一种基于中空微纤维的器官芯片的制备方法及器官芯片

技术领域

本发明涉及器官芯片领域，尤其涉及一种基于中空微纤维的器官芯片的制备方法及器官芯片。

背景技术

器官芯片是近年来开发的一种直接预测人类反应的新型药物建模、测试平台，是由光学透明的塑料、玻璃或柔性聚合物(例如聚二甲基硅氧烷PDMS)等制备的细胞培养设备，包括由活细胞组成的灌注空心微通道，通过体外重建组织和器官的结构和功能，来重现体内器官的生理和病理特征。由于能够概况器官和组织的关键功能，器官芯片在毒性评估、疾病建模、药物评价等领域的作用日益凸显。

一般而言，器官芯片是将细胞培养在微孔网膜上或微流控芯片的基片上，这样形成的器官芯片，细胞基本是在二维平面延展生长，而与细胞的三维实际生存环境有差异，从而影响体外重建组织和器官的功能模拟，进而影响基于器官芯片进行的生物及医学研究的可信度。

发明内容

本发明实施方式提供一种基于中空微纤维的器官芯片的制备方法及器官芯片，以至少解决相关技术中存在的问题之一。为实现该目的，本发明通过以下技术方案实现。

本发明实施方式一方面提供一种基于中空微纤维的器官芯片的制备方法，包括：步骤1：使用微流体纺丝法制备中空微纤维，所述中空微纤维包括用于输送液体的中空孔道和用于细胞培养的纤维管壁，并将内皮细胞培养于所述纤维管壁中；步骤2：制备微流控芯片，所述微流控芯片包括进液口、出液口和至少一个腔室；步骤3：在所述微流控芯片的至少一个腔室内固定至少一根所述中空微纤维，并将生物水凝胶加入至所述微流控芯片的至少一个腔室内；步骤4：对所述微流控芯片进行紫外光照射，使得所述生物水凝胶固化，以将所述中空微纤维与所述微流控芯片组装，得到基于中空微纤维的器官芯片。

进一步的，所加入的生物水凝胶中添加有微组织、细胞系或原代细胞。

进一步的，在所述基于中空微纤维的器官芯片的进液口和/或出液口注入细胞培养基、大分子或小分子溶液，所述溶液流经所述中空孔道经由所述纤维管壁进入到所述微流控芯片的腔室内，对存在于所述生物水凝胶中的所述微组织、细胞系或原代细胞进行培养、刺激或功能性检测。

进一步的，步骤3包括：在所述微流控芯片的至少一个腔室内通过三维打印或手动拼装的方式固定至少一根所述中空微纤维。

进一步的，所述生物水凝胶包括：PEGDA、GELMA中一种或多种，或者PEGDA、GELMA中一种或多种与胶原的混合物。

进一步的，所述中空微纤维的两端部分别与所述微流控芯片的所述进液口和所述出液口相连接。

进一步的，所述大分子溶液包括：生长因子、葡聚糖溶液，所述小分子溶液包括：荧光染料、葡萄糖、药物化合物溶液。

进一步的，步骤1中使用微流体纺丝法制备中空微纤维，包括：步骤11：制备嵌套毛细管组或微流控芯片一，所述嵌套毛细管组或微流控芯片一包括：核心流通道、反应液通道、鞘流液通道；步骤12：将所述嵌套毛细管组或微流控芯片一固定在移动平台上；步骤13：在所述核心流通道中注入不与所述反应液通道中的反应液发生化学反应的惰性液体；在所述反应液通道中注入GELMA和海藻酸钠的混合液；在所述鞘流液通道中注入氯化钙水溶液；步骤14：控制所述移动平台带动所述嵌套毛细管组或微流控芯片一移动以制备预定形状的中空微纤维，其中，所述氯化钙水溶液和所述GELMA和海藻酸钠的混合液混合发生交联反应生成实心微纤维，所述惰性液体用于在所述实心微纤维中生成中空孔状结构。

进一步的，所述惰性液体包括水或PVA(聚乙烯醇)水溶液。

本发明实施方式另一方面提供一种根据上述基于中空微纤维的器官芯片的制备方法制备的器官芯片。

本发明技术方案相对于现有技术，具有以下有益效果：

(1)本发明实施例提供一种微流控芯片与中空微纤维的高阶组装方法，通过将微流体纺丝技术制备而得的中空微纤维打印至微流控芯片的腔室内，并将生物水凝胶预聚液滴加入微流控芯片的腔室内，采用紫外曝光方式将生物水凝胶迅速固化，得到基于中空微纤维的器官芯片。其中，中空微纤维的中空孔道可用于大分子或小分子的运输，中空微纤维的纤维管壁中可添加生物细胞，经培养后用于模拟血管，允许载有大分子或小分子的溶液经过模拟血管进入微流控芯片的腔室，对微流控芯片腔室内存在于生物水凝胶中的细胞/微组织进行长期三维培养、刺激和功能性检测。

(2)根据本发明实施例的基于中空微纤维的器官芯片将微纤维的灵活可控和生物相容性好的优点与微流控芯片易于集成、灵活组合的优点相结合，可以将细胞培养在中空纤维管壁内和生物水凝胶中，充分模拟细胞培养于体内的三维真实生理环境，细胞能够在三维环境下生长，并且水凝胶能够模拟细胞外基质，有利于细胞黏附以及为细胞输送新陈代谢所需养料提供更佳场所，且更符合细胞在生命体中的生理状态。从而有利于建立简便、高效的病理/生理模型，为药物评价、耐药研究等提供新的研究平台。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1的基于中空微纤维的器官芯片的制备方法的示意图；

图2为本发明实施例2的罗丹明B和10kDa Alexa Fluor

图3为本发明实施例3的控制组(A)和实验组(B)中胰岛微组织孵育2小时后Insulin表达的免疫荧光图像；

图4为本发明实施例4的控制组(A)和实验组(B)中神经细胞培养7天后β-TubulinⅢ和F-actin和表达的荧光图像。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。以下各个实施例的划分是为了描述方便，不应对本发明的具体实现方式构成任何限定，各个实施例在不矛盾的前提下可以相互结合相互引用。

实施例1

本发明实施例提供一种基于中空微纤维的器官芯片的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：

步骤1：使用微流体纺丝法制备中空微纤维，中空微纤维包括用于输送液体的中空孔道和用于细胞培养的纤维管壁，并将内皮细胞培养于纤维管壁中，如图1中箭头1和2所示。

具体的，可以采用微流控芯片方式或嵌套毛细管方式制备中空微纤维，包括：

步骤11：制备至少包含有核心流通道、反应液通道和鞘流液通道、液体进口和液体出口的嵌套毛细管组或微流控芯片一；

步骤12：将嵌套毛细管组或微流控芯片一固定在移动平台上，例如三维打印细胞悬臂；

步骤13：通过液体进口在核心流通道中持续灌注不与反应液发生化学反应的惰性液体，可以是水、PVA(聚乙烯醇)水溶液、

步骤14：控制移动平台带动嵌套毛细管组或微流控芯片一移动以制备预定形状的中空微纤维，其中，氯化钙水溶液和GELMA和海藻酸钠的混合液混合发生交联反应生成实心微纤维，核心流通道中的惰性液体用于在实心微纤维中进一步生成中空孔状结构。

步骤2：制备微流控芯片，微流控芯片包括进液口、出液口和至少一个腔室。如图1中箭头3所示，在本实施例中，微流控芯片中包含一个腔室及进液口和出液口。微流控芯片可以采用光刻或三维打印的方法制备，为本领域公知的方法，在此不具体赘述。

步骤3：在微流控芯片的至少一个腔室内固定至少一根中空微纤维，并将生物水凝胶加入至微流控芯片的至少一个腔室内。如图1中箭头3所示，在腔室中通过三维打印或手动拼接的方式固定一根中空微纤维。若采用三维打印方式实现中空微纤维的固定，则可将制备中空微纤维的微流控芯片一的液体出口固定于微流控芯片的腔室上方，然后由三维打印机实现中空纤维的三维打印。在本实施例中，中空微纤维的两端部分别与微流控芯片的进液口和所述出液口相连接，并滴加生物水凝胶至腔室中。生物水凝胶为可紫外光交联的水凝胶，具体包括：PEGDA(聚乙二醇二丙烯酸酯)、GELMA(甲基丙烯酸酯化明胶)中的一种或多种，或者PEGDA、GELMA中的一种或多种与胶原的混合物。在本实施例中，生物水凝胶中可添加经提取或体外培养的微组织、细胞系或原代细胞。

步骤4：对微流控芯片进行紫外(UV)光照射，使得生物水凝胶固化，以将中空微纤维与微流控芯片组装，得到基于中空微纤维的器官芯片，如图1中箭头3所示。在本实施例中，如图1中箭头4所示，在制得的基于中空微纤维的器官芯片的进液口和/或出液口注入细胞培养基、大分子(如生长因子、葡聚糖)或小分子(如荧光染料、葡萄糖、药物化合物)溶液，溶液流经中空孔道经由纤维管壁进入到微流控芯片的腔室内，对存在于生物水凝胶中的微组织、细胞系或原代细胞进行培养、刺激或功能性检测。其中，细胞培养基主要用于对微组织、细胞系或原代细胞进行培养，大分子和小分子物质用于对微组织、细胞系或原代细胞进行刺激或功能性检测。

本实施例另一方面提供一种根据上述基于中空微纤维的器官芯片的制备方法制备的器官芯片。

实施例2

在本实施例中，利用实施例1制备的基于中空微纤维的器官芯片进行小/大分子物质加入该器官芯片中的扩散评价实验。图2为本发明实施例2的罗丹明B和10kDa AlexaFluor

实施例3

在本实施例中，在利用实施例1制备的基于中空微纤维的器官芯片中建立控制组和实验组对比和探究葡萄糖(Glucose)对器官芯片中胰岛微组织的诱导作用，以及探讨负载小鼠胰岛内皮细胞(MS1)的微纤维是否具有一定的屏障功能。将葡萄糖通过中空微纤维进入到微流控芯片的腔室内，腔室内负载于水凝胶中的胰岛微组织在高糖刺激下分泌胰岛素，对胰岛微组织进行胰岛素(Insulin)的免疫荧光染色并表征。如图3(A)中Insulin表达的荧光图像所示，在控制组中，葡萄糖直接作用于负载于水凝胶中的胰岛微组织(Glucose-/Glucose+)，孵育2小时后，Insulin表达阳性。而无葡萄糖刺激的负载于水凝胶中的胰岛微组织Insulin表达阴性，这说明了胰岛微组织在水凝胶中能够保持良好的细胞生长和胰岛素分泌功能。如图3(B)中Insulin表达的荧光图像所示，在实验组中，当葡萄糖通过没有负载MS1细胞的中空微纤维扩散至微流控芯片腔室中(Glucose+MS1-)，负载于器官芯片内水凝胶的胰岛微组织经过高糖刺激正常分泌胰岛素，荧光强度较强；但是当葡萄糖通过有负载MS1细胞的中空微纤维扩散至微流控芯片腔室中(Glucose+MS1+)，负载于器官芯片内水凝胶的胰岛微组织胰岛素分泌受阻，荧光强度减弱；这说明负载内皮细胞的中空微纤维具有一定的屏障功能，导致胰岛素分泌受阻。

实施例4

在本实施例中，在利用实施例1制备的基于中空微纤维的器官芯片中建立控制组和实验组，对比和探究神经生长因子(NGF)对器官芯片中神经细胞的诱导作用，以及探讨负载人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的微纤维是否具有一定的屏障功能。神经细胞会在神经生长因子的诱导下会产生分化反应，表现出神经突触生长。实验将中空微纤维组装于微流控芯片中，NGF通过中空微纤维进入到微流控芯片的腔室内，腔室内负载于水凝胶中的神经细胞在NGF的作用下进行神经分化，对神经细胞进行细胞骨架肌动蛋白(F-actin)染色和神经分化的相关标志物β-TubulinⅢ免疫荧光染色表征。如图4(A)中F-actin和β-TubulinⅢ表达的荧光图像所示，在控制组中，NGF直接作用于负载于水凝胶中的神经细胞(NGF-/NGF+)，培养7天后，神经突触生长明显。而无NGF作用的负载于水凝胶中的神经细胞不会进行神经分化，这说明了NGF在神经细胞神经分化以及突触生长中发挥了关键作用，并且神经细胞在水凝胶中能够保持良好的细胞生长和分化功能。如图4(B)中F-actin和β-TubulinⅢ表达的荧光图像所示，在实验组中，当NGF通过没有负载HUVEC细胞的中空微纤维扩散至微流控芯片腔室中(NGF+HUVEC-)，负载于器官芯片内水凝胶的神经细胞经过NGF的诱导进行神经分化，突触生长；但是当NGF通过有负载HUVEC细胞的中空微纤维扩散至微流控芯片腔室中(NGF+HUVEC+)，负载于器官芯片内水凝胶的神经细胞神经分化受阻，突触长度小于10μm；这说明了负载内皮细胞的中空微纤维具有一定的屏障功能，导致突触生长受阻。

本发明实施例提供一种微流控芯片与中空微纤维的高阶组装方法，通过将微流体纺丝技术制备而得的中空微纤维打印至微流控芯片的腔室内，并将生物水凝胶预聚液滴加入微流控芯片的腔室内，采用紫外曝光方式将生物水凝胶迅速固化，得到基于中空微纤维的器官芯片。利用该器官芯片，可以将细胞培养在中空纤维管壁内和生物水凝胶中，充分模拟细胞培养于体内的三维真实生理环境，从而建立简便、高效的病理/生理模型，为药物评价、耐药研究等提供新的研究平台。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。