1:1，产物Rf=0.2)分离得白色固体Ⅰ243mg（0.59mmol），即权利要求1所述的曲唑酮人工半抗原Ⅰ。

（2）曲唑酮人工抗原Ⅱ的制备：

⑥将曲唑酮人工半抗原Ⅰ243mg（0.59mmol）置于50ml圆底烧瓶中，加入 N，N-二甲基甲酰胺（DMF）12.2ml溶解，再加入N-羟基琥珀酰亚胺92mg（0.8mmol）和二环己基碳二亚胺165mg（0.8mmol），30℃搅拌反应18小时；反应结束后有大量白色沉淀产生，以10000r/min、4℃离心10分钟，弃沉淀，取上清液，备用。

⑦称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到0.01M、 pH为7.4的PBS缓冲液。

⑧称取0.305g牛血清蛋白溶于61ml 步骤⑦的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。

⑨在快速搅拌下，将步骤⑥的上清液缓慢滴加到⑧的牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5，得到的混合液在5℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。

⑩将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑦的PBS缓冲液透析7次，透析结束后，以10000r/min、4℃离心15分钟，弃沉淀，取上清液即得到人工抗原Ⅱ。

对比例1

本实施一种曲唑酮人工抗原的制备方法（反应历程如图5），包括以下步骤：

（1）人工半抗原Ⅲ的制备：

①称取曲唑酮200mg（0.54mmol）于50ml圆底烧瓶中，加入5ml吡啶溶解为无色透明溶液，再加入羧甲基羟胺半盐酸盐118mg （1.08mmol），置于50℃油浴中回流搅拌反应4小时；结束反应，减压蒸干溶剂得白色固油混合物，加入20ml纯化水，用30ml*3乙酸乙酯萃取，收集有机相，分别用30ml纯化水和30ml饱和的食盐水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得白色固体残渣，该白色固体残渣用经薄层色谱(溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95%乙醇：1，4-二氧六环：氨水=10:8:1:1，产物Rf=0.4)分离得白色固体Ⅲ126mg（0.28mol）即曲唑酮人工半抗原Ⅲ；

（2）曲唑酮人工抗原Ⅳ的制备：

②将曲唑酮人工半抗原Ⅲ126mg（0.28mmol）置于50ml圆底烧瓶中，加入6.3ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，再加入44mg（0.38mmol）N-羟基琥珀酰亚胺和78mg（38mmol）二环己基碳二亚胺，25℃搅拌反应18小时；反应结束后有大量白色沉淀产生，接着以10000r/min、4℃离心10分钟，弃沉淀，取上清液，备用。

③称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L、pH为7.4的PBS缓冲液。

④称取0.160g牛血清蛋白溶于32ml 步骤③的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。

⑤在室温下，将步骤②的上清液缓慢滴加到快速搅拌的④的牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5，得到的混合液在4℃条件下静置保存18小时，得到人工抗原混合液。

⑥将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤③的PBS缓冲液透析7次，透析结束后上层基本为无色透明溶液，下层聚集大量的白色沉淀，以10000r/min、4℃离心15分钟，弃沉淀，取上清液即得到人工抗原Ⅳ。

对比例2

本实施一种曲唑酮人工抗原的制备方法（反应历程如图6），包括以下步骤：

(1) 曲唑酮人工半抗原Ⅲ的制备：

①与对比例1相同。

(2) 曲唑酮人工抗原Ⅴ的制备：

②～⑥分别与对比例1相似，只是将牛血清蛋白替换为牛丙种蛋白作载体，与曲唑酮人工半抗原Ⅲ进行偶联，得到曲唑酮人工抗原Ⅴ。

对比例3

本实施一种曲唑酮人工抗原的制备方法（反应历程如图7），包括以下步骤：

(1) 曲唑酮人工半抗原Ⅲ的制备：

①与对比例1相同。

(2) 曲唑酮人工抗原Ⅵ的制备：

②称取100mg(0.22mmol) 曲唑酮人工半抗原Ⅲ置于50ml圆底烧瓶中，加入5ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入31μL(0.22mmol)三乙胺和29μL(0.22mmol)氯甲酸异丁酯 ，室温搅拌反应18小时；反应结束后有大量的白色沉淀产生，接着以10000r/min、4℃离心10分钟，弃沉淀，取上清液，备用。

③称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠、43.875g（0.75mol）氯化钠、1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L、pH为7.4的PBS缓冲液。

④称取0.125g牛血清蛋白溶于25ml 步骤③的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。

⑤在室温下，将步骤②的上清液缓慢滴加到快速搅拌的④的牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5，得到的混合液在4℃条件下静置保存18小时，得到人工抗原混合液。

⑥将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤③的PBS缓冲液透析7次，透析结束后上层基本无色透明溶液，下层聚集大量的白色沉淀，以10000r/min、4℃离心15分钟，弃沉淀，取上清液即得到曲唑酮人工抗原Ⅵ。

对比例4

本实施一种曲唑酮人工抗原的制备方法（反应历程如图8），包括以下步骤：

(1) 曲唑酮人工半抗原Ⅲ的制备：

①与对比例1相同。

(2) 曲唑酮人工抗原Ⅶ的制备：

②～⑥分别与对比例3相似，只是将牛血清蛋白替换为牛丙种蛋白作载体，与曲唑酮人工半抗原Ⅲ进行偶联，得到曲唑酮人工抗原Ⅶ。

对比例5

本实施一种曲唑酮人工抗原的制备方法（反应历程如图9），包括以下步骤：

(1) 曲唑酮人工半抗原Ⅰ的制备：

①~⑤分别与实施例1相同。

（2）曲唑酮人工抗原Ⅷ的制备：

⑥～⑩分别与实例1相似，只是将牛血清蛋白替换为牛丙种蛋白作载体，与曲唑酮人工半抗原Ⅰ进行偶联，得到曲唑酮人工抗原Ⅷ。

对比例6

本实施一种曲唑酮人工抗原的制备方法（反应历程如图10），包括以下步骤：

(1) 曲唑酮人工半抗原Ⅰ的制备：

①～⑤分别与实施例1相同。

（2）曲唑酮人工抗原Ⅸ的制备：

⑥称取100mg(0.24mmol) 曲唑酮人工半抗原Ⅰ置于50ml圆底烧瓶中，加入10ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入33μL(0.24mmol)三乙胺和31μL(0.24mmol)氯甲酸异丁酯 ，室温搅拌反应18小时；反应结束后有大量的白色沉淀产生，接着以10000r/min、4℃离心10分钟，弃沉淀，取上清液，备用。

⑦称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠、43.875g（0.75mol）氯化钠、1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L、pH为7.4的PBS缓冲液。

⑧称取0.125g牛血清蛋白溶于25ml 步骤⑥的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。

⑨室温下，将步骤⑥的上清液缓慢滴加到快速搅拌的⑧牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。

⑩将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑦的PBS缓冲液透析7次，透析结束后上层为无色透明液体，下层聚集大量白色沉淀，以10000r/min、4℃离心15分钟，弃沉淀，取上清液即得到曲唑酮人工抗原Ⅸ。

对比例7

本实施一种曲唑酮人工抗原的制备方法（反应历程如图11），包括以下步骤：

(1) 曲唑酮人工半抗原Ⅰ的制备：

①～⑤分别与实施例1相同。

（2）曲唑酮人工抗原的Ⅹ制备：

⑥～⑩分别与对比例6相似，只是将牛血清蛋白替换为牛丙种蛋白作载体，与曲唑酮人工半抗原Ⅰ进行偶联，得到曲唑酮人工抗原Ⅹ。

检测例 曲唑酮人工抗原的性能测定

（1）曲唑酮人工抗原的鉴定：

摩尔吸收系数ε：用PBS缓冲液配制配制浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的曲唑酮人工半抗原溶液，通过紫外扫描图可知曲唑酮半抗原的最大吸收波长为273nm，在273nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数（即摩尔吸收系数）的计算公式为：ε=吸光值/摩尔浓度。

偶联物蛋白浓度的测定：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml的牛血清蛋白溶液各1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将人工抗原溶液（用PBS缓冲液配制）按一定比例稀释，在655nm处测得人工抗原的吸光值，从曲线上读取人工抗原溶液的相应蛋白浓度值。

偶联比测定：配制100μg/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物（即曲唑酮人工抗原）用PBS稀释到100μg/ml，在275nm处测得吸光值A

其中ε为摩尔吸光系数（L/mol)，65000为牛血清蛋白的分子量，100×10

采用牛丙种球蛋白作为载体时，偶联比的计算式为：

γ=[(A

其中，150000为牛丙种球蛋白的分子量，100×10

表1 各曲唑酮人工抗原的偶联比和摩尔吸收系数

由表1可见，人工半抗原的结构，人工半抗原的活化方法以及载体蛋白的结构对人工半抗原与载体蛋白交联时的结合比都是有影响的。

（2）动物免疫

将制备的各曲唑酮人工抗原免疫新西兰白兔，得到的免疫血清经ELISA方法检测其效价，检测结果见表2。

表2 各免疫血清的效价检测结果

由表2可见，与实施例1相比，利用各对比例曲唑酮人工抗原进行动物免疫获得的免疫血清，其效价均偏低，不能用于免疫分析中。而利用曲唑酮人工抗原Ⅱ进行动物免疫获得的免疫血清，其效价达1∶80000，完全可用于免疫分析中，能为曲唑酮的检测提供更加方便快速准确的途径。