RNA构建体及其用途

本申请根据35U.S.C.§119要求以下每项申请的优先权，其中每项申请的公开内容整体援引加入本文：2020年4月22日提交的国际申请号PCT/EP20/61239；以及2020年6月18日提交的国际申请号PCT/EP20/66968。

背景技术

使用RNA多核苷酸作为治疗剂是一个新兴的领域。

发明内容

本公开确定了某些可能与RNA疗法相关的挑战。

例如，在一些实施方案中，本公开确定了在表达RNA治疗剂编码的多肽时可能遇到的某些问题的来源。其中，本公开提供用于提高编码有效负载的RNA的翻译效率和/或RNA编码的多肽有效负载的表达的技术。在一些实施方案中，可以用RNA多核苷酸提高翻译效率和/或RNA编码的有效负载的表达，所述RNA多核苷酸包含：Cap1结构(例如，m

在一些实施方案中，本公开指出，靠近5’帽(例如，5’Cap1结构)的特定序列的特性可以影响相关有效负载的翻译效率。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本公开提出，eIF4E与IFIT1竞争结合至RNA多核苷酸，这是基于5’帽下游的一个或多个核苷酸的特性，例如，如本文公开的帽近端序列。在一些实施方案中，本公开证实，5’帽(例如，5’Cap 1结构)下游的AGAAU或AGCAC序列可以提高翻译。本公开提出，这种序列(例如，AGAAU或AGCAC)的存在可以增加eIF4E结合，至少相对于IFIT1而言。

可选地或额外地，本公开记录了在编码有效负载的RNA多核苷酸中避免(例如，确保不存在)自杂交序列(在某些情况下，其可以称作自互补序列)的某些优点。例如，本公开证实，这种不存在可以提高相关的(例如，RNA编码的)有效负载的翻译(例如，翻译效率)，和/或对于相关的(例如，RNA编码的)有效负载的翻译(例如，翻译效率)是必需的，和/或对于由此编码的多肽表达是必需的。在不希望受理论束缚的情况下，据信自杂交序列(特别是与Kozak序列、5’UTR元件和/或3’UTR元件内的序列或者包含一个或多个Kozak序列、5’UTR元件和/或3’UTR元件的序列杂交的序列)会干扰翻译的一个或多个方面。例如，在一些实施方案中，有人提出这种自杂交可以通过自杂交至所述RNA多核苷酸中的互补序列来抑制转录和/或翻译因子与RNA多核苷酸的结合。

进一步可选地或额外地，在一些实施方案中，本公开定义了特定脂质组分，和/或其比例，所述组分在向受试者给药(例如，通过注射，如通过肌肉内注射或通过静脉内注射)时可能在递送核酸，特别是RNA(例如，治疗性RNA或其他编码多肽的RNA)中特别有用或有效。例如，在一些实施方案中，本公开证实，脂质ALC-0315对于如本文所述的递送异常和特别有用。

本文特别公开了一种组合物或药物制品，其包含RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含：(i)5’帽，是或包含cap1结构，例如，如本文公开的；(ii)包含帽近端序列的5’UTR序列，例如，如本文公开的；以及(iii)编码有效负载的序列。本文还公开了制备和使用它们的方法，例如，在受试者中诱导免疫应答。

本文提供一种包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品，所述RNA多核苷酸包含：

包含Cap1结构的5’帽；包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

(i)所述Cap1结构包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeN

(ii)所述帽近端序列包含Cap1结构的N

(a)选自以下的序列：A

(b)包含X

其中X

其中Y

本公开还提供一种组合物或药物制品，其包含RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含：5’帽；包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

(i)所述5’帽包含Cap1结构，所述Cap1结构包含G*ppp(m

N1是RNA多核苷酸的+1位置，N

G*包含以下结构：

其中

(ii)所述帽近端序列包含Cap1结构的N

(a)选自以下的序列：A

(b)包含X

其中X

其中Y

本文还提供一种组合物或药物制品，其包含RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含：

包含Cap1结构的5’帽；包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

(i)所述Cap1结构包含m7(3’OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA

(ii)所述帽近端序列包含Cap1结构的A

本公开提供一种组合物或药物制品，其包含编码基因产物的加帽RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含式：

其中R

其中B

其中，当向受试者给药RNA多核苷酸时，在给药后约6小时和在给药后约48小时，编码的基因产物的表达水平相差不超过5倍。

本文提供一种包含本文公开的RNA多核苷酸的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含本文公开的组合物或药物制品。

本文还提供一种制造药物组合物的方法，例如，包含本文公开的RNA多核苷酸，所述方法是通过将RNA多核苷酸与脂质组合以形成包封所述RNA的脂质纳米颗粒。

本公开提供一种适合产生cap1加帽RNA的核酸模板，其中从所述核酸模板的模板链转录的前五个核苷酸包含序列N

本文提供体外转录反应体系(reaction)，包括：

(i)模板DNA，其包含与本文公开的RNA多核苷酸序列互补的多核苷酸序列；

(ii)聚合酶；以及

(iii)RNA多核苷酸。

本文还提供一种从提供的体外转录反应体系分离的RNA多核苷酸。

本公开提供一种制备加帽RNA的方法，所述方法包括，在帽结构的存在下转录核酸模板，其中所述帽结构包含G*ppp(m

其中N

其中核酸模板的+3位置是任何核苷酸，优选T或G；核酸模板的+4位置是任何核苷酸；并且核酸模板的+5位置是任何核苷酸，

其中G*包含以下结构：

其中

本文还提供一种包含DNA多核苷酸的组合物，所述DNA多核苷酸包含与本文提供的RNA多核苷酸序列互补的序列。在一些实施方案中，本文公开的DNA多核苷酸可以用来转录本文公开的RNA多核苷酸。

本公开提供一种方法，包括：向受试者给药药物组合物，所述药物组合物包含配制在脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合体(lipoplex)(LPX)颗粒中的本文公开的RNA多核苷酸，例如，如本文公开的。

本文还提供一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给药药物组合物，所述药物组合物包含配制在脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合体(LPX)颗粒中的本文公开的RNA多核苷酸，例如，如本文公开的。

本文提供一种对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法通过施用药物组合物，所述药物组合物包含配制在脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合体(LPX)颗粒中的本文公开的RNA多核苷酸，例如，如本文公开的。

本公开提供一种减少与RNA多核苷酸的IFIT1相互作用的方法，所述RNA多核苷酸包含5’帽以及包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，所述方法包括以下步骤：

提供RNA多核苷酸的变体，其与亲本RNA多核苷酸的不同之处在于帽近端序列内一个或多个残基的取代，以及

确定相对于亲本RNA多核苷酸，所述变体与IFIT1的相互作用减少。

本文还提供一种制备多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

提供RNA多核苷酸，其包含5’帽，包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，以及编码有效负载的序列；

其中RNA多核苷酸的特征在于，当在给药RNA多核苷酸或包含RNA多核苷酸的组合物的生物体中进行评价时，相对于适当的参考比较物，观察到有效负载的表达升高和/或表达持续时间增加。

本文提供一种增加RNA多核苷酸可译性的方法，所述RNA多核苷酸包含5’帽，包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，以及编码有效负载的序列，所述方法包括以下步骤：

提供RNA多核苷酸的变体，其与亲本RNA多核苷酸的不同之处在于帽近端序列内一个或多个残基的取代；以及

确定所述变体的表达相对于亲本RNA多核苷酸的表达有增加。

本文提供一种治疗性RNA，其包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：

在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的X，在RNA多核苷酸的+2位置的X，在RNA多核苷酸的+3位置的X，在RNA多核苷酸的+4位置的X，以及在RNA多核苷酸的+5位置的X，当以LNP制剂向受试者给药时，证实增加RNA的表达。在一些实施方案中，X选自A、C、G或U。

本公开提供一种治疗性RNA，其包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的X，在RNA多核苷酸的+2位置的X，在RNA多核苷酸的+3位置的C，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的X，当以LNP制剂向受试者给药时，证实增加RNA的表达。在一些实施方案中，X选自A、C、G或U。

本文还提供治疗性RNA，其包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的A，在RNA多核苷酸的+2位置的G，在RNA多核苷酸的+3位置的A，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的U，当以LNP制剂向受试者给药时，证实增加RNA的表达。

本公开提供一种增加RNA多核苷酸翻译的方法，所述RNA多核苷酸包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的X，在RNA多核苷酸的+2位置的X，在RNA多核苷酸的+3位置的A，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的X。在一些实施方案中，X选自A、C、G或U。

本文提供一种增加RNA多核苷酸翻译的方法，所述RNA多核苷酸包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的X，在RNA多核苷酸的+2位置的X，在RNA多核苷酸的+3位置的C，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的X。在一些实施方案中，X选自A、C、G或U。

本文还提供一种增加RNA多核苷酸翻译的方法，所述RNA多核苷酸包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的A，在RNA多核苷酸的+2位置的G，在RNA多核苷酸的+3位置的A，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的U。

本文还提供一种为包含5’帽、帽近端序列和有效负载序列的RNA多核苷酸提供框架的方法，所述方法包括以下步骤：

评价RNA多核苷酸的至少两个变体，其中：

每个变体包括相同的5’帽和有效负载序列；以及

所述变体在帽近端序列的一个或多个特定残基处彼此不同；

其中所述评价包括确定有效负载序列的表达水平和/或表达持续时间；以及

选择5’帽和帽近端序列的至少一个组合，所述组合相对于至少一个其他组合表现出升高的表达。

附图说明

图1证明用小鼠EPO(mEPO)mRNA构建体向小鼠静脉内给药后6、24、48和72小时EPO的血浆水平，所述构建体在3’UTR序列中存在或不存在Lig3。给药后6、24、48和72小时收集血液，并且通过ELISA分析样品的mEPO水平。

图2A-2C是Lig3序列与5’UTR(图2A-2B)或3’UTR(图2C)自杂交的示意图。

图3A-3I是可以并入mRNA的5’帽的结构。

图4证明用mEPO mRNA构建体向小鼠静脉内给药后6、24、48和72小时的血浆水平，所述构建体在+3、+4或+5位置具有不同核苷酸。给药后6、24、48和72小时收集血液，并且通过ELISA分析样品的mEPO水平。

图5证明用BNT162a1免疫后7、14、21和28天的抗S蛋白IgG应答。将BALB/c小鼠用1、5或10μg的LNP配制的RBL063.3 IM免疫一次。在免疫后第7、14、21和28天，将动物放血并分析血清样品中通过ELISA测量的抗S1(左)和抗RBD(右)抗原特异性免疫球蛋白G(IgG)的总量。对于第7天、第14天、第21天和第28天，图中包括1:100的血清稀释度的值。图中的一个点代表一只小鼠，每只小鼠样品均一式两份进行测量(组大小n＝8；各组包括平均值+SEM)。

图6证明用BNT162b1免疫后7、14、21和28天的抗S蛋白IgG应答。将BALB/c小鼠用0.2、1或5μg的LNP配制的RBP020.3 IM免疫一次。在免疫后第7、14、21和28天，将动物放血并分析血清样品中通过ELISA测量的抗S1(左)和抗RBD(右)抗原特异性免疫球蛋白G(IgG)的总量。对于第7天(1:100)、第14天(1:300)、第21天(1:900)和第28天(1:2700)，图中包括不同的血清稀释度。图中的一个点代表一只小鼠，每只小鼠样品均一式两份进行测量(组大小n＝8；各组包括平均值+SEM)。

图7证明用BNT162b1免疫后14、21和28天SARS-CoV-2假病毒的中和。将BALB/c小鼠用0.2、1或5μg的LNP配制的RBP020.3 IM免疫一次。在免疫后14、21和28天，将动物放血，并且测试血清的SARS-CoV-2假病毒中和。图示出pVN50血清稀释度(与没有血清的阳性对照相比，感染事件减少50％)。图中的一个点代表一只小鼠。每只小鼠样品均一式两份进行测量。组大小n＝8。每组均用带有细线(whisker)的水平条显示平均值+SEM。LLOQ，定量下限。ULOQ，定量上限。

图8证明用BNT162c1免疫后7、14和21天的抗S蛋白IgG应答。将BALB/c小鼠用0.2、1或5μg的LNP配制的RBS004.3 IM免疫一次。在免疫后第7、14和21天，将动物放血并分析血清样品中通过ELISA测量的抗S1(左)和抗RBD(右)抗原特异性免疫球蛋白G(IgG)的总量。对于第7天(1:100)、第14天(1:300)和第21天(1:900)，图中包括不同的血清稀释度。图中的一个点代表一只小鼠，每只小鼠样品均一式两份进行测量(组大小n＝8；各组包括平均值+SEM)。

图9证明用BNT162c1免疫后14和21天SARS-CoV-2假病毒的中和。将BALB/c小鼠用0.2、1或5μg的LNP配制的RBS004.3 IM免疫一次。在免疫后14和21天，将动物放血，并且测试血清的SARS-CoV-2假病毒中和。图示出pVN50血清稀释度(与没有血清的阳性对照相比，感染事件减少50％)。图中的一个点代表一只小鼠。每只小鼠样品均一式两份进行测量。组大小n＝8。每组均用带有细线的水平条显示平均值+SEM。LLOQ，定量下限。ULOQ，定量上限。

图10证明用LNP配制的RBL063.1免疫后7、14、21和28天的抗S蛋白IgG应答。将BALB/c小鼠用1、5或10μg的LNP配制的RBL063.1 IM免疫一次。在免疫后第7、14、21和28天，将动物放血并分析血清样品中通过ELISA测量的抗S1(左)和抗RBD(右)抗原特异性免疫球蛋白G(IgG)的总量。对于第7天(1:100)、第14天(1:100)、第21天(1:300)和第28天(1:900)，图中包括不同的血清稀释度。图中的一个点代表一只小鼠，每只小鼠样品均一式两份进行测量(组大小n＝8；各组包括平均值+SEM)。

图11示出用LNP配制的RBL063.1免疫后14、21和28天SARS-CoV-2假病毒的中和。将BALB/c小鼠用1、5或10μg的LNP配制的RBL063.1 IM免疫一次。在免疫后14、21和28天，将动物放血，并且测试血清的SARS-CoV-2假病毒中和。图示出pVN50血清稀释度(与没有血清的阳性对照相比，感染事件减少50％)。图中的一个点代表一只小鼠。每只小鼠样品均一式两份进行测量。组大小n＝8。每组均用带有细线的水平条显示平均值+SEM。LLOQ，定量下限。ULOQ，定量上限。

图12示出用BNT162b2(LNP配制的RBP020.1)免疫后7、14和21天的抗S蛋白IgG应答。将BALB/c小鼠用0.2、1或5μg的LNP配制的RBP020.1 IM免疫一次。在免疫后第7、14和21天，将动物放血并分析血清样品中通过ELISA测量的抗S1(左)和抗RBD(右)抗原特异性免疫球蛋白G(IgG)的总量。对于第7天(1:100)、第14天(1:300)和第21天(1:1100)，图中包括不同的血清稀释度。图中的一个点代表一只小鼠，每只小鼠样品均一式两份进行测量(组大小n＝8；各组包括平均值+SEM)。

图13证明用BNT162b2(LNP配制的RBP020.1)免疫后14和21SARS-CoV-2假病毒的中和。将BALB/c小鼠用0.2、1或5μg的LNP配制的RBP020.1 IM免疫一次。在免疫后第14和21天，将动物放血，并且测试血清的SARS-CoV-2假病毒中和。图示出pVN50血清稀释度(与没有血清的阳性对照相比，感染事件减少50％)。图中的一个点代表一只小鼠。每只小鼠样品均一式两份进行测量。组大小n＝8。每组均用带有细线的水平条显示平均值+SEM。LLOQ，定量下限。ULOQ，定量上限。

图14示出用LNP配制的RBS004.2免疫后7、14和21天的抗S蛋白IgG应答。将BALB/c小鼠用0.2、1或5μg的LNP配制的RBS004.2 IM免疫一次。在免疫后第7、14和21天，将动物放血并分析血清样品中通过ELISA测量的抗S1(左)和抗RBD(右)抗原特异性免疫球蛋白G(IgG)的总量。对于第7天(1:100)、第14天(1:300)和第21天(1:900)，图中包括不同的血清稀释度。图中的一个点代表一只小鼠，每只小鼠样品均一式两份进行测量(组大小n＝8；各组包括平均值+SEM)。

图15证明用LNP配制的RBS004.2免疫后14和21SARS-CoV-2假病毒的中和。将BALB/c小鼠用0.2、1或5μg的LNP配制的RBS004.2 IM免疫一次。在免疫后14和21天，将动物放血，并且测试血清的SARS-CoV-2假病毒中和。图示出pVN50血清稀释度(与没有血清的阳性对照相比，感染事件减少50％)。图中的一个点代表一只小鼠。每只小鼠样品均一式两份进行测量。组大小n＝8。每组均用带有细线的水平条显示平均值+SEM。LLOQ，定量下限。ULOQ，定量上限。

图16示出筛选过程中的ALC-0315活性。

图17证明在存在或不存在ApoE3的情况下，在野生型(WT)或ApoE敲除C57Bl/6小鼠中肌肉内给药之后，在动物的右侧(注射部位)、背侧(注射部位)和腹侧(引流至肝)监测萤光素酶表达。在给药后4、24、72和96小时利用Xenolight D-荧光素Rediject检测萤光素酶表达。

图18示出在存在(KO+)或不存在(KO)ApoE3的情况下，在野生型(WT)或ApoE敲除C57Bl/6小鼠中静脉内(IV)和肌肉内(IM)给药之后的萤光素酶活性。在给药后4小时利用Xenolight D-荧光素Rediject检测萤光素酶表达。

具体实施方式

定义

虽然下文详细描述了本公开，但是应当理解本公开并不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是为了限制本公开的范围，本公开的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

优选地，本文使用的术语如"A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)",H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,and H.

除非另有说明，本公开的实施会采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，其在所述领域的文献中解释(参见，例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2

在下文中会描述本公开的要素。这些要素用具体实施方案列出，但是，应当理解它们可以以任何方式和任何数量组合以产生额外的实施方案。以各种方式描述的实例和实施方案不应当理解为将本公开仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当理解为公开并涵盖组合明确描述的实施方案与任何数量的公开要素的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则所有描述的要素的任何排列和组合都应当视为由本说明书公开。术语“约”表示近似或接近，并且在一些实施方案中在本文示出的数值或范围的上下文中表示列举或声称的数值或范围的±20％、±10％、±5％或±3％。

在描述本公开的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个(a)”和“一个(an)”和“这个”以及相似指称应当理解为覆盖单数和复数，除非在本文中另有指明或与上下文明显矛盾。本文中值的范围的列举仅为了用作单独提到落在所述范围内的每个不同值的速记方法。除非本文另有说明，每个单独的值如其在本文中单独列举地加入本说明书。除非本文另有说明或其他地方显然违背上下文，本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或者示例性语言(例如，“如”)的使用仅为了更好地说明本公开，并不对权利要求书的范围构成限制。本说明书中没有语言应当理解为表示对于本公开的实施必要的任何未要求保护的要素。

除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中术语“包含”用来表示除了由“包含”引入的列表成员，还可以任选地存在其他成员。但是，作为本公开的具体实施方案，考虑术语“包含”涵盖不存在其他成员的可能性，即，为了这个实施方案的目的，“包含”理解为具有“由…组成”或“基本上由…组成”的含义。

在这个说明书的整个正文中引用几个文件。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导等)，无论上文或下文，均整体援引加入本文。本文中的任何内容均不应理解为承认本公开无法早于这样的公开。

在下文中，将提供适用于本公开的所有方面的定义。除非另有说明，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语均具有其公认的含义。

药剂：如本文所用，术语“药剂(agent)”可以指物理实体或现象。在一些实施方案中，药剂可以通过特定特征和/或效果来表征。在一些实施方案中，药剂可以是任何化学类别的化合物、分子或实体，包括例如小分子、多肽、核酸、糖、脂质、金属或者它们的组合或复合物。在一些实施方案中，术语“药剂”可以指包含聚合物的化合物、分子或实体。在一些实施方案中，该术语可以指包含一个或多个聚合部分的化合物或实体。在一些实施方案中，术语“药剂”可以指基本上不含特定聚合物或聚合部分的化合物、分子或实体。在一些实施方案中，该术语可以指缺少或基本上不含任何聚合物或聚合部分的化合物、分子或实体。

氨基酸：在其最广泛的意义上，如本文所用，术语“氨基酸”是指可以、正在或已经并入多肽链的化合物和/或物质，例如，通过形成一个或多个肽键。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H

类似物：如本文所用，术语“类似物”是指与参考物质共享一个或多个特定结构特征、元素、组分或部分的物质。通常，“类似物”与参考物质显示出显著的结构相似性，例如共享核心或共有结构，但是在某些离散的方式上也有所不同。在一些实施方案中，类似物是可以从参考物质产生的物质，例如，通过参考物质的化学操作。在一些实施方案中，类似物是可以通过进行与产生参考物质基本上相似的合成过程(例如，与之共享多个步骤)来产生的。在一些实施方案中，类似物是或可以通过进行与用来产生参考物质不同的合成过程来产生的。

抗体物质：如本文所用，术语“抗体物质(antibody agent)”是指与特定抗原特异性结合的物质。在一些实施方案中，该术语涵盖包括足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构的多肽或多肽复合物。例如，在一些实施方案中，抗体物质是或包含多肽，所述多肽的氨基酸序列包括一个或多个本领域技术人员认为是互补性决定区(CDR)的结构元件；在一些实施方案中，抗体物质是或包括多肽，所述多肽的氨基酸序列包括至少一个CDR(例如，至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)，其与在参考抗体中发现的基本上相同。在一些实施方案中，包括的CDR与参考CDR基本上相同，即与参考CDR相比，其序列相同或包含1-5个氨基酸取代。在一些实施方案中，包括的CDR与参考CDR基本上相同，即它与参考CDR表现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性。在一些实施方案中，包括的CDR与参考CDR基本上相同，即它与参考CDR表现出至少96％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性。在一些实施方案中，包括的CDR与参考CDR基本上相同，即与参考CDR相比，包括的CDR内的至少一个氨基酸是缺失、添加或取代的，但是包括的CDR具有与参考CDR除此以外相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，包括的CDR与参考CDR基本上相同，即与参考CDR相比，包括的CDR内的1-5个氨基酸是缺失、添加或取代的，但是包括的CDR具有与参考CDR除此以外相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，包括的CDR与参考CDR基本上相同，即与参考CDR相比，包括的CDR内的至少一个氨基酸被取代，但是包括的CDR具有与参考CDR除此以外相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，包括的CDR与参考CDR基本上相同，即与参考CDR相比，包括的CDR内的1-5个氨基酸是缺失、添加或取代的，但是包括的CDR具有与参考CDR除此以外相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体物质是或包含多肽，所述多肽的氨基酸序列包括本领域技术人员认为是免疫球蛋白可变结构域的结构元件。在一些实施方案中，抗体物质是或包含多肽，所述的氨基酸序列包括本领域技术人员认为对应于抗体可变结构域的CDR1、2和3的结构元件；在一些这样的实施方案中，抗体物质是或包含多肽或多肽组，其氨基酸序列一起包括本领域技术人员认为对应于重链和轻链可变区CDR的结构元件，例如，重链CDR1、2和/或3以及轻链CDR1、2和/或3。在一些实施方案中，抗体物质是具有结合结构域的多肽蛋白，所述结合结构域与免疫球蛋白-结合结构域同源或在很大程度上同源。在一些实施方案中，抗体物质可以是或包含多克隆抗体制品。在一些实施方案中，抗体物质可以是或包含单克隆抗体制品。在一些实施方案中，抗体物质可以包括一个或多个具有特定生物体特征的恒定区序列，如骆驼、人、小鼠、灵长类、兔、大鼠；在许多实施方案中，抗体物质可以包括一个或多个具有人特征的恒定区序列。在一些实施方案中，抗体物质可以包括一个或多个本领域技术人员认为是人源化序列、灵长类化序列、嵌合序列等的序列元件。在一些实施方案中，抗体物质可以是典型的抗体(例如，可以包含两条重链和两条轻链)。在一些实施方案中，抗体物质的形式可以选自但不限于完整的IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性或多特异性抗体(例如，

结合：可以理解如本文所用，术语“结合”通常是指两个或更多个实体之间的非共价关联。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触；间接结合涉及通过与一个或多个中间实体的物理接触进行的物理相互作用。两个或更多个实体之间的结合通常可以在各种情况下进行评价–包括在孤立的情况下或在更复杂的系统中研究相互作用的实体或部分(例如，当与载剂实体共价或以其他方式关联时和/或在生物系统或细胞中)。如果在评价的条件下，相关实体更有可能互相关联而不是与其他可获得的结合伴侣关联，则可以认为两个实体之间的结合是“特异性的”。

生物样品：如本文所用，术语“生物样品”通常是指从所关注的生物来源(例如，组织或生物体或细胞培养物)获得或衍生的样品，如本文所述。在一些实施方案中，所关注的来源包括生物体，如动物或人。在一些实施方案中，生物样品是或包括生物组织或流体。在一些实施方案中，生物样品可以是或包括骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活检样品；含细胞的体液；自由漂浮的核酸；痰；唾液；尿液；脑脊液、腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；妇科液；皮肤拭子；阴道拭子；口腔拭子；鼻拭子；洗液或灌洗液，如导管灌洗液或支气管肺泡灌洗液；吸液；刮液；骨髓标本；组织活检标本；手术标本；粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物；和/或其中的细胞等。在一些实施方案中，生物样品是或包括获得自个体的细胞。在一些实施方案中，获得的细胞是或包括来自个体的细胞，样品是从所述个体获得的。在一些实施方案中，样品是通过任何适当的方式直接从所关注的来源获得的“初级样品”。例如，在一些实施方案中，通过选自活检(例如，细针抽吸或组织活检)、手术、收集体液(例如，血液、淋巴、粪便等)等的方法获得初级生物样品。在一些实施方案中，从上下文会清楚地看出，术语“样品”是指通过加工(例如，通过去除一种或多种组分和/或通过添加一种或多种物质)初级样品获得的制品。例如，使用半透膜进行过滤。这样的“加工的样品”可以包括，例如从样品提取或者通过对初级样品进行技术处理(如mRNA的扩增或逆转录，某些组分的分离和/或纯化等)获得的核酸或蛋白。

联合疗法：如本文所用，术语“联合疗法”是指其中受试者同时暴露于两个或更多个治疗方案(例如，两种或更多种治疗剂)的情况。在一些实施方案中，两个或更多个方案可以同时施用；在一些实施方案中，这类方案可以顺序施用(例如，在施用第二方案的任何剂量之前，施用第一方案的所有“剂量”)；在一些实施方案中，这类药剂以重叠的剂量给药方案施用。在一些实施方案中，联合疗法的“施用”可能涉及向接受组合中的其他药剂或方式的受试者施用一种或多种药剂或方式。为明确起见，联合疗法不要求在单一组合物中一起给药单独的药物(或者甚至不必同时)，尽管在一些实施方案中，两种或更多种药剂或者其活性部分可以在组合物中一起给药，或者甚至在组合化合物中一起给药(例如，作为单一化学复合物或共价实体的一部分)。

可比：如本文所用，术语“可比”是指两个或更多个药剂、实体、情况、条件集等，它们可能彼此不相同，但是足够相似，允许在它们之间进行比较，从而本领域技术人员会理解，基于观察到的差异或相似之处可以合理地得出结论。在一些实施方案中，可比的条件集、环境、个体或群体的特征在于有许多基本上相同的特征以及一个或少量的不同特征。本领域普通技术人员会理解，在上下文中，在任何给定情况下，认为可比的两个或更多个这样的药剂、实体、情况、条件集等需要何种程度的相同性。例如，本领域普通技术人员会理解，当环境集、个体或群体的特征在于足够数量和类型的基本上相同的特征以保证得出合理的结论，即在不同的环境集、个体或群体下或用其获得的结果或观察到的现象中的差异是由变化的那些特征的变化引起的或表明变化的那些特征的变化时，环境集、个体或群体是可比的。

对应于：如本文所用，术语“对应于”是指两个或更多个实体之间的关系。例如，术语“对应于”可以用于指定一个化合物或组合物中的结构元件相对于另一个化合物或组合物(例如，相对于适当的参考化合物或组合物)的位置/性质。例如，在一些实施方案中，聚合物中的单体残基(例如，多肽中的氨基酸残基或多核苷酸中的核酸残基)可以鉴定为“对应于”适当参考聚合物中的残基。例如，普通技术人员会理解，为了简单起见，多肽中的残基通常使用基于参考相关多肽的经典编码系统来指定，因此“对应于”190位置的残基的氨基酸，例如，实际上不需要是特定氨基酸链中的第190个氨基酸，而是对应于在参考多肽中的190发现的残基；本领域普通技术人员很容易理解如何鉴定“对应”氨基酸。例如，本领域技术人员会意识到各种序列比对策略，包括软件程序，例如，BLAST、CS-BLAST、CUSASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM或SWIPE，例如，可以根据本公开使用它们来鉴定多肽和/或核酸中的“对应”残基。本领域技术人员还会理解，在某些情况下，术语“对应于”可以用于描述与另一事件或实体(例如，适当的参考事件或实体)享有相关相似性的事件或实体。仅举一个例子，一种生物体中的基因或蛋白可以描述为“对应于”来自另一种生物体的基因或蛋白，以便在一些实施方案中表明它发挥类似作用或执行类似功能和/或表明它显示出特定程度的序列相同性或同源性，或者共享特定特征序列元件。

设计的：如本文所用，术语“设计的”是指物质(i)其结构是或由人工选择的；(ii)由需要人工的过程产生的；和/或(iii)不同于天然物质或其他已知物质。

剂量给药方案：本领域技术人员会理解，术语“剂量给药方案”可以用于指单独向受试者给药的一组单位剂量(通常不止一个)，通常间隔一段时间。在一些实施方案中，给定治疗剂具有推荐的剂量给药方案，其可能涉及一个或多个剂量。在一些实施方案中，剂量给药方案包括多个剂量，每个剂量在时间上与其他剂量分开。在一些实施方案中，各个剂量之间以相同长度的时间段相隔；在一些实施方案中，剂量给药方案包括多个剂量和至少两个不同的时间段来分隔各个剂量。在一些实施方案中，剂量给药方案中的所有剂量都是相同的单位剂量量。在一些实施方案中，剂量给药方案中的不同剂量是不同的量。在一些实施方案中，剂量给药方案包括第一剂量量中的第一剂量，然后是不同于第一剂量量的第二剂量量中的一个或多个额外剂量。在一些实施方案中，剂量给药方案包括第一剂量量中的第一剂量，然后是与第一剂量量相同的第二剂量量中的一个或多个额外剂量。在一些实施方案中，当在相关人群中给药时，剂量给药方案与期望或有益的结果相关(即，是治疗性剂量给药方案)。

工程化：一般来说，术语“工程化”是指已通过人工操纵的方面。例如，当两个或更多个在自然界中不以该顺序连接在一起的序列通过人工操纵在工程化多核苷酸中直接互相连接时，和/或当多核苷酸中的特定残基是非天然存在的和/或通过人工作用导致与其在自然界中不连接的实体或部分连接时，认为多核苷酸是“工程化的”。

表位：如本文所用，术语“表位”是指被免疫球蛋白(例如，抗体或受体)结合组分特异性识别的部分。在一些实施方案中，表位包括由抗原上的多个化学原子或基团。在一些实施方案中，当抗原采用相关三维构象时，这类化学原子或基团是表面暴露的。在一些实施方案中，当抗原采用这样的构象时，这类化学原子或基团在空间上互相物理靠近。在一些实施方案中，当抗原采用可选构象(例如，线性化)时，至少一些这样的化学原子是物理上互相分离的基团。

表达：如本文所用，核酸序列的术语“表达”是指从所述核酸序列产生任何基因产物。在一些实施方案中，基因产物可以是转录物。在一些实施方案中，基因产物可以是多肽。在一些实施方案中，核酸序列的表达涉及以下一项或多项内容：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑等)；(3)将RNA翻译为多肽或蛋白；和/或(4)多肽或蛋白的翻译后修饰。

药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂，与一种或多种药学可接受的载剂一起配制。在一些实施方案中，活性剂以适合在治疗方案中给药的单位剂量量存在，所述治疗方案在向相关群体给药时表现出达到预定治疗效果的统计上显著的可能性。在一些实施方案中，药物组合物可以专门配制为肠胃外给药，例如，通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，例如，作为无菌溶液或悬浮液，或者缓释制剂。

多肽：如本文所用是指氨基酸的聚合链。在一些实施方案中，多肽具有在自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有在自然界中不存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有工程化的氨基酸序列，因为它是通过人工作用设计和/或产生的。在一些实施方案中，多肽可以包含或由天然氨基酸、非天然氨基酸或两者组成。在一些实施方案中，多肽可以仅包含或由天然氨基酸或非天然氨基酸组成。在一些实施方案中，多肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸或两者。在一些实施方案中，多肽可以仅包含D-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以仅包含L-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以包括一个或多个侧基或其他修饰，例如，在多肽的N端、在多肽的C端或其任何组合修饰或连接至一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方案中，这类侧基或修饰可以选自乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括它们的组合。在一些实施方案中，多肽可以是环状的，和/或可以包含环状部分。在一些实施方案中，多肽不是环状的和/或不含任何环状部分。在一些实施方案中，多肽是线性的。在一些实施方案中，多肽可以是或包含钉合的多肽。在一些实施方案中，术语“多肽”可以附加至参考多肽、活性或结构的名称；在这类情况下，它在本文中用于指共享相关活性或结构的多肽，并且因此可以认为是多肽的同一类别或家族的成员。对于每个这样的类别，本说明书提供和/或本领域技术人员会意识到该类别内的示例性多肽，其氨基酸序列和/或功能是已知的；在一些实施方案中，这类示例性多肽是多肽类别或家族的参考多肽。在一些实施方案中，多肽类别或家族的成员与该类别的参考多肽表现出显著的序列同源性或相同性，共享共同的序列基序(例如，特征序列元件)，和/或共享共同的活性(在一些实施方案中在可比水平或在指定范围内)；在一些实施方案中与该类别内的所有多肽)。例如，在一些实施方案中，成员多肽表现出与参考多肽的序列同源性或相同性的总体程度为至少约30-40％，并且通常大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，和/或至少包括一个区域(例如，在一些实施方案中可能是或包含特征序列元件的保守区)，其表现出非常高的序列相同性，通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％。这样的保守区通常涵盖至少3-4个，通常多达20个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，保守区涵盖至少一段至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续氨基酸。在一些实施方案中，相关多肽可以包含或由亲本多肽的片段组成。

预防：如本文所用，当与疾病、病症和/或疾病状况相关使用时，是指减少发展疾病、病症和/或疾病状况的风险和/或延迟疾病、病症或疾病状况的一个或多个特征或症状的发生。当疾病、病症或疾病状况的发生已延迟预定时间段时，可以认为预防是完全的。

参考：如本文所用，描述相对其进行比较的标准或对照。例如，在一些实施方案中，将所关注的药剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照药剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，与所关注的测试或测定基本上同时测试和/或测定参考或对照。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地包含在有形媒介中。通常，如本领域技术人员所理解的，在与评价的那些条件或环境可比的条件或环境下确定或表征参考或对照。本领域技术人员会理解何时存在足够的相似性，以证明依赖和/或于特定的可能参考或对照进行比较。

风险：根据上下文会理解，疾病、病症和/或疾病状况的“风险”是指特定个体会发展疾病、病症和/或疾病状况的可能性。在一些实施方案中，风险以百分比表示。在一些实施方案中，风险从0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90直到100％。在一些实施方案中，风险表示为相对于与参考样品或参考样品组相关的风险的风险。在一些实施方案中，参考样品或参考样品组具有已知的疾病、病症、疾病状况和/或事件的风险。在一些实施方案中，参考样品或参考样品组来自与特定个体可比的个体。在一些实施方案中，相对风险是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。在一些实施方案中，风险可以反映一个或多个遗传属性，例如，其可能使个体倾向于发展(或不发展)特定疾病、病症和/或疾病状况。在一些实施方案中，风险可以反映一个或多个表观遗传事件或属性和/或一个或多个生活方式或环境事件或属性。

易感：对疾病、病症和/或疾病状况“易感”的个体是比公众成员有更高风险发展疾病、病症和/或疾病状况的个体。在一些实施方案中，对疾病、病症和/或疾病状况易感的个体可能尚未诊断为患有所述疾病、病症和/或疾病状况。在一些实施方案中，对疾病、病症和/或疾病状况易感的个体可能表现出所述疾病、病症和/或疾病状况的症状。在一些实施方案中，对疾病、病症和/或疾病状况易感的个体可能未表现出所述疾病、病症和/或疾病状况的症状。在一些实施方案中，对疾病、病症和/或疾病状况易感的个体会发展所述疾病、病症和/或疾病状况。在一些实施方案中，对疾病、病症和/或疾病状况易感的个体不会发展所述疾病、病症和/或疾病状况。

疫苗接种：如本文所用，术语“疫苗接种”是指给药旨在产生免疫应答的组合物，例如疾病相关(例如，致病)物质。在一些实施方案中，疫苗接种可以在暴露于疾病相关物质之前、期间和/或之后施用，并且在某些实施方案中，在暴露于所述物质之前、期间和/或之后不久。在一些实施方案中，疫苗接种包括疫苗组合物的多次给药，适当间隔时间。在一些实施方案中，疫苗接种产生传染物的免疫应答。在一些实施方案中，疫苗接种产生对肿瘤的免疫应答；在一些这样的实施方案中，疫苗接种是“个性化的”，因为它部分或全部针对确定存在于特定个体肿瘤中的表位(例如，其可以是或包括一个或多个新表位)。

变体：如本文用于分子的上下文，例如，核酸、蛋白或小分子，术语“变体”是指与参考分子表现出显著的结构相同性，但是在结构上不同于参考分子，例如，与参考实体相比，在存在或不存在或者在一个或多个化学部分的水平上不同。在一些实施方案中，变体在功能上也不同于其参考分子。一般来说，特定分子是否被适当地认为是参考分子的“变体”是基于它与参考分子的结构相同程度。如本领域技术人员会理解的，任何生物或化学参考分子具有某些特征性结构元件。根据定义，变体是独特的分子，其享有一个或多个这样的特征性结构元件，但是在至少一个方面与参考分子不同。在一些实施方案中，变体多肽或核酸可能由于氨基酸或核酸序列的一个或多个差异和/或作为多肽或核酸的共价组分(例如，连接至多肽或核酸骨架)的化学部分(例如，碳水化合物、脂质、磷酸酯基团)的一个或多个差异而不同于参考多肽或核酸。在一些实施方案中，变体多肽或核酸与参考多肽或核酸表现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列相同性。在一些实施方案中，变体多肽或核酸与参考多肽或核酸不共享至少一个特征序列元件。在一些实施方案中，参考多肽或核酸具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽或核酸享有参考多肽或核酸的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽或核酸缺少参考多肽或核酸的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，与参考多肽或核酸相比，变体多肽或核酸表现出降低水平的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，如果所关注的多肽或核酸具有与参考相同的氨基酸或核苷酸序列，但是在特定位置有少量的序列改变，则认为其是参考多肽或核酸的“变体”。通常，与参考相比，变体中少于约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％或约2％的残基是取代、插入或缺失的。在一些实施方案中，与参考相比，变体多肽或核酸包含约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1个取代的残基。通常，相对于参考，变体多肽或核酸包含非常少量(例如，少于约5、约4、约3、约2或约1)的取代、插入或缺失的功能性残基(即，参与特定生物活性的残基)。在一些实施方案中，与参考相比，变体多肽或核酸包含不超过约5、约4、约3、约2或约1个添加或缺失，并且在一些实施方案中，不包含添加或缺失。在一些实施方案中，与参考相比，变体多肽或核酸包含少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6个，以及通常少于约5、约4、约3或约2个添加或缺失。在一些实施方案中，参考多肽或核酸是在自然界中发现的多肽或核酸。

本公开提供一种RNA多核苷酸，包含：(i)5’帽，其是或包含cap1结构，例如，如本文公开的；(ii)包含帽近端序列的5’UTR序列，例如，如本文公开的；以及(iii)编码有效负载的序列。本文还提供包含所述RNA多核苷酸的组合物和药物制品，以及制备和使用所述RNA多核苷酸的方法。在一些实施方案中，可以用RNA多核苷酸提高编码有效负载的RNA的翻译效率，和/或RNA编码的有效负载的表达，所述RNA多核苷酸包含5’帽，其包含本文公开的Cap1结构，例如，m

RNA多核苷酸

如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指DNA和RNA如基因组DNA、cDNA、mRNA，重组产生和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。RNA包括体外转录的RNA(IVT RNA)或合成的RNA。根据本发明，多核苷酸优选是分离的。

在一些实施方案中，核酸可以包含在载体中。如本文所用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体，粘粒载体，噬菌体载体如λ噬菌体，病毒载体如逆转录病毒、腺病毒或杆状病毒载体，或者人工染色体载体如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC)。在一些实施方案中，载体可以是表达载体；可选地或额外地，在一些实施方案中，载体可以是克隆载体。本领域技术人员会理解，在一些实施方案中，表达载体可以是例如质粒；可选地或额外地，在一些实施方案中，表达载体可以是病毒载体。通常，表达载体包含期望的编码序列以及在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当的其他序列。克隆载体一般用于工程化和扩增某个期望的片段(通常是DNA片段)，并且可以缺少表达期望片段所需要的功能序列。

在一些实施方案中，如本文描述和/或使用的核酸可以是或包含重组和/或分离的分子。

本领域技术人员在阅读本公开时会理解，术语“RNA”通常是指包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。如本文所用，“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基团的2'-位置具有羟基的核苷酸。在一些实施方案中，RNA可以是部分或完全的双链RNA；在一些实施方案中，RNA可以包含两条或更多条不同的核酸链(例如，单独的分子)，它们部分或完全互相杂交。在许多实施方案中，RNA是单链，在一些实施方案中，它可以自杂交或以其他方式折叠为二级和/或三级结构。在一些实施方案中，如本文描述和/或使用的RNA不会自杂交，至少对于如本文描述的某些序列是如此。在一些实施方案中，RNA可以是分离的RNA，如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA和/或修饰的RNA(其中术语“修饰”理解为表示RNA的一个或多个残基或其他结构元件不同于天然存在的RNA；例如，在一些实施方案中，修饰的RNA通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变和/或通过核苷酸的一个或多个部分或特征(例如，核苷或骨架结构或连接)而不同)。在一些实施方案中，修饰可以是或包括将非核苷酸物质添加至内部RNA核苷酸或RNA的末端。本文中还考虑RNA(例如，修饰的RNA)中的核苷酸可以是非标准核苷酸，如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开，认为这些改变的RNA是天然存在的RNA的类似物。

在本公开的一些实施方案中，RNA是或包括与编码多肽的RNA转录物有关的信使RNA(mRNA)。

在一些实施方案中，本文公开的RNA包含：5’帽，其包含本文公开的5’帽；包含帽近端序列的5'非翻译区(5'-UTR)，编码有效负载(例如，多肽)的序列；3'非翻译区(3'-UTR)；和/或聚腺苷酸(PolyA)序列。

在一些实施方案中，本文公开的RNA包括5’至3’方向的以下组分：5’帽，其包含本文公开的5’帽；包含帽近端序列的5'非翻译区(5'-UTR)，编码有效负载(例如，多肽)的序列；3'非翻译区(3'-UTR)；以及PolyA序列。

在一些实施方案中，RNA是通过体外转录或化学合成产生的。在一些实施方案中，mRNA是使用DNA模板通过体外转录产生的，其中DNA是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。

在一些实施方案中，本文公开的RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过适当DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的适当载体来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。

在一些实施方案中，RNA是“复制子RNA”或简单地是“复制子”，特别是“自我复制RNA”或“自我扩增RNA”。在一些实施方案中，复制子或自我复制RNA源自或包含源自ssRNA病毒的元件，特别是正链ssRNA病毒如甲病毒。甲病毒是正链RNA病毒的典型代表。甲病毒在感染细胞的细胞质中复制(甲病毒生命周期的综述参见Joséet al.,Future Microbiol.,2009,vol.4,pp.837–856)。许多甲病毒的总基因组长度通常范围在11,000和12,000个核苷酸之间，并且基因组RNA通常具有5’-帽和3’poly(A)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。在基因组中通常有两个开放阅读框(ORF)。4个非结构蛋白(nsP1–nsP4)通常由在基因组5′末端附近开始的第一ORF一起编码，而甲病毒结构蛋白由第二ORF一起编码，所述第二ORF位于第一ORF下游并延伸至基因组的3’末端附近。通常，第一ORF比第二ORF大，比例大约为2:1。在被甲病毒感染的细胞中，仅编码非结构蛋白的核酸序列从基因组RNA翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物翻译，这是类似于真核信使RNA的RNA多核苷酸(mRNA；Gould etal.,2010,Antiviral Res.,vol.87pp.111–124)。感染之后，即在病毒生命周期的早期，(+)链基因组RNA直接充当信使RNA，用于翻译编码非结构多蛋白(nsP1234)的开放阅读框。已建议将甲病毒衍生的载体用于将外来遗传信息递送至靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框被编码所关注的蛋白的开放阅读框代替。基于甲病毒的反式复制(trans-replication)系统依赖于两个单独的核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶，而另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此命名为反式复制系统)。反式复制需要在给定宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件以允许甲病毒复制酶进行识别和RNA合成。

在一些实施方案中，本文描述的RNA可以具有修饰的核苷。在一些实施方案中，RNA包含修饰的核苷代替至少一个(例如，每个)尿苷。

如本文所用，术语“尿嘧啶”描述可以在RNA的核酸中出现的核碱基之一。尿嘧啶的结构是：

如本文所用，术语“尿苷”描述可以在RNA中出现的核苷之一。尿苷的结构是：

UTP(尿苷5’-三磷酸)具有以下结构：

假-UTP(假尿苷-5’-三磷酸)具有以下结构：

“假尿苷”是修饰的核苷的一个实例，其是尿苷的异构体，其中尿嘧啶通过碳-碳键而不是氮-碳糖苷键连接至戊糖环。

另一示例性修饰的核苷是N1-甲基假尿苷(m1Ψ)，其具有以下结构：

N1-甲基假尿苷-5’-三磷酸(m1ΨTP)具有以下结构：

另一示例性修饰的核苷是5-甲基尿苷(m5U)，其具有以下结构：

在一些实施方案中，本文描述的RNA中的一个或多个尿苷被修饰的核苷代替。在一些实施方案中，修饰的核苷是修饰的尿苷。

在一些实施方案中，RNA包含修饰的核苷代替至少一个尿苷。在一些实施方案中，RNA包含修饰的核苷代替每个尿苷。

在一些实施方案中，修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲基尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(Ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含5-甲基尿苷(m5U)。在一些实施方案中，RNA可以包含不止一种类型的修饰的核苷，并且修饰的核苷独立地选自假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(m1Ψ)和5-甲基尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(Ψ)和N1-甲基假尿苷(m1Ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(Ψ)和5-甲基尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含N1-甲基假尿苷(m1Ψ)和5-甲基尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(m1Ψ)和5-甲基尿苷(m5U)。

在一些实施方案中，代替RNA中的一个或多个(例如，全部)尿苷的修饰的核苷可以是以下任何一种或多种：3-甲基-尿苷(m

在一些实施方案中，RNA包含其他修饰的核苷，或者包含进一步修饰的核苷，例如，修饰的胞苷。例如，在一些实施方案中，在RNA中，5-甲基胞苷部分或完全，优选完全取代胞苷。在一些实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷以及选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)中的一种或多种。在一些实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，所述RNA包含5-甲基胞苷代替每个胞苷，以及N1-甲基-假尿苷(m1ψ)代替每个尿苷。

在一些实施方案中，编码有效负载如疫苗抗原的RNA在治疗的受试者的细胞中表达以提供有效负载，例如，疫苗抗原。在一些实施方案中，所述RNA在受试者的细胞中瞬时表达。在一些实施方案中，所述RNA是体外转录的RNA。在一些实施方案中，有效负载如疫苗抗原的表达在细胞表面。在一些实施方案中，有效负载如疫苗抗原在MHC的背景下表达和呈递。在一些实施方案中，有效负载如疫苗抗原的表达进入细胞外空间，即，分泌疫苗抗原。

在本公开的上下文中，术语“转录”涉及这样的过程，其中将DNA序列中的遗传密码转录为RNA。随后，可以将RNA翻译为肽或蛋白。

根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及这样的过程，其中RNA，特别是mRNA，在不含细胞的系统中体外合成，优选使用适当的细胞提取物。优选地，将克隆载体用于产生转录物。这些克隆载体一般指定为转录载体，并且根据本发明涵盖在术语“载体”内。根据本发明，本发明中使用的RNA优选是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过适当DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的特别实例有T7、T3和SP6 RNA聚合酶。优选地，根据本发明的体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的适当载体来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。

关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过这个过程mRNA链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白。

在一些实施方案中，给药本文描述的RNA之后，例如，配制为RNA脂质颗粒，将至少一部分RNA递送至靶细胞。在一些实施方案中，将至少一部分RNA递送至靶细胞的胞质溶胶。在一些实施方案中，通过靶细胞翻译RNA以产生其编码的肽或蛋白。在一些实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一些实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞如脾中的专职抗原呈递细胞。在一些实施方案中，靶细胞是树突细胞或巨噬细胞。本文描述的RNA颗粒如RNA脂质颗粒可以用于将RNA递送至这样的靶细胞。因此，本公开还涉及一种将RNA递送至受试者中的靶细胞的方法，所述方法包括将本文描述的RNA颗粒给药至受试者。在一些实施方案中，将RNA递送至靶细胞的胞质溶胶。在一些实施方案中，通过靶细胞翻译RNA以产生RNA编码的肽或蛋白。

“编码”是指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序列的固有特性，以便用作模板用于在生物过程中合成其他聚合物或大分子，所述聚合物或大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此所致的生物学特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该基因编码蛋白。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链以及用作基因或cDNA转录模板的非编码链均可以称作编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。

在一些实施方案中，本文描述的核酸组合物，例如，包含脂质纳米颗粒包封的mRNA的组合物，其特征在于(例如，当给药至受试者时)持续表达编码的多肽。例如，在一些实施方案中，这类组合物的特征在于，当给药至人时，它们在来自该人的生物样品(例如，血清)中达到可检测的多肽表达，并且在一些实施方案中，这种表达持续至少36小时或更长的时间，包括，例如，至少48小时、至少60小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少148小时或更长时间。

在一些实施方案中，根据本发明给药的编码疫苗抗原的RNA是非免疫原性的。可以根据本发明给药编码免疫刺激剂的RNA以提供辅助作用。编码免疫刺激剂的RNA可以是标准RNA或非免疫原性RNA。

如本文所用的术语“非免疫原性RNA”是指这样的RNA，其在给药至例如哺乳动物时不诱导免疫系统应答，或者诱导的应答比不同之处仅在于尚未进行使非免疫原性RNA成为非免疫原性的修饰和处理的相同RNA诱导的弱，即，比标准RNA(stdRNA)诱导的弱。在一优选实施方案中，通过将抑制RNA介导的先天免疫受体激活的修饰的核苷掺入RNA并去除双链RNA(dsRNA)，使得赋予在本文中也称作修饰的RNA(modRNA)的非免疫原性RNA非免疫原性。

为了通过掺入修饰的核苷赋予非免疫原性RNA非免疫原性，可以使用任何修饰的核苷，只要其降低或抑制RNA的免疫原性。特别优选抑制RNA介导的先天免疫受体激活的修饰的核苷。在一些实施方案中，修饰的核苷包括用包含修饰的核碱基的核苷置换一个或多个尿苷。在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿嘧啶。在一些实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷选自3-甲基-尿苷(m

在一些实施方案中，用包含修饰的核碱基的核苷置换一个或多个尿苷包括置换至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的尿苷。

在使用T7 RNA聚合酶通过体外转录(IVT)合成mRNA期间，由于酶的非常规活性，产生大量异常产物，包括双链RNA(dsRNA)。dsRNA诱导炎性细胞因子并激活效应酶，导致蛋白合成抑制。可以使用无孔或多孔的C-18聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)基质通过例如离子对反相HPLC从RNA如IVT RNA去除dsRNA。或者，可以使用基于酶的方法，使用特异性水解dsRNA但不水解ssRNA的大肠杆菌RNaseIII，从而从IVT RNA制品消除dsRNA污染物。此外，可以通过使用纤维素材料将dsRNA与ssRNA分开。在一些实施方案中，使RNA制品与纤维素材料接触，并且在允许dsRNA结合至纤维素材料且不允许ssRNA结合至纤维素材料的条件下将ssRNA与纤维素材料分离。

当术语在本文中使用时，“去除”或“去除”是指从邻近第二物质的群体如dsRNA分离第一物质的群体如非免疫原性RNA的特征，其中第一物质的群体不必完全没有第二物质，并且第二物质的群体不必完全没有第一物质。但是，特征在于去除第二物质的群体的第一物质的群体与未分离的第一和第二物质的混合物相比具有可测量的更低含量的第二物质。

在一些实施方案中，从非免疫原性RNA去除dsRNA包括去除dsRNA，从而非免疫原性RNA组合物中少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.3％或少于0.1％的RNA是dsRNA。在一些实施方案中，非免疫原性RNA不含或基本上不含dsRNA。在一些实施方案中，非免疫原性RNA组合物包含核苷修饰的单链RNA的纯化制品。例如，在一些实施方案中，核苷修饰的单链RNA的纯化制品基本上不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，相对于所有其他核酸分子(DNA、dsRNA等)，纯化的制品是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％核苷修饰的单链RNA。

在一些实施方案中，与具有相同序列的标准RNA相比，非免疫原性RNA在细胞中的翻译效率更高。在一些实施方案中，相对于其未修饰的对应物，翻译增强的倍数是2倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是3倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是4倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是5倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是6倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是7倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是8倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是9倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是10倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是15倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是20倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是50倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是100倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是200倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是500倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是1000倍。在一些实施方案中，翻译增强的倍数是2000倍。在一些实施方案中，倍数是10-1000倍。在一些实施方案中，倍数是10-100倍。在一些实施方案中，倍数是10-200倍。在一些实施方案中，倍数是10-300倍。在一些实施方案中，倍数是10-500倍。在一些实施方案中，倍数是20-1000倍。在一些实施方案中，倍数是30-1000倍。在一些实施方案中，倍数是50-1000倍。在一些实施方案中，倍数是100-1000倍。在一些实施方案中，倍数是200-1000倍。在一些实施方案中，翻译增强了任何其他显著的量或量的范围。

在一些实施方案中，与具有相同序列的标准RNA相比，非免疫原性RNA表现出明显更低的固有免疫原性。在一些实施方案中，非免疫原性RNA表现出比其未修饰的对应物少2倍的先天免疫应答。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是3倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是4倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是5倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是6倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是7倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是8倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是9倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是10倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是15倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是20倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是50倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是100倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是200倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是500倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是1000倍。在一些实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是2000倍。

术语“表现出明显更少的先天免疫原性”是指先天免疫原性的可检测的减少。在一些实施方案中，该术语是指减少，使得可以给药有效量的非免疫原性RNA而不触发可检测的先天免疫应答。在一些实施方案中，该术语是指减少，使得可以重复给药非免疫原性RNA而不引发先天免疫应答，所述先天免疫应答足以可检测地减少所述非免疫原性RNA编码的蛋白的产生。在一些实施方案中，所述减少使得可以重复给药非免疫原性RNA而不引发先天免疫应答，所述先天免疫应答足以消除所述非免疫原性RNA编码的蛋白的可检测的产生。

“免疫原性”是外来物质如RNA在人或其他动物体内引起免疫应答的能力。先天免疫系统是免疫系统的组成部分，其是相对非特异性和即时的。它和适应性免疫系统一起是脊椎动物免疫系统的两个主要组成部分之一。如本文所用，“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部或者在其内部产生的任何物质。

如本文所用，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或者在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。

如本文所用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

如本文所用，术语“连接”、“融合(fused)”或“融合(fusion)”可互换使用。这些术语是指两个或更多个元件或组件或结构域连接在一起。

在一些实施方案中，本文描述的有效负载(例如，多肽)由编码序列编码，所述编码序列与野生型编码序列相比经过密码子优化和/或其G/C含量有增加。在一些实施方案中，与野生型编码序列的相应序列区域相比，编码序列的一个或多个序列区域是密码子优化和/或G/C含量增加的。在一些实施方案中，密码子优化和/或G/C含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。

术语“密码子优化”被本领域技术人员理解为指改变核酸分子的编码区中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用，但优选不改变核酸分子编码的氨基酸序列。在本公开的上下文中，优选使用本文描述的RNA多核苷酸对编码区进行密码子优化以在待治疗的受试者中最佳表达。密码子优化是基于以下发现：翻译效率还由细胞中tRNA出现的不同频率决定。因此，可以修饰RNA的序列，从而插入可获得频繁出现的tRNA的密码子代替“稀有密码子”。

在一些实施方案中，与编码有效负载的野生型RNA的相应编码序列的G/C含量相比，RNA的编码区(例如，有效负载序列)的鸟苷/胞嘧啶(G/C)含量增加，其中与野生型RNA编码的氨基酸序列相比，所述RNA编码的氨基酸序列优选是未修饰的。RNA序列的这种修饰是基于以下事实：待翻译的任何RNA区域的序列对于该mRNA的高效翻译都很重要。具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。关于几个密码子编码一个和相同氨基酸(所谓的遗传密码的简并性)的事实，可以确定对于稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用)。根据RNA编码的氨基酸，与其野生型序列相比，对于RNA序列的修饰有各种可能性。特别地，包含A和/或U核苷的密码子可以通过用其他密码子取代这些密码子来修饰，所述其他密码子编码相同氨基酸但不含A和/或U或者包含较低量的A和/或U核苷。

在一些实施方案中，与野生型RNA的编码区的G/C含量相比，本文描述的RNA的编码区的G/C含量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％或甚至更多。

5’帽

RNA加帽的研究很深入，例如，在Decroly E et al.(2012)Nature Reviews 10:51-65；和Ramanathan A.et al.,(2016)Nucleic Acids Res；44(16):7511–7526中描述，每个的全部内容援引加入本文。5’帽包括Cap-0(在本文中也称作“Cap0”)、Cap-1(在本文中也称作“Cap1”)或Cap-2(在本文中也称作“Cap2”)。参见，例如，Ramanathan A等人的图1和Decroly E等人的图1。

如本文所用的术语“5'-帽”是指在RNA，例如mRNA的5'-末端发现的结构，并且一般包括通过5'-至5'-三磷酸键连接至RNA，例如mRNA的鸟苷核苷酸(也称作Gppp或G(5')ppp(5'))。在一些实施方案中，5’帽中包括的鸟苷核苷可以是修饰的，例如，通过在碱基(鸟嘌呤)上的一个或多个位置(例如，在7-位)甲基化和/或通过在核糖的一个或多个位置甲基化。在一些实施方案中，5’帽中包括的鸟苷核苷包括在核糖的3’O甲基化(3’OMeG)。在一些实施方案中，5’帽中包括的鸟苷核苷包括在鸟嘌呤7-位的甲基化(m7G)。在一些实施方案中，5’帽中包括的鸟苷核苷包括在鸟嘌呤7-位的甲基化和在核糖的3’O甲基化(m7(3’OMeG))。

在一些实施方案中，提供具有本文公开的5'-帽或5'-帽类似物的RNA可以通过体外转录来实现，其中将5'-帽共转录表达至RNA链中，或者可以使用加帽酶转录后连接至RNA。在一些实施方案中，与用适当的参考比较物共转录加帽相比，用本文公开的帽，例如，用cap1或cap1类似物共转录加帽，提高RNA的加帽效率。在一些实施方案中，提高加帽效率可以增加RNA的翻译效率和/或翻译速率，和/或增加编码多肽的表达。

在一些实施方案中，本文描述的RNA包含5’-帽或5’帽类似物，例如，Cap0、Cap1或Cap2。在一些实施方案中，提供的RNA没有无帽的5'-三磷酸。在一些实施方案中，RNA可以用5'-帽类似物加帽。在一些实施方案中，本文描述的RNA包含Cap0。在一些实施方案中，本文描述的RNA包含Cap1，例如，如本文所述。在一些实施方案中，本文描述的RNA包含Cap2。

在一些实施方案中，Cap0结构包含在鸟嘌呤的7-位甲基化的鸟苷核苷(m7G)。在一些实施方案中，Cap0结构通过5'-至5'-三磷酸键连接至RNA，并且在本文中也称作m7Gppp或m7G(5')ppp(5')。

在一些实施方案中，Cap1结构包含在鸟嘌呤的7-位甲基化的鸟苷核苷(m7G)和在RNA中的第一核苷酸甲基化的2’O(2'OMeN

在一些实施方案中，m7G(5')ppp(5')(2'OMeN

在一些实施方案中，cap1结构是或包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeA

在一些实施方案中，cap1结构是或包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeA

在一些实施方案中，cap1结构是或包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeG

在一些实施方案中，Cap1结构包含在鸟嘌呤的7-位甲基化的鸟苷核苷(m7G)以及一个或多个额外修饰，例如，核糖上的甲基化，以及RNA中2’O甲基化的第一核苷酸。在一些实施方案中，Cap1结构包含在鸟嘌呤的7-位甲基化的鸟苷核苷和在核糖的3’O甲基化(m7(3’OMeG))；以及RNA中2’O甲基化的第一核苷酸(2'OMeN

在一些实施方案中，m7(3’oMeG)(5')ppp(5')(2'OMeN

在一些实施方案中，cap1结构是或包含m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA

在一些实施方案中，cap1结构是或包含m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG

在一些实施方案中，Cap1结构中的第二核苷酸可以包含一个或多个修饰，如，甲基化。在一些实施方案中，包含含有2’O甲基化的第二核苷酸的Cap1结构是Cap2结构。

在一些实施方案中，包含Cap1结构的RNA多核苷酸相对于适当的参考比较物具有增加的翻译效率、增加的翻译速率和/或增加的编码有效负载的表达。在一些实施方案中，包含具有m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA

在一些实施方案中，RNA多核苷酸中使用的cap类似物是m

以下是示例性Cap1 RNA，其包含RNA和m

以下是另一示例性Cap1 RNA：

在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸包含图3A-3I中任一个示出的Cap。在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸包含图3A中示出的Cap。在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸包含图3B中示出的Cap。在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸包含图3C中示出的Cap。在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸包含图3D中示出的Cap。在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸包含图3E中示出的Cap。在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸包含图3F中示出的Cap。在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸包含图3G中示出的Cap。在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸包含图3H中示出的Cap。在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸包含图3I中示出的Cap。

5’UTR和帽近端序列

在一些实施方案中，本文公开的RNA包含5'-UTR。术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中的区域，其转录但不翻译为氨基酸序列，或者涉及RNA多核苷酸如mRNA分子中的相应区域。非翻译区(UTR)可以存在于开放阅读框的5'(上游)(5'-UTR)和/或开放阅读框的3'(下游)(3'-UTR)。如果存在，5'-UTR位于5'末端，蛋白编码区的起始密码子的上游。5'-UTR位于5'-帽(如果存在)的下游，例如直接与5'-帽相邻。

在一些实施方案中，本文公开的5’UTR包含帽近端序列，例如，如本文公开的。在一些实施方案中，帽近端序列包含与5’帽相邻的序列。在一些实施方案中，帽近端序列包含在RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和/或+5位置的核苷酸。

在一些实施方案中，Cap结构包含帽近端序列的一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+1(N

本领域技术人员在阅读本公开时会理解，在一些实施方案中，帽近端序列中的一个或多个残基(例如，残基+1、+2、+3、+4和/或+5中的一个或多个)可以因为已包括在帽实体(例如，Cap1结构等)中而包括在RNA中；或者，在一些实施方案中，帽近端序列中的至少一些残基可以酶促添加(例如，通过聚合酶如T7聚合酶)。例如，在某些使用m

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，本文公开的5’UTR包含帽近端序列，例如，如本文公开的。在一些实施方案中，帽近端序列包含与5’帽相邻的序列。在一些实施方案中，帽近端序列包含在RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和/或+5位置的核苷酸。

在一些实施方案中，Cap结构包含帽近端序列的一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+1(N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，Cap结构包含帽近端序列的一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+1(N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N

示例性5’UTR包含人α珠蛋白(hAg)5’UTR或其片段、TEV 5’UTR或其片段、HSP70 5’UTR或其片段、或者c-Jun 5’UTR或其片段。

在一些实施方案中，本文公开的RNA包含hAg 5’UTR或其片段。在一些实施方案中，本文公开的RNA包含与SEQ ID NO:11中提供的人α珠蛋白5’UTR具有99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的hAg 5’UTR。在一些实施方案中，本文公开的RNA包含SEQID NO:11中提供的hAg 5’UTR。在一些实施方案中，本文公开的RNA包含与SEQ ID NO:12中提供的人α珠蛋白5’UTR具有99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的hAg5’UTR。在一些实施方案中，本文公开的RNA包含SEQ ID NO:12中提供的hAg 5’UTR。

3’UTR

在一些实施方案中，本文公开的RNA包含3'-UTR。如果存在，3'-UTR位于3'末端，蛋白编码区的终止密码子的下游，但是术语“3'-UTR”优选不包括poly(A)序列。因此，3'-UTR位于poly(A)序列(如果存在)的上游，例如直接与poly(A)序列相邻。

在一些实施方案中，本文公开的RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含F元件和/或I元件。在一些实施方案中，3’UTR或其近端序列包含限制性位点。在一些实施方案中，限制性位点是BamHI位点。在一些实施方案中，限制性位点是XhoI位点。

在一些实施方案中，本文公开的RNA包含与SEQ ID NO:13中提供的3’UTR具有99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的3’UTR。在一些实施方案中，本文公开的RNA包含SEQ ID NO:13中提供的3’UTR。

PolyA

在一些实施方案中，本文公开的RNA包含聚腺苷酸(PolyA)序列，例如，如本文所述。在一些实施方案中，PolyA序列位于3'-UTR的下游，例如，与3'-UTR相邻。

如本文所用，术语“poly(A)序列”或“poly-A尾”是指腺苷酸残基的不间断或间断序列，其通常位于RNA多核苷酸的3'-末端。Poly(A)序列是本领域技术人员已知的，并且可以跟随本文描述的RNA中的3’-UTR。不间断的poly(A)序列的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的poly(A)序列是典型的。本文公开的RNA可以具有转录之后通过不依赖于模板的RNA聚合酶连接至RNA的游离3'-末端的poly(A)序列，或者由DNA编码并由模板依赖性RNA聚合酶转录的poly(A)序列。

已证实约120个A核苷酸的poly(A)序列对转染的真核细胞中的RNA水平以及从存在于poly(A)序列上游(5’)的开放阅读框翻译的蛋白水平具有有益影响(Holtkamp etal.,2006,Blood,vol.108,pp.4009-4017)。

poly(A)序列可以具有任何长度。在一些实施方案中，poly(A)序列包含、基本上由或由以下组成：至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个A核苷酸，特别是约120个A核苷酸。在这种情况下，“基本上由…组成表示”poly(A)序列中的大多数核苷酸，通常poly(A)序列中核苷酸数量的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是A核苷酸，但是允许剩余的核苷酸是除A核苷酸以外的核苷酸，如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在这种情况下，“由…组成”表示poly(A)序列中的所有核苷酸，即，poly(A)序列中核苷酸数量的100％是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。

在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板，在RNA转录期间，例如，在制备体外转录的RNA期间，连接poly(A)序列。编码poly(A)序列的DNA序列(编码链)称作poly(A)盒。

在一些实施方案中，DNA编码链中存在的poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但是被4种核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5-50、10-30或10-20个核苷酸。在WO 2016/005324 A1中公开了这样的盒，其援引加入本文。WO 2016/005324 A1中公开的任何poly(A)盒均可以用于本发明。涵盖这样的poly(A)盒，其基本上由dA核苷酸组成，但是被具有均等分布的4种核苷酸(dA、dC、dG、dT)且具有例如5-50个核苷酸长度的随机序列中断，在DNA水平上在大肠杆菌(E.coli)中表现出质粒DNA的恒定增殖，并且在RNA水平上仍与支持RNA稳定性和翻译效率方面的有益特性相关。在一些实施方案中，本文描述的RNA多核苷酸中包含的poly(A)序列基本上由A核苷酸组成，但是被4种核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5-50、10-30或10-20个核苷酸。

在一些实施方案中，在poly(A)序列的3'-末端侧翼没有除A核苷酸以外的核苷酸，即，poly(A)序列在其3'-末端未被A以外的核苷酸掩盖或跟随。

在一些实施方案中，poly(A)序列可以包含至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列可以基本上由至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(A)序列可以由至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(A)序列包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约150个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约120个核苷酸。

在一些实施方案中，本文公开的RNA包含poly(A)序列，所述poly(A)序列包含SEQID NO:14的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:14的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本文公开的RNA包含SEQ ID NO:14的poly(A)序列。

有效负载

在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸包含编码有效负载的序列，例如，如本文所述。在一些实施方案中，编码有效负载的序列包含启动子序列。在一些实施方案中，编码有效负载的序列包含编码分泌信号肽的序列。

在一些实施方案中，有效负载选自：蛋白替代多肽；抗体物质；细胞因子；抗原多肽；基因编辑组分；再生医学组分或其组合。

在一些实施方案中，有效负载是或包含蛋白替代多肽。在一些实施方案中，蛋白替代多肽包括在疾病或病症中异常表达的多肽。在一些实施方案中，蛋白替代多肽包括细胞内蛋白、细胞外蛋白或跨膜蛋白。在一些实施方案中，蛋白替代多肽包括酶。

在一些实施方案中，多肽表达异常的疾病或病症包括但不限于：罕见疾病、代谢紊乱、肌营养不良、心血管疾病或单基因疾病。

在一些实施方案中，有效负载是或包含抗体物质。在一些实施方案中，抗体物质与细胞上表达的多肽结合。在一些实施方案中，抗体物质包含CD3抗体、Claudin 6抗体或其组合。

在一些实施方案中，有效负载是或包含细胞因子或者其片段或变体。在一些实施方案中，细胞因子包含：IL-12或者其片段或变体或融合物，IL-15或者其片段或变体或融合物，GMCSF或者其片段或变体；或者IFN-α或其片段或变体。

在一些实施方案中，有效负载是或包含抗原多肽或者其免疫原性变体或免疫原性片段。在一些实施方案中，抗原多肽包含来自抗原的一个表位。在一些实施方案中，抗原多肽包含来自抗原的多个不同表位。在一些实施方案中，包含来自抗原的多个不同表位的抗原多肽是多表位的。

在一些实施方案中，抗原多肽包括：来自过敏原的抗原多肽、病毒抗原多肽、细菌抗原多肽、真菌抗原多肽、寄生虫抗原多肽、来自传染源的抗原多肽、来自病原体的抗原多肽、肿瘤抗原多肽或自我抗原多肽。

在一些实施方案中，病毒抗原多肽包括HIV抗原多肽、流感抗原多肽、冠状病毒抗原多肽、狂犬病抗原多肽或Zika病毒抗原多肽。

在一些实施方案中，病毒抗原多肽是或包含冠状病毒抗原多肽。在一些实施方案中，冠状病毒抗原是或包含SARS-CoV-2蛋白。在一些实施方案中，SARS-CoV-2蛋白包含SARS-CoV-2刺突(S)蛋白，或者其免疫原性变体或免疫原性片段。在一些实施方案中，SARS-CoV-2蛋白，或者其免疫原性变体或免疫原性片段，在位置986和987处包含脯氨酸残基。

在一些实施方案中，SARS-CoV-2S多肽与本文公开的SARS-CoV-2S多肽具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S多肽与SEQ ID NO:9具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性。

在一些实施方案中，SARS-CoV-2S多肽由与本文公开的SARS-CoV-2S多核苷酸具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的RNA编码。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S多肽由与SEQ ID NO:10具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的RNA编码。

在一些实施方案中，有效负载是或包含肿瘤抗原多肽或者其免疫原性变体或免疫原性片段。在一些实施方案中，肿瘤抗原多肽包含肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤新抗原或其组合。在一些实施方案中，肿瘤抗原多肽包括p53，ART-4，BAGE，ss-连蛋白/m，Bcr-abL CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK4/m，CEA，CLAUDIN-12，c-MYC，CT，Cyp-B，DAM，ELF2M，ETV6-AML1，G250，GAGE，GnT-V，Gap100，HAGE，HER-2/neu，HPV-E7，HPV-E6，HAST-2，hTERT(或hTRT)，LAGE，LDLR/FUT，MAGE-A，优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12，MAGE-B，MAGE-C，MART-1/Melan-A，MC1R，肌球蛋白/m，MUC1，MUM-1、-2、-3，NA88-A，NF1，NY-ESO-1，NY-BR-1，p190最小BCR-abL，Plac-1，Pm1/RARa，PRAME，蛋白酶3，PSA，PSM，RAGE，RU1或RU2，SAGE，SART-1或SART-3，SCGB3A2，SCP1，SCP2，SCP3，SSX，SURVIVIN，TEL/AML1，TPI/m，TRP-1，TRP-2，TRP-2/INT2，TPTE，WT，WT-1，或者它们的组合。

在一些实施方案中，肿瘤抗原多肽包括来自癌、肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病或其组合的肿瘤抗原。

在一些实施方案中，肿瘤抗原多肽包含黑素瘤肿瘤抗原。

在一些实施方案中，肿瘤抗原多肽包含前列腺癌抗原。

在一些实施方案中，肿瘤抗原多肽包含HPV16阳性头颈癌抗原。

在一些实施方案中，肿瘤抗原多肽包含乳腺癌抗原。

在一些实施方案中，肿瘤抗原多肽包含卵巢癌抗原。

在一些实施方案中，肿瘤抗原多肽包含肺癌抗原。

在一些实施方案中，肿瘤抗原多肽包含NSCLC抗原。

在一些实施方案中，有效负载是或包含自我抗原多肽或者其免疫原性变体或免疫原性片段。在一些实施方案中，自我抗原多肽包含通常在细胞上表达并被免疫系统识别为自我抗原的抗原。在一些实施方案中，自我抗原多肽包括：多发性硬化抗原多肽、类风湿性关节炎抗原多肽、狼疮抗原多肽、乳糜泻抗原多肽、舍格伦(Sjogren)综合征抗原多肽或关节强硬性脊椎炎抗原多肽，或者它们的组合。

示例性多核苷酸

在一些实施方案中，本文描述的RNA多核苷酸或者包含该RNA多核苷酸的组合物或药物制品包含本文公开的核苷酸序列。在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含与本文公开的核苷酸序列具有至少80％相同性的序列。在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含编码与本文公开的多肽序列具有至少80％相同性的多肽的序列。示例性核苷酸和多肽序列例如在表1或本节标题为“示例性多核苷酸”或实施例2中提供。

在一些实施方案中，本文描述的RNA多核苷酸或者包含该RNA多核苷酸的组合物或药物制品由DNA模板转录。在一些实施方案中，用来转录本文描述的RNA多核苷酸的DNA模板包含与RNA多核苷酸互补的序列。

在一些实施方案中，本文描述的有效负载由本文描述的RNA多核苷酸编码，所述RNA多核苷酸包含本文公开的核苷酸序列，例如，在表1或本节标题为“示例性多核苷”或实施例2中。在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含编码与本文公开的多肽有效负载序列具有至少80％相同性的多肽有效负载。在一些实施方案中，本文描述的有效负载由DNA模板转录的RNA多核苷酸编码，所述DNA模板包含与RNA多核苷酸互补的序列。

表1：本文公开的RNA构建体的示例性序列

RBL063.1(SEQ ID NO:28核苷酸；SEQ ID NO:9氨基酸)

结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70

编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)

SEQ ID NO:28

RBL063.2(SEQ ID NO:29核苷酸；SEQ ID NO:9氨基酸)

结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70

编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)

SEQ ID NO:29

BNT162a1；RBL063.3(SEQ ID NO:30核苷酸；SEQ ID NO:21氨基酸)

结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-RBD-GS-次要纤维蛋白(Fibritin)-FI-A30L70

编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))

SEQ ID NO:30

BNT162b2；RBP020.1(SEQ ID NO:31核苷酸；SEQ ID NO:9氨基酸)

结构m

SEQ ID NO:31

RBP020.2(SEQ ID NO:10核苷酸；SEQ ID NO:9氨基酸)(见表1)

结构m

编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)

BNT162b1；RBP020.3(SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:21氨基酸)

结构m

编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(部分序列，融合至次要纤维蛋白的S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))

SEQ ID NO:32

RBS004.1(SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:9氨基酸)

结构β-S-ARCA(D1)-复制酶-S1S2-PP-FI-A30L70

编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S protein)(S1S2全长蛋白，序列变体)

SEQ ID NO:33

RBS004.2(SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:9氨基酸)

结构β-S-ARCA(D1)-复制酶-S1S2-PP-FI-A30L70

编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)

SEQ ID NO:34

BNT162c1；RBS004.3(SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:21氨基酸)

结构β-S-ARCA(D1)-复制酶-RBD-GS-次要纤维蛋白-FI-A30L70

编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))

SEQ ID NO:35

RBS004.4(SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37)

结构β-S-ARCA(D1)-复制酶-RBD-GS-次要纤维蛋白-TM-FI-A30L70

编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))

SEQ ID NO:36

SEQ ID NO:37

BNT162b3c(SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:39)

结构m

编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(部分序列，融合至次要纤维蛋白的S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD)，融合至S1S2蛋白的跨膜结构域(TM))；在抗原序列N-末端的内在S1S2蛋白分泌信号肽(aa 1-19)

SEQ ID NO:38

SEQ ID NO:39

BNT162b3d(SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41)

结构m

编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(部分序列，融合至次要纤维蛋白的S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD)，融合至S1S2的跨膜结构域(TM))；在抗原序列N-末端的免疫球蛋白分泌信号肽(aa 1-22)

SEQ ID NO:40

SEQ ID NO:41

含有核酸的颗粒

本文描述的核酸如编码有效负载的RNA可以配制为颗粒来给药。

在本公开的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。在一些实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米大小的结构，如分散在介质中的微米或纳米大小的致密结构。在一些实施方案中，颗粒是含有核酸的颗粒，如包含DNA、RNA或其混合物的颗粒。

带正电荷的分子如聚合物和脂质与带负电荷的核酸之间的静电相互作用参与颗粒形成。这导致核酸颗粒的复合和自发形成。在一些实施方案中，核酸颗粒是纳米颗粒。

如本公开所用，“纳米颗粒”是指具有适合肠胃外给药的平均直径的颗粒。

“核酸颗粒”可以用来将核酸递送至所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。核酸颗粒可以由至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料、至少一种阳离子聚合物如鱼精蛋白或其混合物以及核酸形成。核酸颗粒包括基于脂质纳米颗粒(LNP)和基于脂质复合体(LPX)的制剂。

不受任何理论的束缚，据信阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料和/或阳离子聚合物与核酸结合在一起形成聚集体，并且这种聚集导致胶体稳定的颗粒。

在一些实施方案中，本文描述的颗粒进一步包含除阳离子或阳离子可电离脂质或脂质样材料以外的至少一种脂质或脂质样材料，除阳离子聚合物以外的至少一种聚合物，或者它们的混合物。

在一些实施方案中，核酸颗粒包含不止一种类型的核酸分子，其中核酸分子的分子参数可以互相相似或不同，例如关于摩尔质量或基本结构要素如分子结构、加帽、编码区或其他特征。本文描述的核酸颗粒的平均直径在一些实施方案中可以为约30nm至约1000nm、约50nm至约800nm、约70nm至约600nm、约90nm至约400nm、约100nm至约300nm。

本文描述的核酸颗粒可以表现出少于约0.5、少于约0.4、少于约0.3或约0.2或更少的多分散性指数。举例来说，所述核酸颗粒可以表现出在约0.1至约0.3或约0.2至约0.3的范围内的多分散性指数。

关于RNA脂质颗粒，N/P比例给出脂质中的氮基团比RNA中的磷酸基团数量的比例。它与电荷比例相关，因为氮原子(取决于pH)通常带正电荷，而磷酸基团带负电荷。当存在电荷平衡时，N/P比例取决于pH。脂质制剂通常以大于4最多12的N/P比例形成，因为认为带正电荷的纳米颗粒有利于转染。在这种情况下，认为RNA完全结合至纳米颗粒。

本文描述的核酸颗粒可以使用广泛的方法制备，所述方法可以包括从至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料和/或至少一种阳离子聚合物获得胶体，并且将胶体与核酸混合以获得核酸颗粒。

如本文所用的术语“胶体”涉及其中分散的颗粒不沉淀的均匀混合物的类型。混合物中的不溶性颗粒是微观的，粒径在1-1000纳米之间。该混合物可以称为胶体或胶体悬浮液。有时术语“胶体”仅指混合物中的颗粒而不是整个悬浮液。

对于包含至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料和/或至少一种阳离子聚合物的胶体的制备，常规用于制备脂质体囊泡并适当调整的方法可适用于本文。制备脂质体囊泡的最常用方法享有以下基本步骤：(i)将脂质溶于有机溶剂中，(ii)干燥所得的溶液，以及(iii)将干燥的脂质水合(使用各种水性介质)。

在膜水合方法中，首先将脂质溶于合适的有机溶剂中，然后干燥以在烧瓶底部产生薄膜。使用适当的水性介质将获得的脂质膜水合以产生脂质体分散体。此外，可以包括额外的缩小步骤。

反相蒸发是用于制备脂质体囊泡的膜水合的可选方法，其涉及在水相和含有脂质的有机相之间形成油包水乳液。为了系统均质化，需要对这种混合物进行简短的超声处理。在减压下去除有机相产生乳状凝胶，其随后变为脂质体悬浮液。

术语“乙醇注射技术”是指这样的过程，其中通过针头将包含脂质的乙醇溶液快速注射至水性溶液中。这个行为将脂质分散在整个溶液中，并且促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成如脂质体形成。一般来说，本文描述的RNA脂质复合体颗粒可通过将RNA添加至胶体脂质体分散体来获得。在一些实施方案中，利用乙醇注射技术，如下形成这种胶体脂质体分散体：在搅拌下将包含脂质如阳离子脂质和额外脂质的乙醇溶液注射至水性溶液中。在一些实施方案中，本文描述的RNA脂质复合体颗粒无需挤出步骤即可获得。

术语“挤出(extruding)”或“挤出(extrusion)”是指产生具有固定的横截面轮廓的颗粒。特别地，其是指颗粒的缩小，由此迫使颗粒通过具有限定孔的过滤器。

具有不含有机溶剂特征的其他方法也可以根据本公开用于制备胶体。

LNP通常包含4种组分：可电离的阳离子脂质，中性脂质如磷脂，类固醇如胆固醇和聚合物缀合的脂质如聚乙二醇(PEG)-脂质。每种组分负责有效负载保护，并且实现高效的细胞内递送。LNP可以通过将溶于乙醇的脂质与水性缓冲液中的核酸快速混合来制备。

术语“平均直径”是指通过动态激光散射(DLS)并使用所谓的累积量算法进行数据分析而测得的颗粒的平均流体动力学直径，其结果是提供具有一定长度尺寸的所谓的Zaverage，以及无量纲的多分散性指数(PI)(Koppel,D.,J.Chem.Phys.57,1972,pp 4814-4820,ISO 13321)。这里颗粒的“平均直径”、“直径”或“大小”与Zaverage的这个值同义使用。

“多分散性指数”优选基于动态光散射测量，通过“平均直径”的定义中提到的所谓的累积量分析来计算。在某些先决条件下，可以将其作为纳米颗粒整体大小分布的度量。

以前已描述了不同类型的含有核酸的颗粒适合递送颗粒形式的核酸(例如Kaczmarek,J.C.et al.,2017,Genome Medicine 9,60)。对于非病毒核酸递送媒介物，核酸的纳米颗粒包封物理上保护核酸免于降解，并且取决于特定化学，可以辅助细胞摄取和内体逃逸。

本公开描述了包含核酸、至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料和/或至少一种与核酸缔合的阳离子聚合物以形成核酸颗粒的颗粒，以及包含这类颗粒的组合物。所述核酸颗粒可以包含通过非共价相互作用以不同形式与颗粒复合的核酸。本文描述的颗粒不是病毒颗粒，特别是传染性病毒颗粒，即，它们不能病毒式地感染细胞。

合适的阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料以及阳离子聚合物是形成核酸颗粒的那些，并且包括在术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成物质”中。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成物质”涉及与核酸缔合以形成核酸颗粒的任何组分。这类组分包括可以是核酸颗粒的一部分的任何组分。

本文描述的一些实施方案涉及包括一种以上，例如2、3、4、5、6或甚至更多种核酸物质如RNA肿瘤的组合物、方法和用途，例如，a)包含第一核苷酸序列的核酸，所述第一核苷酸序列编码包含亲代病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中将亲代病毒蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置修饰为包含在一个或多个病毒蛋白变体的相应氨基酸位置中发现的氨基酸；以及b)包含第二核苷酸序列的核酸，所述第二核苷酸编码包含亲代病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中将亲代病毒蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置修饰为包含在一个或多个病毒蛋白变体的相应氨基酸位置中发现的氨基酸。

在微粒制剂中，有可能将每种核酸物质分别配制为单独的微粒制剂。在这种情况下，每种单独的微粒制剂会包含一种核酸物质。单个微粒制剂可以作为单独的实体存在，例如在单独的容器中。这类制剂可通过分别提供每种核酸物质(通常每种以含有核酸的溶液形式)连同颗粒形成物质，从而允许形成颗粒来获得。各自的颗粒会只包含在形成颗粒时提供的特定核酸物质(单独的微粒制剂)。

在一些实施方案中，组合物如药物组合物包含一种以上单独的颗粒制剂。各自的药物组合物称作混合微粒制剂。根据本发明的混合微粒制剂可通过如上文所述分别形成单独的微粒制剂，然后混合单独的微粒制剂的步骤获得。通过混合的步骤，可获得包含含有核酸颗粒的混合群体的制剂。单独的微粒群体可以一起在一个容器中，包含单独的微粒制剂的混合群体。

或者，有可能将不同的核酸物质一起配制为组合的微粒制剂。这类制剂可通过提供不同RNA物质的组合制剂(通常是组合溶液)连同颗粒形成物质，从而允许形成颗粒来获得。与混合微粒制剂相反，组合微粒制剂通常包含颗粒，所述颗粒包含一种以上的RNA物质。在组合微粒组合物中，不同的RNA物质通常一起存在于单个颗粒中。

鉴于它们高度的化学柔韧性，聚合材料通常用于基于纳米颗粒的递送。通常，阳离子材料用来将带负电荷的核酸静电凝聚为纳米颗粒。这些带正电荷的基团通常由胺组成，所述胺在5.5-7.5的pH范围内改变它们的质子化状态，据认为这引起离子失衡，导致内体破裂。聚合物如聚-L-赖氨酸、聚酰胺胺、鱼精蛋白和聚乙烯亚胺以及天然存在的聚合物如壳聚糖全部已应用于核酸递送，并且适合作为本文一些实施方案中有用的阳离子材料。此外，一些研究者已合成了专门用于核酸递送的聚合材料。特别地，聚(β-氨基酯)由于其易于合成和生物可降解性而在核酸递送中获得了广泛应用。在一些实施方案中，这类合成材料可以适合用作本文中的阳离子材料。

如本文所用，“聚合材料”具有其通常的含义，即，包含通过共价键连接的一个或多个重复单元(单体)的分子结构。在一些实施方案中，这类重复单元可以全部相同；或者，在某些情况下，在聚合材料内可以存在一种以上类型的重复单元。在某些情况下，聚合材料是生物衍生的，例如，生物聚合物如蛋白。在某些情况下，聚合材料中还可以存在额外的部分，例如靶向部分，如本文中描述的那些。

本领域技术人员知道，当聚合物(或聚合部分)内存在一种以上类型的重复单元时，则所述聚合物(或聚合部分)称为“共聚物”。在一些实施方案中，根据本公开使用的聚合物(或聚合部分)可以是共聚物。形成共聚物的重复单元可以以任何方式排列。例如，在一些实施方案中，重复单元可以以随机顺序排列；可选地或额外地，在一些实施方案中，重复单元可以以交替顺序排列，或者作为“嵌段”共聚物，即，包含一个或多个区域，每个区域包含第一重复单元(例如，第一嵌段)，以及一个或多个区域，每个区域包含第二重复单元(例如，第二嵌段)，等等。嵌段共聚物可以具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数量的不同嵌段。

在某些实施方案中，根据本公开使用的聚合材料是生物相容性的。生物相容性材料是那些在中等浓度下通常不会导致显著的细胞死亡的材料。在某些实施方案中，生物相容性材料是生物可降解的，即，能够在生理环境内如体内化学和/或生物降解。

在某些实施方案中，聚合材料可以是或包含鱼精蛋白或聚亚烷基亚胺，特别是鱼精蛋白。

正如本领域技术人员所知，术语“鱼精蛋白”常用于指各种相对低分子量的强碱性蛋白，其富含精氨酸，并且发现在各种动物(如鱼)的精细胞中代替体细胞组蛋白特别与DNA关联。特别地，术语“鱼精蛋白”常用于指在鱼精子中发现的蛋白，其是强碱性的，在水中可溶，通过加热不凝结，并且在水解时主要产生精氨酸。在纯化形式中，它们用于胰岛素的长效制剂以及中和肝素的抗凝作用。

在一些实施方案中，如本文所用的术语“鱼精蛋白”是指获得自或源自天然或生物来源的任何鱼精蛋白氨基酸序列，包括其片段和/或所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式，以及(合成的)多肽，所述(合成的)多肽是人工的，专门设计用于特定目的，并且不可以从天然或生物来源分离。

在一些实施方案中，聚亚烷基亚胺包含聚乙烯亚胺和/或聚丙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺。在一些实施方案中，优选的聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中，PEI的平均分子量是优选0.75·102-107Da，优选1000-105Da，更优选10000-40000Da，更优选15000-30000Da，甚至更优选20000-25000Da。

根据本公开的某些实施方案优选线性聚亚烷基亚胺如线性聚乙烯亚胺(PEI)。

本文中考虑使用的阳离子材料(例如，聚合材料，包括聚阳离子聚合物)包括那些能够静电结合核酸的材料。在一些实施方案中，本文中考虑使用的阳离子聚合物包括核酸可以与其缔合的任何阳离子聚合材料，例如通过与核酸形成复合物或者形成其中包围或包封核酸的囊泡。

在一些实施方案中，本文描述的颗粒可以包含除阳离子聚合物以外的聚合物，即，非阳离子聚合材料和/或阴离子聚合材料。阴离子和中性聚合材料在本文中统称为非阳离子聚合材料。

脂质和脂质样材料

术语“脂质”和“脂质样材料”在本文中用于指包含一个或多个疏水部分或基团以及任选地还包括一个或多个亲水部分或基团的分子。包含疏水部分和亲水部分的分子也常称作两亲分子。脂质通常难溶于水。在水性环境中，两亲性质允许分子自组装为有组织的结构和不同的相。那些相之一由脂质双层组成，因为它们存在于水性环境中的囊泡、多层/单层脂质体或膜中。可以通过包含非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂肪烃基以及被一个或多个芳香族、脂环族或杂环基团取代的这类基团。在一些实施方案中，亲水基团可以包含极性和/或带电荷的基团，并且包括碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团。

如本文所用，术语“两亲性”是指具有极性部分和非极性部分的分子。通常，两亲性化合物具有连接至长疏水尾的极性头。在一些实施方案中，极性部分可溶于水，而非极性部分不溶于水。此外，极性部分可以具有形式上的正电荷或形式上的负电荷。或者，极性部分可以具有形式上的正电荷和负电荷，并且可以是两性离子或内盐。为了本公开的目的，两亲性化合物可以是但不限于一种或多种天然或非天然脂质和脂质样化合物。

术语“脂质样材料”、“脂质样化合物”或“脂质样分子”涉及在结构和/或功能上与脂质相关但在严格意义上不可以视为脂质的物质。例如，该术语包括在水性环境中存在于囊泡、多层/单层脂质体或膜中时能够形成两亲性层的化合物，并且包括表面活性剂或者具有亲水和疏水部分的合成化合物。一般来说，该术语是指分子，其包含具有不同结构组织的亲水和疏水部分，其可以与脂质结构组织相似或不同。如本文所用，术语“脂质”解释为涵盖脂质和脂质样材料，除非本文另有说明或明显与上下文矛盾。

可以包括在两亲性层中的两亲性化合物的具体实例包括但不限于磷脂、氨基脂质和鞘脂。

在某些实施方案中，两亲性化合物是脂质。术语“脂质”是指一组有机化合物，其特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。一般来说，脂质可以分为8类：脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮(源自酮酰亚基的缩合)、固醇脂质和异戊烯醇脂质(源自异戊二烯亚基的缩合)。尽管有时将术语“脂质”用作脂肪的同义词，但脂肪是称作甘油三酯的脂质亚组。脂质还涵盖分子如脂肪酸和它们的衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、单甘油酯和磷脂)，以及包含固醇的代谢物如胆固醇。

脂肪酸或脂肪酸残基是由以羧酸基团终止的烃链形成的一组不同分子；这种排列赋予分子极性、亲水末端，以及不溶于水的非极性、疏水末端。通常长度为4-24个碳的碳链可以是饱和或不饱和的，并且可以连接至包含氧、卤素、氮和硫的官能团。如果脂肪酸包含双键，则可能具有顺式或反式几何异构现象，这显著影响分子的构型。顺式双键使脂肪酸链弯曲，这种作用与链中更多的双键混合在一起。脂肪酸类别中的其他主要脂质类别是脂肪酯和脂肪酰胺。

甘油脂包括单、二和三取代的甘油，最著名的是甘油的脂肪酸三酯，称作甘油三酯。词语“三酰甘油”有时与“甘油三酯”同义使用。在这些化合物中，甘油的三个羟基通常被不同脂肪酸各自酯化。甘油脂的其他亚类由糖基甘油代表，其特征在于存在通过糖苷键连接至甘油的一个或多个糖残基。

甘油磷脂是两亲性分子(包含疏水区和亲水区)，其包含甘油核心，所述甘油核心通过酯键连接至两个脂肪酸衍生的“尾部”，并且通过磷酸酯键连接至一个“头部”基团。通常称作磷脂(尽管鞘磷脂也被分类为磷脂)的甘油磷脂的实例有磷脂酰胆碱(也称作PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)和磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)。

鞘脂是一个复杂的化合物家族，其享有一个共同结构特征，鞘氨醇碱骨架。哺乳动物中的主要鞘氨醇碱通常称作鞘氨醇。神经酰胺(N-酰基-鞘氨醇碱)是鞘氨醇碱衍生物的主要亚类，其具有酰胺连接的脂肪酸。脂肪酸通常是饱和或单不饱和的，具有16-26个碳原子的链长度。哺乳动物的主要磷脂鞘酯是鞘磷脂(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要包含神经酰胺磷酸乙醇胺，真菌则具有植物神经酰胺磷酸肌醇和包含甘露糖的头基。鞘糖脂是一个多样化的分子家族，其包括一个或多个通过糖苷键连接至鞘氨醇碱的糖残基。这些的实例有简单和复杂的鞘糖脂如脑苷脂和神经节苷脂。

固醇脂质，如胆固醇及其衍生物，或者生育酚及其衍生物，与甘油磷脂和鞘磷脂一起是膜脂质的重要组分。

糖脂描述其中脂肪酸直接连接至糖骨架，形成与膜双层相容的结构的化合物。在糖脂中，单糖取代了甘油脂和甘油磷脂中存在的甘油骨架。最熟悉的糖脂是革兰氏阴性细菌中脂多糖的脂质A组分的酰化葡糖胺前体。典型的脂质A分子是葡糖胺的二糖，其由多达七条脂肪-酰基链衍生而成。在大肠杆菌生长中需要的最小脂多糖是Kdo2-脂质A，用两个3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(3-deoxy-D-manno-octulosonic acid,Kdo)残基糖基化的葡糖胺的六酰化二糖。

聚酮是通过经典酶以及与脂肪酸合成酶享有机理特征(mechanistic feature)的迭代和多模块酶聚合乙酰基和丙酰基亚基合成的。它们包含来自动物、植物、细菌、真菌和海洋来源的大量次级代谢物和天然产物，并且具有很大的结构多样性。许多聚酮是环状分子，其骨架通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化或其他过程进一步修饰。

根据本公开，脂质和脂质样材料可以是阳离子、阴离子或中性的。中性脂质或脂质样材料在所选pH下以不带电荷或中性的两性离子形式存在。

在一些实施方案中，根据本公开描述和/或使用的核酸颗粒可以包含至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料作为颗粒形成物质。预期用于本文的阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料包括能够静电结合核酸的任何阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料。在一些实施方案中，预期用于本文的阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料可以与核酸缔合，例如通过与核酸形成复合物或者形成其中包围或包封核酸的囊泡。

如本文所用，“阳离子脂质”或“阳离子脂质样材料”是指具有净正电荷的脂质或脂质样材料。阳离子脂质或脂质样材料通过静电相互作用结合带负电荷的核酸。一般来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，如固醇、酰基链、二酰基或更多个酰基链，并且脂质的头基通常带有正电荷。

在某些实施方案中，阳离子脂质或脂质样材料仅在某些pH下，特别是在酸性pH下具有净正电荷，而在不同的，优选较高的pH如生理pH下，其优选没有净正电荷，优选没有电荷，即，其是中性的。与在生理pH下保持阳离子状态的颗粒相比，据认为这种可电离的行为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强效力。

为了本公开的目的，除非与语境矛盾，否则术语“阳离子脂质或脂质样材料”包含这类“阳离子可电离的”脂质或脂质样材料。

在一些实施方案中，阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料包含头基，所述头基包括至少一个带正电荷或能够质子化的氮原子(N)。

阳离子脂质的实例包括但不限于：((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-癸酸己酯)(((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate))、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane,DOTAP)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基丙胺(N,N-dimethyl-2,3-dioleyloxypropylamine,DODMA)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane,DOTMA)、3-(N—(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(3-(N—(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol,DC-Chol)、二甲基双十八烷基铵(dimethyldioctadecylammonium,DDAB)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane,DODAP)、1,2-二酰基氧基-3-二甲基铵丙烷(1,2-diacyloxy-3-dimethylammonium propane)、1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷(1,2-dialkyloxy-3-dimethylammonium propane)、双十八烷基二甲基氯化铵(dioctadecyldimethyl ammonium chloride,DODAC)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(1,2-distearyloxy-N,N-dimethyl-3-aminopropane,DSDMA)、2,3-二(十四烷基氧基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基氨鎓(2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium,DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine,DMEPC)、l,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(l,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium propane,DMTAP)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(1,2-dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammoniumbromide,DORIE)和2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-丙胺鎓三氟乙酸盐(2,3-dioleoyloxy-N-[2(spermine carboxamide)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propanamium trifluoroacetate,DOSPA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane,DLinDMA)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane,DLenDMA)、双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(dioctadecylamidoglycyl spermine,DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯基氧基)丙烷(3-dimethylamino-2-(cholest-5-en-3-beta-oxybutan-4-oxy)-1-(cis,cis-9,12-oc-tadecadienoxy)propane,CLinDMA)、2-[5′-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3′-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9′,12′-十八碳二烯氧基)丙烷(2-[5′-(cholest-5-en-3-beta-oxy)-3′-oxapentoxy)-3-dimethyl-1-(cis,cis-9′,12′-octadecadienoxy)propane,CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺(N,N-dimethyl-3,4-dioleyloxybenzylamine,DMOBA)、1,2-N,N′-二油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(1,2-N,N′-dioleylcarbamyl-3-dimethylaminopropane,DOcarbDAP)、2,3-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基丙胺(2,3-Dilinoleoyloxy-N,N-dimethylpropylamine,DLinDAP)、1,2-N,N′-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(1,2-N,N′-Dilinoleylcarbamyl-3-dimethylaminopropane,DLincarbDAP)、1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(1,2-Dilinoleoylcarbamyl-3-dimethylaminopropane,DLinCDAP)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl-[1,3]-dioxolane,DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane,DLin-K-XTC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane,DLin-KC2-DMA)、三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl-4-(dimethylamino)butanoate,DLin-MC3-DMA)、N-(2-羟基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物(N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminium bromide,DMRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺式-9-十四烯基氧基)-1-丙胺鎓溴化物((±)-N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(cis-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium bromide,GAP-DMORIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物((±)-N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)-1-propanaminium bromide,GAP-DLRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物((±)-N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminium bromide,GAP-DMRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物(N-(2-Aminoethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminium bromide,βAE-DMRIE)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙烷-1-胺鎓(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium,DOBAQ)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(2-({8-[(3β)-cholest-5-en-3-yloxy]octyl}oxy)-N,N-dimethyl-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]propan-1-amine,Octyl-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane,DMDAP)、1,2-二棕榈酰-3-二甲基铵-丙烷(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane,DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基羧酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide,MVL5)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine,DOEPC)、2,3-双(十二烷基氧基)-N-(2-羟基乙基)-N,N-二甲基丙烷-1-溴化铵(2,3-bis(dodecyloxy)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethylpropan-1-amonium bromide,DLRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)丙烷-1-胺鎓溴化物(N-(2-aminoethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)propan-1-aminium bromide,DMORIE)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8'-((((2(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮烷二基)二辛酸酯(di((Z)-non-2-en-1-yl)8,8'-((((2(dimethylamino)ethyl)thio)carbonyl)azanediyl)dioctanoate,ATX)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)丙烷-1-胺(N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)propan-1-amine,DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)丙烷-1-胺(N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)propan-1-amine,DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(Di((Z)-non-2-en-1-yl)-9-((4-(dimethylaminobutanoyl)oxy)heptadecanedioate,L319)、N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基氨基)丙酰胺(N-Dodecyl-3-((2-dodecylcarbamoyl-ethyl)-{2-[(2-dodecylcarbamoyl-ethyl)-2-{(2-dodecylcarbamoyl-ethyl)-[2-(2-dodecylcarbamoyl-ethylamino)-ethyl]-amino}-ethylamino)propionamide,lipidoid 98N12-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(1-[2-[bis(2-hydroxydodecyl)amino]ethyl-[2-[4-[2-[bis(2hydroxydodecyl)amino]ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]amino]dodecan-2-ol,lipidoid C12-200)、或十七烷-9-基8-((2-羟基乙基)(6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基)氨基)辛酸酯(heptadecan-9-yl8-((2-hydroxyethyl)(6-oxo-6-(undecyloxy)hexyl)amino)octanoate,SM-102)。

在一些实施方案中，阳离子脂质是或包含十七烷-9-基8-((2-羟基乙基)(6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基)氨基)辛酸酯(SM-102)。在一些实施方案中，阳离子脂质是或包含以下结构中所示的阳离子脂质。

在一些实施方案中，阳离子脂质是或包含((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-癸酸己酯)，在本文中也称作ALC-0315。

在一些实施方案中，阳离子脂质可以占颗粒中存在的总脂质的约10摩尔(mol)％至约100摩尔％、约20摩尔％至约100摩尔％、约30摩尔％至约100摩尔％、约40摩尔％至约100摩尔％或约50摩尔％至约100摩尔％。

在一些特定实施方案中，根据本公开使用的颗粒包括ALC-0315，例如在总脂质的约40-55摩尔百分比范围内的重量百分比。

在一些实施方案中，本文描述的颗粒包含(例如，除了阳离子脂质如ALC315)，除阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料以外的一种或多种脂质或脂质样材料，例如，非阳离子脂质或脂质样材料(包括非阳离子可电离的脂质或脂质样材料)。阴离子和中性脂质或脂质样材料在本文中统称为非阳离子脂质或脂质样材料。通过添加除可电离/阳离子脂质或脂质样材料以外的其他疏水部分如胆固醇和脂质来优化核酸颗粒的制剂，可以增强颗粒稳定性和核酸递送的效力。

可以掺入额外的脂质或脂质样材料，其可以影响或不影响核酸颗粒的总电荷。在某些实施方案中，额外的脂质或脂质样材料是非阳离子脂质或脂质样材料。非阳离子脂质可以包含例如一种或多种阴离子脂质和/或中性脂质。如本文所用，“阴离子脂质”是指在所选pH下带负电荷的任何脂质。如本文所用，“中性脂质”是指在所选pH下以不带电荷或中性的两性离子形式存在的多种脂质种类中的任一种。在优选的实施方案中，额外的脂质包含以下中性脂质组分之一：(1)磷脂，(2)胆固醇或其衍生物；或者(3)磷脂以及胆固醇或其衍生物的混合物。胆固醇衍生物的实例包括但不限于胆甾烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪固醇、胆固醇基-2'-羟基乙基醚、胆固醇基-4'-羟基丁基醚、生育酚及其衍生物，以及它们的混合物。

可以使用的特定磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。这类磷脂特别包括二酰基磷脂酰胆碱，如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine,DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine,DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine,DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱(dipentadecanoylphosphatidylcholine)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(dilauroylphosphatidylcholine)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine,DPPC)、二花生四烯酰基磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine，DAPC)、二二十二酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine,DBPC)、二二十三酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine,DTPC)、二二十四酰基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine,DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine,POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine,18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine,C16Lyso PC)和磷脂酰乙醇胺，特别是二酰基磷脂酰乙醇胺，如二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine,DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(distearoyl-phosphatidylethanolamine,DSPE)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine,DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dimyristoyl-phosphatidylethanolamine,DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dilauroyl-phosphatidylethanolamine,DLPE)、二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(diphytanoyl-phosphatidylethanolamine,DPyPE)，以及具有不同疏水链的其他磷脂酰乙醇胺脂质。

在某些优选的实施方案中，额外的脂质是DSPC或DSPC和胆固醇。

在某些实施方案中，核酸颗粒包括阳离子脂质和额外的脂质。

在一些实施方案中，本文描述的颗粒包括聚合物缀合的脂质如聚乙二醇化的脂质。术语“聚乙二醇化的脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化的脂质是本领域已知的。在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质是ALC-0159，在本文中也称作(2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺)。

不希望受理论束缚，与至少一种额外脂质的量相比，至少一种阳离子脂质的量可能影响重要的核酸颗粒特征，如电荷、粒径、稳定性、组织选择性和核酸的生物活性。因此，在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质比至少一种额外脂质的摩尔比是约10:0至约1:9、约4:1至约1:2或约3:1至约1:1。

在一些实施方案中，非阳离子脂质，特别是中性脂质(例如，一种或多种磷脂和/或胆固醇)可以包含颗粒中存在的总脂质的约0摩尔％至约90摩尔％、约0摩尔％至约80摩尔％、约0摩尔％至约70摩尔％、约0摩尔％至约60摩尔％或约0摩尔％至约50摩尔％。

在一些实施方案中，根据本公开使用的颗粒可以包括例如ALC-0315、DSPC、CHOL和ALC-0159，例如，其中ALC-0315占约40-55摩尔％；DSPC占约5-15摩尔％；CHOL占约30-50摩尔％；ALC-0159占约1-10摩尔％。

在本公开的某些实施方案中，RNA可以存在于RNA脂质复合体颗粒中。

在本公开的上下文中，术语“RNA脂质复合体颗粒”涉及包含脂质，特别是阳离子脂质和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNA脂质复合体颗粒的复合(complexation)和自发形成。带正电荷的脂质体一般可以利用阳离子脂质如DOTMA和额外的脂质如DOPE合成。在一些实施方案中，RNA脂质复合体颗粒是纳米颗粒。

在某些实施方案中，RNA脂质复合体颗粒包括阳离子脂质和额外的脂质。在示例性实施方案中，阳离子脂质是DOTMA，额外的脂质是DOPE。

在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质比至少一种额外脂质的摩尔比是约10:0至约1:9、约4:1至约1:2或约3:1至约1:1。在具体实施方案中，所述摩尔比可以是约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1或约1:1。在示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质比至少一种额外脂质的摩尔比是约2:1。

本文描述的RNA脂质复合体颗粒的平均直径在一些实施方案中为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm或约350nm至约400nm。在具体实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm或约1000nm。在一实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约250nm至约700nm。在另一实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约300nm至约500nm。在一示例性实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约400nm。

在一些实施方案中，本文描述的RNA脂质复合体颗粒和或包含RNA脂质复合体颗粒的组合物可用于在肠胃外给药之后，特别是静脉内给药之后，将RNA递送至靶组织。在一些实施方案中，可以使用脂质体制备RNA脂质复合体颗粒，所述脂质体可以通过将脂质在乙醇中的溶液注射至水或合适的水相中来获得。在一些实施方案中，所述水相具有酸性pH。在一些实施方案中，所述水相包含乙酸，例如，约5mM的量。通过将脂质体与RNA混合，脂质体可以用于制备RNA脂质复合体颗粒。在一些实施方案中，脂质体和RNA脂质复合体颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种额外的脂质。在一些实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)。在一些实施方案中，所述至少一种额外的脂质包含1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。在一些实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种额外的脂质包含1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一些实施方案中，脂质体和RNA脂质复合体颗粒包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。

WO 2013/143683中描述了靶向脾的RNA脂质复合体颗粒，其援引加入本文。已发现具有净负电荷的RNA脂质复合体颗粒可以用来优先靶向脾组织或脾细胞如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在给药RNA脂质复合体颗粒之后，在脾中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质复合体颗粒可以用于在脾中表达RNA。在一实施方案中，在给药RNA脂质复合体颗粒之后，在肺和/或肝中不发生或基本上不发生RNA积累和/或RNA表达。在一些实施方案中，在给药RNA脂质复合体颗粒之后，在抗原呈递细胞如脾中的专职抗原呈递细胞中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质复合体颗粒可以用于在这类抗原呈递细胞中表达RNA。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。

在一些实施方案中，本文描述的核酸如RNA以脂质纳米颗粒(LNP)的形式给药。LNP可以包含能够形成颗粒的任何脂质，一个或多个核酸分子附着在所述脂质上，或者一个或多个核酸分子包封在所述脂质中。

在一些实施方案中，LNP包含一种或多种阳离子脂质，以及一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和聚乙二醇化的脂质。

在一些实施方案中，LNP包含阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质；以及RNA，其包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合。

在一些实施方案中，LNP包含40-55摩尔％、40-50摩尔％、41-49摩尔％、41-48摩尔％、42-48摩尔％、43-48摩尔％、44-48摩尔％、45-48摩尔％、46-48摩尔％、47-48摩尔％或47.2-47.8摩尔％的阳离子脂质。在一些实施方案中，LNP包含约47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9或48.0摩尔％的阳离子脂质。

在一些实施方案中，中性脂质以5-15摩尔％、7-13摩尔％或9-11摩尔％的浓度存在。在一些实施方案中，中性脂质以约9.5、10或10.5摩尔％的浓度存在。

在一些实施方案中，类固醇以30-50摩尔％、35-45摩尔％或38-43摩尔％的浓度存在。在一些实施方案中，类固醇以约40、41、42、43、44、45或46摩尔％的浓度存在。

在一些实施方案中，LNP包含1-10摩尔％、1-5摩尔％或1-2.5摩尔％的聚合物缀合的脂质。

在一些实施方案中，LNP包含40-50摩尔％的阳离子脂质；5-15摩尔％的中性脂质；35-45摩尔％的类固醇；1-10摩尔％的聚合物缀合的脂质；以及RNA，其包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合。

在一些实施方案中，基于脂质纳米颗粒中存在的脂质的总摩尔确定摩尔％。

在一些实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SM。在一些实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。

在一些实施方案中，类固醇是胆固醇。

在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化的脂质。在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质具有以下结构：

或者其药学可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：

R12和R13各自独立地是包含10-30个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链，其中所述烷基链任选地被一个或多个酯键中断；并且w的平均值为30-60。在一些实施方案中，R12和R13各自独立地是包含12-16个碳原子的直链、饱和的烷基链。在一些实施方案中，w的平均值为40-55。在一些实施方案中，平均w为约45。在一些实施方案中，R12和R13各自独立地是包含约14个碳原子的直链、饱和的烷基链，并且w的平均值为约45。

在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质是DMG-PEG 2000，例如，具有以下结构：

在一些实施方案中，LNP的阳离子脂质组分具有式(III)的结构：

或者其药学可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：

L1或L2之一是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一个是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接的键；

G1和G2各自独立地是未被取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；

G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；

Ra是H或C1-C12烷基；

R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；

R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或–NR5C(＝O)R4；

R4是C1-C12烷基；

R5是H或C1-C6烷基；并且

x是0、1或2。

在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：

其中：

A是3-8元环烷基或亚环烷基环；

在每次出现时，R6独立地是H、OH或C1-C24烷基；

n是1-15的整数。

在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有结构(IIIA)，而在其他实施方案中，脂质具有结构(IIIB)。

在式(III)的其他实施方案中，脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：

其中y和z各自独立地是1-12的整数。

在式(III)的任何前述实施方案中，L1或L2之一是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是-O(C＝O)-。在前述任一项的一些不同实施方案中，L1和L2各自独立地是-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是-(C＝O)O-。

在式(III)的一些不同实施方案中，脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)之一：

在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)之一：

在式(III)的一些前述实施方案中，n是2-12的整数，例如2-8或2-4。例如，在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。

在式(III)的一些其他前述实施方案中，y和z各自独立地是2-10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是4-9或4-6的整数。

在式(III)的一些前述实施方案中，R6是H。在其他前述实施方案中，R6是C1-C24烷基。在其他实施方案中，R6是OH。

在式(III)的一些实施方案中，G3是未被取代的。在其他实施方案中，G3是取代的。在各种不同实施方案中，G3是线性C1-C24亚烷基或线性C1-C24亚烯基。

在式(III)的一些其他前述实施方案中，R1或R2或两者是C6-C24烯基。例如，在一些实施方案中，R1和R2各自独立地具有以下结构：

其中：

在每次出现时，R7a和R7b独立地是H或C1-C12烷基；并且

a是2-12的整数，

其中各自选择R7a、R7b和a，从而R1和R2各自独立地包含6-20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是5-9或8-12的整数。

在式(III)的一些前述实施方案中，R7a的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，在每次出现时R7a是H。在前述其他不同实施方案中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。

在式(III)的不同实施方案中，R1或R2或两者具有以下结构之一：

在式(III)的一些前述实施方案中，R3是OH、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或–NHC(＝O)R4。在一些实施方案中，R4是甲基或乙基。

在各种不同实施方案中，式(III)的阳离子脂质具有下表所示的结构之一。

式(III)的代表性化合物。

在一些实施方案中，LNP包含式(III)的脂质、RNA、中性脂质、类固醇和聚乙二醇化的脂质。在一些实施方案中，式(III)的脂质是化合物III-3。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。在一些实施方案中，类固醇是胆固醇。在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质是ALC-0159。

在一些实施方案中，阳离子脂质以约40至约50摩尔百分比的量存在于LNP中。在一些实施方案中，中性脂质以约5至约15摩尔百分比的量存在于LNP中。在一些实施方案中，类固醇以约35至约45摩尔百分比的量存在于LNP中。在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质以约1至约10摩尔百分比的量存在于LNP中。

在一些实施方案中，LNP包含约40至约50摩尔百分比量的化合物III-3，约5至约15摩尔百分比量的DSPC，约35至约45摩尔百分比量的胆固醇，以及约1至约10摩尔百分比量的ALC-0159。

在一些实施方案中，LNP包含约47.5摩尔百分比量的化合物III-3，约10摩尔百分比量的DSPC，约40.7摩尔百分比量的胆固醇，以及约1.8摩尔百分比量的ALC-0159。

在各种不同实施方案中，阳离子脂质具有下表所示的结构之一。

在一些实施方案中，LNP包含上表所示的阳离子脂质，例如，式(B)或式(D)的阳离子脂质，特别是式(D)的阳离子脂质，RNA，中性脂质，类固醇和聚乙二醇化的脂质。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。在一些实施方案中，类固醇是胆固醇。在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质是DMG-PEG 2000。

在一些实施方案中，LNP包含阳离子脂质，其是可电离的脂质样材料(lipidoid)。在一些实施方案中，阳离子脂质具有以下结构：

N/P值优选是至少约4。在一些实施方案中，N/P值范围为4-20、4-12、4-10、4-8或5-7。在一些实施方案中，N/P值是约6。

本文描述的LNP的平均直径在一些实施方案中可以是约30nm至约200nm或约60nm至约120nm。

药物组合物

在一些实施方案中，药物组合物包含配制为颗粒的本文公开的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，颗粒是或包含脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合体(LPX)颗粒。

在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸可以在药物组合物或药物中给药，并且可以以任何合适的药物组合物的形式给药。

在一些实施方案中，本文描述的药物组合物是用于诱导免疫应答的免疫原性组合物。例如，在一些实施方案中，免疫原性组合物是疫苗。

在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸可以在药物组合物中给药，所述药物组合物可以包含药学可接受的载剂，并且可以任选地包含一种或多种佐剂、稳定剂等。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗或预防性治疗。

术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包含一组异质化合物如油乳剂(例如，弗氏佐剂)、矿物质(如明矾)、细菌产物(如百日咳杆菌毒素)或免疫刺激复合物。佐剂的实例包括但不限于LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。细胞因子可以是IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-a。其他已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油如

根据本公开的药物组合物一般以“药学有效量”和在“药学可接受的制剂”中应用。

术语“药学可接受的”是指物质的无毒性，其不与药物组合物的活性组分的作用相互作用。

术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指单独或与进一步的剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选涉及抑制疾病过程。这包括减缓疾病的发展，以及特别地，中断或逆转疾病的发展。治疗疾病中的期望反应还可以是延迟所述疾病或所述疾病状况的发生或者防止所述疾病或所述疾病状况的发生。本文描述的组合物的有效量取决于待治疗的疾病状况，疾病的严重程度，患者的个体参数，包括年龄、生理状况、尺寸和体重，治疗的持续时间，伴随疗法的类型(如果存在)，给药的具体途径以及相似因素。因此，本文描述的组合物的给药剂量可以取决于多个这样的参数。在用初始剂量患者中的反应不足的情况下，可以使用更高剂量(或者通过不同的、更局部化的给药途径有效达到的更高剂量)。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选存在的其他治疗剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含一种或多种药学可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。

用于本公开的药物组合物的合适的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。

如本文所用的术语“赋形剂”是指可以存在于本公开的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于载剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、增香剂或着色剂。

术语“稀释剂”涉及稀释(diluting)和/或稀释(thinning)剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任何一种或多种。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。

术语“载剂”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，其中组合了活性组分以促进、增强或实现药物组合物的给药。如本文所用的载剂可以是一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，其适合给药至受试者。合适的载剂包括但不限于无菌水、林格氏液、乳酸林格氏液、无菌氯化钠溶液、等渗盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别的生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧-丙烯共聚物。在一些实施方案中，本公开的药物组合物包括等渗盐水。

用于治疗用途的药学可接受的载剂、赋形剂或稀释剂是药学领域公知的，并且例如在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R Gennaroedit.1985)中进行了描述。

药物载剂、赋形剂或稀释剂可以根据预期的给药途径和标准药物实践进行选择。

在一些实施方案中，本文描述的药物组合物可以静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌肉内给药。在某些实施方案中，将所述药物组合物配制用于局部给药或全身给药。全身给药可以包括肠道给药，其包括通过胃肠道吸收，或者肠胃外给药。如本文所用，术语“肠胃外给药”是指以通过胃肠道以外的任何方式给药，如通过静脉内注射。在一优选实施方案中，将所述药物组合物配制用于肌肉内给药。在另一实施方案中，将所述药物组合物配制用于全身给药，例如，用于静脉内给药。

表征

在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸的特征在于，当在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品的生物体中进行评价时，相对于适当的参考比较物，观察到有效负载的表达升高。

在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸的特征在于，当在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品的生物体中进行评价时，相对于适当的参考比较物，观察到有效负载的表达持续时间增加(例如，延长的表达)。

在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸的特征在于，当在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品的生物体中进行评价时，相对于适当的参考比较物，观察到RNA多核苷酸与IFIT1的相互作用减少。

在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸的特征在于，当在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品的生物体中进行评价时，相对于适当的参考比较物，观察到RNA多核苷酸的翻译增加。

在一些实施方案中，参考比较物包括给药没有m7(3’OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA

在一些实施方案中，本文公开的RNA多核苷酸的特征在于，当在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品的生物体中进行评价时，相对于适当的参考比较物，观察到有效负载的表达升高和表达持续时间增加(例如，延长的表达)。

在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时确定表达升高。在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后至少24小时确定表达升高。在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后至少48小时确定表达升高。在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后至少72小时确定表达升高。在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后至少96小时确定表达升高。在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后至少120小时确定表达升高。

在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后约24-120小时确定表达升高。在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后约24-110小时、约24-100小时、约24-90小时、约24-80小时、约24-70小时、约24-60小时、约24-50小时、约24-40小时、约24-30小时、约30-120小时、约40-120小时、约50-120小时、约60-120小时、约70-120小时、约80-120小时、约90-120小时、约100-120小时或约110-120小时确定表达升高。

在一些实施方案中，有效负载的表达升高是至少2倍至至少10倍。在一些实施方案中，有效负载的表达升高是至少2倍。在一些实施方案中，有效负载的表达升高是至少3倍。在一些实施方案中，有效负载的表达升高是至少4倍。在一些实施方案中，有效负载的表达升高是至少6倍。在一些实施方案中，有效负载的表达升高是至少8倍。在一些实施方案中，有效负载的表达升高是至少10倍。

在一些实施方案中，有效负载的表达升高是约2倍至约50倍。在一些实施方案中，有效负载的表达升高是约2倍至约45倍、约2倍至约40倍、约2倍至约30倍、约2倍至约25倍、约2倍至约20倍、约2倍至约15倍、约2倍至约10倍、约2倍至约8倍、约2倍至约5倍、约5倍至约50倍、约10倍至约50倍、约15倍至约50倍、约20倍至约50倍、约25倍至约50倍、约30倍至约50倍、约40倍至约50倍或约45倍至约50倍。

在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后，有效负载的表达升高(例如，表达持续时间增加)持续至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时。在一些实施方案中，在给药后，有效负载的表达升高持续至少24小时。在一些实施方案中，在给药后，有效负载的表达升高持续至少48小时。在一些实施方案中，在给药后，有效负载的表达升高持续至少72小时。在一些实施方案中，在给药后，有效负载的表达升高持续至少96小时。在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后，有效负载的表达升高持续至少120小时。

在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后，有效负载的表达升高持续约24-120小时。在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品后，有效负载的表达升高持续约24-110小时、约24-100小时、约24-90小时、约24-80小时、约24-70小时、约24-60小时、约24-50小时、约24-40小时、约24-30小时、约30-120小时、约40-120小时、约50-120小时、约60-120小时、约70-120小时、约80-120小时、约90-120小时、约100-120小时或约110-120小时。

用途

本文公开的是制备和使用RNA多核苷酸的方法，所述RNA多核苷酸包含5’帽；包含帽近端结构的5’UTR；和编码有效负载的序列。

在一些实施方案中，本文公开的是一种体外转录反应体系，包括：(i)模板DNA，其包含与本文公开的RNA多核苷酸序列互补的多核苷酸序列；(ii)聚合酶；以及(iii)RNA多核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶是或包含T7聚合酶。在一些实施方案中，反应进一步包括5’帽或5’帽类似物。在一些实施方案中，5’帽类似物是或包含Cap1结构。在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含帽，所述帽包含Cap1结构；包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列；以及编码有效负载的序列。在一些实施方案中，Cap1结构包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeN1)pN2，其中N1是RNA多核苷酸的+1位置，N2是RNA多核苷酸的+2位置，并且其中N1和N2各自独立地选自：A、C、G或U。

在一些实施方案中，本文还公开了一种制备加帽RNA的方法，所述方法包括，在帽结构的存在下转录核酸模板，其中所述帽结构包含G*ppp(m

其中N

其中所述RNA包含：N

其中G*包含以下结构：

其中

在一些实施方案中，本文公开了一种制备多肽的方法，所述方法包括以下步骤：提供RNA多核苷酸，其包含5’帽，包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，以及编码有效负载的序列；其中RNA多核苷酸的特征在于，当在给药RNA多核苷酸或包含RNA多核苷酸的组合物的生物体中进行评价时，相对于适当的参考比较物，观察到有效负载的表达升高和/或表达持续时间增加。

在一些实施方案中，本文公开了一种方法，包括：向受试者给药药物组合物，所述药物组合物包含配制在本文公开的脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合体(LPX)颗粒中的RNA多核苷酸。

在一些实施方案中，本文公开了一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给药药物组合物，所述药物组合物包含配制在本文公开的脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合体(LPX)颗粒中的RNA多核苷酸。

在一些实施方案中，本文公开了一种受试者的疫苗接种的方法，所述方法包括向受试者给药药物组合物，所述药物组合物包含配制在本文公开的脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合体(LPX)颗粒中的RNA多核苷酸。

在一些实施方案中，本文提供一种减少RNA多核苷酸与IFIT1的相互作用的方法，所述RNA多核苷酸包含5’帽以及包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，所述方法包括以下步骤：

提供RNA多核苷酸的变体，其与亲本RNA多核苷酸的不同之处在于帽近端序列内一个或多个残基的取代，以及

确定相对于亲本RNA多核苷酸，所述变体与IFIT1的相互作用减少。在一些实施方案中，确定包括将RNA多核苷酸或包含RNA多核苷酸的组合物给药至细胞或生物体。

在一些实施方案中，本文公开了一种增加RNA多核苷酸可译性的方法，所述RNA多核苷酸包含5’帽，包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，以及编码有效负载的序列，所述方法包括以下步骤：提供RNA多核苷酸的变体，其与亲本RNA多核苷酸的不同之处在于帽近端序列内一个或多个残基的取代；以及确定所述变体的表达相对于亲本RNA多核苷酸的表达有增加。在一些实施方案中，确定包括将RNA多核苷酸或包含RNA多核苷酸的组合物给药至细胞或生物体。在一些实施方案中，通过有效负载的表达增加和/或表达的持久性来评价增加的可译性。在一些实施方案中，在给药后至少6小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时确定表达增加。在一些实施方案中，表达增加是至少2倍至10倍。在一些实施方案中，表达增加是至少约2倍至50倍。在一些实施方案中，给药后表达升高持续至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时。

在一些实施方案中，本文提供一种治疗性RNA，其包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的X，在RNA多核苷酸的+2位置的X，在RNA多核苷酸的+3位置的A，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的X，当以LNP制剂向受试者给药时，证实增加RNA的表达。在一些实施方案中，X选自A、C、G或U。

在一些实施方案中，本文提供一种治疗性RNA，其包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的A，在RNA多核苷酸的+2位置的G，在RNA多核苷酸的+3位置的A，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的U，当以LNP制剂向受试者给药时，证实增加RNA的表达。

在一些实施方案中，本文提供一种治疗性RNA，其包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的X，在RNA多核苷酸的+2位置的X，在RNA多核苷酸的+3位置的C，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的X，当以LNP制剂向受试者给药时，证实增加RNA的表达。在一些实施方案中，X选自A、C、G或U。

在一些实施方案中，本文提供一种增加RNA多核苷酸翻译的方法，所述RNA多核苷酸包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的X，在RNA多核苷酸的+2位置的X，在RNA多核苷酸的+3位置的A，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的X。在一些实施方案中，X选自A、C、G或U。

在一些实施方案中，本文提供一种增加RNA多核苷酸翻译的方法，所述RNA多核苷酸包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的A，在RNA多核苷酸的+2位置的G，在RNA多核苷酸的+3位置的A，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的U。

在一些实施方案中，本文提供一种增加RNA多核苷酸翻译的方法，所述RNA多核苷酸包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的X，在RNA多核苷酸的+2位置的X，在RNA多核苷酸的+3位置的C，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的X。在一些实施方案中，X选自A、C、G或U。

在本文公开的任何方法的一些实施方案中，在受试者中诱导免疫应答。在本文公开的任何方法的一些实施方案中，免疫应答是预防性免疫应答或治疗性免疫应答。

在本文公开的任何方法的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。

在本文公开的任何方法的一些实施方案中，受试者是人。

在本文公开的任何方法的一些实施方案中，受试者患有本文公开的疾病或病症。

在本文公开的任何方法的一些实施方案中，疫苗接种产生对药剂的免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答是预防性免疫应答。

在本文公开的任何方法的一些实施方案中，受试者患有本文公开的疾病或病症。

在本文公开的任何方法的一些实施方案中，给药一个剂量的药物组合物。

在本文公开的任何方法的一些实施方案中，给药多个剂量的药物组合物。

在本文公开的任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括给药一种或多种治疗剂。在一些实施方案中，在给药包含RNA多核苷酸的药物组合物之前、之后或同时给药一种或多种治疗剂。

在一些实施方案中，本文还提供一种为包含5’帽、帽近端序列和有效负载序列的RNA多核苷酸提供框架的方法，所述方法包括以下步骤：

评价RNA多核苷酸的至少两个变体，其中：

每个变体包括相同的5’帽和有效负载序列；以及

所述变体在帽近端序列的一个或多个特定残基处彼此不同；

其中所述评价包括确定有效负载的表达水平和/或表达持续时间；以及

选择5’帽和帽近端序列的至少一个组合，所述组合相对于至少一个其他组合表现出升高的表达。

在一些实施方案中，评价包括将RNA构建体或包含RNA构建体的组合物给药至细胞或生物体。

在一些实施方案中，在给药后至少6小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时的时间点检测到有效负载的表达升高。在一些实施方案中，表达升高是至少2倍至10倍。在一些实施方案中，表达升高是约2倍至约50倍。

在一些实施方案中，给药后有效负载的表达升高持续至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时。

在本文公开的任何方法的一些实施方案中，RNA多核苷酸包括本文提供的RNA多核苷酸的一种或多种特征。

在本文公开的任何方法的一些实施方案中，包含RNA多核苷酸的组合物包含本文提供的药物组合物。

列举的实施方案

1.一种组合物或药物制品，其包含RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含：

包含Cap1结构的5’帽；包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

(i)所述Cap1结构包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeN

(ii)所述帽近端序列包含Cap1结构的N

(a)选自以下的序列：A

(b)包含X

其中X

其中Y

2.实施方案1的组合物或药物制品，其中：

(i)所述N

(ii)所述N

(iii)所述N

3.实施方案1或2的组合物或药物制品，其中所述Cap1结构中的甲基化鸟苷(m7G)进一步包含一个或多个修饰，例如，其中所述Cap1结构中的m7G包含甲基化核糖。

4.实施方案3的组合物或药物制品，其中所述Cap1中的m7G包含3’O甲基化(m7(3’OMeG))。

5.一种组合物或药物制品，其包含RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含：5’帽；包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

(i)所述5’帽包含Cap1结构，所述Cap1结构包含G*ppp(m

N1是RNA多核苷酸的+1位置，N

G*包含以下结构：

其中

(ii)帽近端序列包含Cap1结构的N

(a)选自以下的序列：A

(b)包含X

其中X

其中Y

6.实施方案5的组合物或药物制品，其中：

(i)所述N

(ii)所述N

(iii)所述N

7.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中所述帽近端序列包含Cap1结构的N

8.实施方案1-6中任一项的组合物或药物制品，其中所述帽近端序列包含Cap1结构的N

9.实施方案1-6中任一项的组合物或药物制品，其中所述帽近端序列包含Cap1结构的N

10.实施方案1-6中任一项的组合物或药物制品，其中所述帽近端序列包含Cap1结构的N

11.实施方案1-6中任一项的组合物或药物制品，其中所述帽近端序列包含Cap1结构的N

12.一种组合物或药物制品，其包含RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含：

包含Cap1结构的5’帽；包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

(i)所述Cap1结构包含m7(3’OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA

(ii)所述帽近端序列包含Cap1结构的A

13.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中所述RNA多核苷酸包含5’UTR，并且所述帽近端序列位于5’UTR中。

14.一种组合物或药物制品，其包含编码基因产物的加帽RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含式：

其中R

其中B

其中，当向受试者给药所述RNA多核苷酸时，在给药后约6小时和在给药后约48小时，编码的基因产物的表达水平相差不超过5倍。

15.实施方案14的组合物或药物制品，其中，当向受试者给药所述RNA多核苷酸时，所述基因产物的表达在给药后至少72小时是可检测的。

16.实施方案14或15的组合物或药物制品，其中：

所述RNA多核苷酸包含5’UTR；和/或

所述RNA多核苷酸进一步包含3’UTR序列；和/或polyA序列。

17.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中所述RNA多核苷酸不包含自杂交序列，任选地，其中自杂交序列是可以与RNA多核苷酸的5’UTR或3’UTR中的序列杂交的序列，例如，其中所述自杂交序列是或包含SEQ ID NO:8。

18.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中5’UTR包含人α珠蛋白(hAg)5’UTR或其片段、TEV 5’UTR或其片段、HSP70 5’UTR或其片段、或者c-Jun 5’UTR或其片段。

19.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中所述5’UTR包含SEQ ID NO:11中提供的人α珠蛋白5’UTR，或者与其具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的序列。

20.实施方案1-18中任一项的组合物或药物制品，其中所述5’UTR包含SEQ ID NO:12中提供的人α珠蛋白5’UTR，或者与其具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的序列。

21.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中所述5’UTR进一步包含T7RNA聚合酶启动子序列。

22.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中所述5’帽结构是共转录添加的，或者不是酶促添加的。

23.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中所述RNA多核苷酸包含3’UTR或其片段，任选地其中所述3’UTR序列包含SEQ ID NO:13，或者与其具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的序列。

24.实施方案16-23中任一项的组合物或药物制品，其中所述3’UTR或其近端序列包含限制性位点，任选地其中所述限制性位点是BamHI位点或XhoI位点。

25.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中PolyA序列包含至少100个核苷酸，任选地其中：

(i)polyA序列是腺嘌呤核苷酸的中断序列；和/或

(ii)polyA序列包含30个腺嘌呤核苷酸然后是70个腺嘌呤核苷酸，其中30个腺嘌呤核苷酸和70个腺嘌呤核苷酸被接头序列分开。

26.实施方案25的组合物或药物制品，其中polyA序列包含SEQ ID NO:14的序列。

27.实施方案16-26中任一项的组合物或药物制品，其中所述5’帽、5’UTR、编码有效负载的序列、3’UTR和polyA序列以5’至3’方向排列。

28.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中所述RNA多核苷酸包含编码有效负载的序列上游的Kozak序列。

29.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中编码有效负载的序列包含启动子序列和/或其中编码有效负载的序列包含编码分泌信号肽的序列。

30.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中RNA多核苷酸包含编码有效负载的序列，所述有效负载选自：蛋白替代多肽；抗体物质；细胞因子；抗原多肽；基因编辑组分；再生医学组分或其组合。

31.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其特征在于，当在给药包含RNA多核苷酸的组合物或药物制品的生物体中进行评价时，相对于适当的参考比较物，观察到有效负载的表达升高和/或表达持续时间增加。

32.实施方案30的组合物或药物制品，其中有效负载是或包含蛋白替代多肽，任选地其中：

蛋白替代多肽包括在疾病或病症中异常表达的多肽；

蛋白替代多肽包括细胞内蛋白、细胞外蛋白或跨膜蛋白；和/或

蛋白替代多肽包括酶。

33.实施方案32的组合物或药物制品，其中多肽表达异常的疾病或病症包括但不限于：罕见疾病、代谢紊乱、肌营养不良、心血管疾病或单基因疾病。

34.实施方案30的组合物或药物制品，其中有效负载是或包含抗体物质，任选地其中抗体物质与细胞上表达的多肽结合。

35.实施方案34的组合物或药物制品，其中抗体物质包含CD3抗体、Claudin 6抗体或其组合。

36.实施方案30的组合物或药物制品，其中有效负载是或包含细胞因子或者其片段或变体，任选地其中细胞因子包含：IL-12或者其片段或变体或融合物，IL-15或者其片段或变体或融合物，GMCSF或者其片段或变体；或者IFN-α或其片段或变体。

37.实施方案30的组合物或药物制品，其中有效负载是或包含抗原多肽或者其免疫原性变体或免疫原性片段，任选地其中抗原多肽包含来自抗原的一个表位或来自抗原的多个不同表位。

38.实施方案37的组合物或药物制品，其中包含来自抗原的多个不同表位的抗原多肽是多表位的。

39.实施方案37或38的组合物或药物制品，其中抗原多肽包括：来自过敏原的抗原多肽、病毒抗原多肽、细菌抗原多肽、真菌抗原多肽、寄生虫抗原多肽、来自传染源的抗原多肽、来自病原体的抗原多肽、肿瘤抗原多肽或自我抗原多肽。

40.实施方案39的组合物或药物制品，其中病毒抗原多肽包含HIV抗原多肽、流感抗原多肽、冠状病毒抗原多肽、狂犬病抗原多肽或Zika病毒抗原多肽，任选地其中病毒抗原多肽是或包含冠状病毒抗原多肽。

41.实施方案40的组合物或药物制品，其中冠状病毒抗原是或包含SARS-CoV-2蛋白，任选地其中SARS-CoV-2蛋白包含SARS-CoV-2刺突(S)蛋白，任选地其中SARS-CoV-2蛋白包含SARS-CoV-2刺突(S)蛋白，或者其免疫原性变体或免疫原性片段。

42.实施方案41的组合物或药物制品，其中所述SARS-CoV-2蛋白，或者其免疫原性变体或免疫原性片段，在位置986和987处包含脯氨酸残基。

43.实施方案41或42的组合物或药物制品，其中SARS-CoV-2S多肽：

(i)与SEQ ID NO:9具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性；或者

(ii)由与SEQ ID NO:10具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的RNA编码。

44.实施方案30的组合物或药物制品，其中有效负载是或包含肿瘤抗原多肽或者其免疫原性变体或免疫原性片段，任选地，其中肿瘤抗原多肽包含肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤新抗原或其组合。

45.实施方案43或44的组合物或药物制品，其中肿瘤抗原多肽包括p53，ART-4，BAGE，ss-连蛋白/m，Bcr-abL CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK4/m，CEA，CLAUDIN-12，c-MYC，CT，Cyp-B，DAM，ELF2M，ETV6-AML1，G250，GAGE，GnT-V，Gap100，HAGE，HER-2/neu，HPV-E7，HPV-E6，HAST-2，hTERT(或hTRT)，LAGE，LDLR/FUT，MAGE-A，优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12，MAGE-B，MAGE-C，MART-1/Melan-A，MC1R，肌球蛋白/m，MUC1，MUM-1、-2、-3，NA88-A，NF1，NY-ESO-1，NY-BR-1，p190最小BCR-abL，Plac-1，Pm1/RARa，PRAME，蛋白酶3，PSA，PSM，RAGE，RU1或RU2，SAGE，SART-1或SART-3，SCGB3A2，SCP1，SCP2，SCP3，SSX，SURVIVIN，TEL/AML1，TPI/m，TRP-1，TRP-2，TRP-2/INT2，TPTE，WT，WT-1，或者它们的组合。

46.实施方案44-45中任一项的组合物或药物制品，其中肿瘤抗原多肽包括来自癌、肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病或其组合的肿瘤抗原。

47.实施方案46的组合物或药物制品，其中肿瘤抗原多肽包括：黑素瘤肿瘤抗原；前列腺癌抗原；HPV16阳性头颈癌抗原；乳腺癌抗原；卵巢癌抗原；肺癌抗原，例如NSCLC抗原。

48.实施方案39的组合物或药物制品，其中有效负载是或包含自我抗原多肽或者其免疫原性变体或免疫原性片段，任选地其中自我抗原多肽包含通常在细胞上表达并被免疫系统识别为自我抗原的抗原。

49.实施方案48的组合物或药物制品，其中自我抗原多肽包括：多发性硬化抗原多肽、类风湿性关节炎抗原多肽、狼疮抗原多肽、乳糜泻抗原多肽、舍格伦综合征抗原多肽或关节强硬性脊椎炎抗原多肽，或者它们的组合。

50.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中RNA多核苷酸包含修饰的核苷代替尿苷，任选地其中修饰核苷的选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。

51.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中RNA多核苷酸进一步包含一个或多个额外的序列，例如，一个或多个额外的有效负载，和/或一个或多个调节元件。

52.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中RNA多核苷酸的特征在于，与给药没有m7(3’OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA

53.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中RNA多核苷酸的特征在于，与给药没有m7(3’OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA

(i)在给药后至少6小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时确定表达增加，任选地其中表达增加是至少2倍至10倍；或者

(ii)表达升高持续至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时。

54.前述实施方案中任一项的组合物或药物制品，其中所述RNA配制或待配制为液体、固体或其组合；其中所述RNA配制或待配制用于注射；或者其中所述RNA配制或待配制用于肌肉内注射。

55.一种包含前述实施方案中任一项的RNA多核苷酸的药物组合物，配制为颗粒，任选地其中颗粒是或包含脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合体(LPX)颗粒。

56.实施方案55的药物组合物，其中脂质纳米颗粒包括以下各种：阳离子脂质；固醇；中性脂质；和脂质缀合物。

57.实施方案56的药物组合物，其中所述阳离子脂质是或包含((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-癸酸己酯)，所述固醇是胆固醇，所述中性脂质是或包含磷脂，并且所述脂质缀合物是或包含聚乙二醇(PEG)-脂质。

58.实施方案57的药物组合物，其中所述磷脂是或包含二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。

59.实施方案57的药物组合物，其中所述(PEG)-脂质是或包含2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺。

60.实施方案56-58中任一项的药物组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括以下各种：a.((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-癸酸己酯)；b.胆固醇；c.二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)；和d.2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺。

61.实施方案56-60中任一项的药物组合物，其中：

中性脂质的浓度为总脂质的5-15摩尔％；

阳离子可电离的脂质的浓度为总脂质的40-55摩尔％；

类固醇的浓度为总脂质的30-50摩尔％；和/或

聚乙二醇化的脂质的浓度为总脂质的1-10摩尔％。

62.实施方案56-61中任一项的药物组合物，其中脂质纳米颗粒包含40-55摩尔％的阳离子可电离的脂质；5-15摩尔％的中性脂质；30-50摩尔％的类固醇；和1-10摩尔％的聚乙二醇化的脂质。

62.实施方案55的药物组合物，其中RNA脂质复合体颗粒可通过混合RNA多核苷酸与脂质体获得。

63.实施方案1-54中任一项的组合物或药物制品，或者实施方案55-62中任一项的药物组合物，其中所述RNA是mRNA或saRNA。

64.实施方案55-63中任一项的药物组合物，其中药物组合物进一步包含一种或多种药学可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。

65.实施方案55-64中任一项的药物组合物，其包装为试剂盒，任选地其中所述试剂盒进一步包含所述药物组合物用于诱导受试者的免疫应答的使用说明书。

66.一种制造实施方案55-64中任一项的药物组合物的方法，通过将RNA多核苷酸与脂质组合以形成包封所述RNA的脂质纳米颗粒。

67.一种适合产生cap1加帽RNA的核酸模板，其中从所述核酸模板的模板链转录的前五个核苷酸包含序列N

68.实施方案67的核酸模板，其中所述DNA模板包含：5’UTR、编码有效负载的序列、3’UTR和polyA序列。

69.一种体外转录反应体系，包括：

(i)模板DNA，其包含与实施方案1-54中任一项提供的RNA多核苷酸序列互补的多核苷酸序列；

(ii)聚合酶(例如，T7聚合酶)；以及

(iii)RNA多核苷酸。

70.实施方案69的体外转录反应体系，进一步包含5’帽或5’帽类似物，任选地其中5’帽或5’帽类似物是或包含Cap1结构。

71.实施方案69的体外转录反应体系，其中所述RNA多核苷酸包括含有Cap1结构的帽；包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，任选地其中所述Cap1结构包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeN

72.从实施方案69-71中任一项提供的体外转录反应体系分离的RNA多核苷酸。

73.一种制备加帽RNA的方法，所述方法包括，在帽结构的存在下转录核酸模板，其中所述帽结构包含G*ppp(m

其中N

其中核酸模板的+3位置是任何核苷酸，优选T或G；核酸模板的+4位置是任何核苷酸；并且核酸模板的+5位置是任何核苷酸，

其中G*包含以下结构：

其中

74.一种组合物，其包含DNA多核苷酸，所述DNA多核苷酸包含与实施方案1-54中任一项提供的RNA多核苷酸序列互补的序列。

75.实施方案74的DNA多核苷酸组合物，其可以用于转录RNA多核苷酸和/或，其被置于载体中。

76.一种方法，其包括：

向受试者给药实施方案55-64中任一项的包含配制在脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合体(LPX)颗粒中的RNA多核苷酸的药物组合物。

77.一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给药实施方案55-64中任一项的包含配制在脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合体(LPX)颗粒中的RNA多核苷酸的药物组合物。

78.实施方案77的方法，其中在受试者中诱导免疫应答，任选地其中免疫应答是预防性免疫应答或治疗性免疫应答。

79.一种对受试者进行疫苗接种的方法，通过给药实施方案55-64中任一项的包含配制在脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合体(LPX)颗粒中的RNA多核苷酸的药物组合物。

80.实施方案79的方法，疫苗接种产生免疫应答，任选地其中免疫应答是预防性免疫应答。

81.一种减少RNA多核苷酸与IFIT1的相互作用的方法，所述RNA多核苷酸包含5’帽以及包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，所述方法包括以下步骤：

提供所述RNA多核苷酸的变体，其与亲本RNA多核苷酸的不同之处在于帽近端序列内一个或多个残基的取代，以及

确定相对于亲本RNA多核苷酸，变体与IFIT1的相互作用减少，任选地其中确定包括将RNA多核苷酸或包含RNA多核苷酸的组合物给药至细胞或生物体。

82.一种制备多肽的方法，包括以下步骤：

提供RNA多核苷酸，其包含5’帽，包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，以及编码有效负载的序列；

其中所述RNA多核苷酸的特征在于，当在给药RNA多核苷酸或包含RNA多核苷酸的组合物的生物体中进行评价时，相对于适当的参考比较物，观察到有效负载的表达升高和/或表达持续时间增加。

83.一种增加RNA多核苷酸可译性的方法，所述RNA多核苷酸包含5’帽，包含RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和+5位置的帽近端序列，以及编码有效负载的序列，所述方法包括以下步骤：

提供所述RNA多核苷酸的变体，其与亲本RNA多核苷酸的不同之处在于帽近端序列内一个或多个残基的取代；以及

确定变体的表达相对于亲本RNA多核苷酸的表达有增加，任选地其中确定包括将RNA多核苷酸或包含RNA多核苷酸的组合物给药至细胞或生物体。

84.实施方案83的方法，其中通过有效负载的表达增加和/或表达的持久性来评价增加的可译性。

85.实施方案84的方法，其中：

(i)在给药后至少6小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时确定表达增加，任选地其中表达增加是至少2倍至10倍；或者

(ii)表达升高持续至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时。

86.在治疗性RNA中，其包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列和编码有效负载的序列，改进包括：

在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的A，在RNA多核苷酸的+2位置的G，在RNA多核苷酸的+3位置的A，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的U，

当以LNP制剂向受试者给药时，证实增加RNA的表达。

87.一种增加RNA多核苷酸的翻译的方法，所述RNA多核苷酸包括含有Cap1结构的5’帽，帽近端序列以及编码有效负载的序列，改进包括：

在帽近端序列中包括一个或多个以下残基：在RNA多核苷酸的+1位置的A，在RNA多核苷酸的+2位置的G，在RNA多核苷酸的+3位置的A，在RNA多核苷酸的+4位置的A，以及在RNA多核苷酸的+5位置的U。

88.实施方案76-87中任一项的方法，其中给药一个剂量或多个剂量的药物组合物。

89.实施方案76-88中任一项的方法，其中所述方法进一步包括给药一种或多种治疗剂。

90.实施方案89的方法，其中在给药包含RNA多核苷酸的药物组合物之前、之后或同时给药一种或多种治疗剂。

91.实施方案76-90中任一项的方法，其中所述受试者或生物体是哺乳动物。

92.实施方案91的方法，其中所述受试者或生物体是人。

93.实施方案76-93中任一项的方法，其中所述受试者患有本文公开的疾病或病症。

94.一种为包含5’帽、帽近端序列和有效负载序列的RNA多核苷酸提供框架的方法，所述方法包括以下步骤：

评价所述RNA多核苷酸的至少两个变体，其中：

每个变体包括相同的5’帽和有效负载序列；以及

所述变体在帽近端序列的一个或多个特定残基处彼此不同；

其中所述评价包括确定有效负载序列的表达水平和/或表达持续时间；以及

选择5’帽和帽近端序列的至少一个组合，所述组合相对于至少一个其他组合表现出升高的表达。

95.实施方案94的方法，其中评价包括将RNA构建体或包含RNA构建体的组合物给药至细胞或生物体。

96.实施方案94或95的方法，其中：

在给药后至少6小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时的时间点检测到表达升高，任选地其中表达升高是至少2倍至10倍；和/或

表达升高持续至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时。

97.实施方案76-96中任一项的方法，其中所述RNA多核苷酸包括实施方案1-54中任一项提供的RNA多核苷酸的一个或多个特征。

98.实施方案76-97中任一项的方法，其中所述组合物包含实施方案55-64中任一项的药物组合物。

实施例1-提供编码蛋白的改进和持续表达的RNA盒的产生

本实施例描述了RNA盒的产生，所述RNA盒在体内具有改进的编码有效负载的表达水平和/或增加的编码有效负载的表达持续时间。本实施例中使用的方法描述如下。

方法：

对于模板，使用纯化的编码密码子优化的小鼠促红细胞生成素(mEPO)的质粒。用BspQI(New England Biolabs,Cat#R0712L)将对应于烟草蚀纹病毒5′前导RNA(TEV)或人α-珠蛋白(hAg)mRNA的5’非翻译区序列的质粒线性化以产生模板。将MEGAscript T7 RNA聚合酶试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Cat#AMB1334-5)用于转录，用N1-甲基假尿苷(m1Ψ)5’-三磷酸(TriLink,Cat#N-1081)代替UTP。使用终浓度为3mM的抗逆转Cap1类似物CleanCap413(TriLink,Cat#N-7413)对mRNA进行共转录加帽。为了获得用帽类似物产生的期望转录物，将转录反应中的初始GTP浓度从7.5mM降低至1.5mM，并且在杂交室中于37℃下温育30min。包括ATP、CTP和m1ΨTP在内的额外核苷酸的初始浓度对应于最终的7.5mM浓度。在温育的30、60、90和120分钟之后，需要向混合物添加额外的1.5mM GTP，并且在37℃下进一步温育30分钟。将mRNA转录以包含100nt长的3’poly(A)尾。为了去除模板，将1/10体积的DNA Turbo DNase(Thermo Fisher Scientific,Cat#AM1907)添加至反应混合物中，并且将混合物在37℃下温育15分钟。通过用一半反应体积的8M LiCl溶液(Sigma-Aldrich,Cat#L7026)沉淀来从反应混合物分离合成的mRNA。在-20℃下冷却至少1小时后，通过在4℃下以17.000×g离心5分钟收集RNA颗粒。用至少200μl冰冷的75％乙醇溶液洗涤RNA颗粒两次后，将其溶解于无核酸酶的水中。在NanoDrop2000C分光光度计(Thermo Fisher Scientific,Cat#ND-2000c)上测量体外转录的mRNA的浓度和质量。通过在包含0.005％(v/v)GelRed

为了小鼠EPO水平的定量，在指定时间点从注射了编码小鼠促红细胞生成素的IVTmRNA与TransIT mRNA(Mirusbio,Cat#MIR2255)复合物的小鼠收集血浆样品，并且通过小鼠促红细胞生成素DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems,Cat#DY959)进行分析。将平底96-孔板用2μg/ml大鼠抗小鼠EPO捕获抗体(100μl/孔)预包被，并且在室温(RT)温育过夜。将板用包含0.05％Tween-20的PBS洗涤三次，并且用1％ BSA(牛血清白蛋白)(Sigma-Aldrich,Cat#2153)溶液在RT下温育2小时以防止抗体的非特异性结合，然后再次洗涤。应用七点标准曲线，使用2倍连续稀释液和4000pg/ml的高标准品。将最终体积为50μl血浆样品和在1％BSA溶液中稀释的标准品添加至适当的孔，并且在RT下温育2小时。洗涤板之后，将100μl的1μg/ml的1％BSA溶液中的大鼠生物素化抗小鼠EPO检测抗体分配至每个孔中，并且在RT下温育2小时。将板洗涤，然后用在1％BSA溶液中稀释(1:200)的100μl与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素在室温下温育20min。洗涤之后，将TMB 2-组分微孔过氧化物酶底物溶液(MedacGmbh,Cat#50-76-11)添加至每个孔中(100μl/孔)。将样品在室温下温育5min，添加2M硫酸(R&D Systems,Cat#DY994)以终止反应，并且使用Infinite 200Pro酶标仪(Tecan)在450nm和570nm处测量吸光度。

所有实验均按照联邦的动物研究政策进行，使用来自Charles RiverLaboratories(Sandhofer,Germany)的6–12周龄的BALB/c雌性小鼠。为了确定mRNA在体内的翻译，将1-3μg与TransIT复合的编码小鼠促红细胞生成素的骨架和核苷修饰的cap1-TEV-mEPO mRNA或cap1-hAg-mEPO mRNA静脉内注射至小鼠体内(3只小鼠/组)。如所描述的，在mRNA注射后6、24、48和72h收集血液(Kariko K et al.,(2012)Mol.Ther.20:948-953；Mahin AJ et al.,(2016)Methods Mol Biol 1428:297-306)以避免采样对动物血液学参数的影响。简而言之，通过尾静脉穿刺收集血液(18μL)，与2μL 0.2M EDTA混合，并且在20μLDrummond microcaps玻璃毛细管(Sigma-Aldrich)中离心。折断毛细管后，回收血浆，使用mEPO DuoSet ELISA Development试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)和Infinite200Pro酶标仪(Tecan,Mannedorf,Switzerland)测量血浆mEPO水平。详情见EPO-ELISA描述。

本实施例评价了RNA中的序列元件对RNA编码的有效负载的表达水平和/或表达持续时间的影响。第一个评价的重点是评价RNA多核苷酸的3’UTR序列中的自我杂交序列的影响。产生有或没有称为“Lig3”的自我杂交序列的RNA构建体，并且将其静脉内注射至小鼠体内。在mRNA注射后6、24、48和72h，从动物采集血液并评价RNA构建体编码的多肽EPO的表达。

如图1所示，来自没有Lig3序列的构建体的EPO表达更加稳健。在给药后24小时和48小时，这些动物中的EPO表达水平高于对照(具有Lig3的RNA)，并且EPO的表达持续时间也更长，在给药后长达72小时检测到大量的EPO。这个数据证实在3’UTR中不存在可以与RNA的其他元件如图2所示的5’UTR或3’UTR本身杂交的自我杂交序列，有利于提高RNA编码的有效负载的表达。

接下来，对可能影响RNA编码的有效负载表达的其他序列元件进行了评价。翻译和/或稳定性所需要的RNA结构元件之一是5’帽。可以用于RNA的不同5’帽结构在图3A-3H中示出。以前显示当mRNA具有cap0结构时，IFIT1(干扰素诱导的三角形四肽(tetratricopeptide)1)蛋白可以以非常高的亲和力与mRNA的5’-末端结合(PLoSpathogens(2013)9,e1003663)。当mRNA具有cap1结构时，IFIT1与mRNA相互作用的亲和力降低，并且这允许翻译因子如延长因子eIF4E优先结合。随后，还报道了mRNA的5’-末端前4个转录的核苷酸位于IFIT1的小树丛中(grove)(PNAS(2017)114(11):E2106-E2115)。基于这些观察，我们假设RNA上Cap1结构的存在和5’帽近端RNA序列(在本文中也称作“帽近端序列”)的性质可以影响RNA编码的有效负载的表达。

为了验证这个假设，产生在RNA序列的+3、+4和+5位置具有不同残基的RNA并进行测试。测试的RNA序列的+1和+2位置分别为A和G。用图4中示出的各种RNA构建体静脉内注射动物。在注射后6、24、48和72h，从动物采集血液并评价RNA构建体编码的多肽EPO的表达。

给药RNA后6小时和24小时的EPO表达水平在给药各种构建体的动物中是可比的。在给药后48小时，与其他构建体相比，一些构建体导致更好的EPO体内表达(在48小时比较AGAAU与AGACA)。在72小时，用不同构建体剂量给药的动物之间的体内EPO表达差异甚至更加明显，与包括AGAAU、AGAAC、AGCAA、AGCAC构建体在内的几种构建体相比，AGACA构建体的EPO表达降低10倍以上。

这个数据证实5’帽近端的RNA序列的性质对RNA编码的有效负载的体内表达水平和/或表达持续时间有显著影响。在一些实施方案中，这个数据表明具有优化的帽近端RNA序列的RNA构建体，具有增加的有效负载体内表达和/或表达持续时间，相对于比较物，例如，没有优化的帽近端序列的RNA序列，允许向生物体给药较低剂量的所述RNA或包含所述RNA的组合物。

本实施例描述了某些冠状病毒疫苗RNA。示例的构建体包括编码冠状病毒刺突蛋白的至少一个表位的序列，以及各种其他结构元件和/或特征。其中，记录了包括例如本文描述的cap1结构和近端帽序列的示例性RNA表达良好，并且具有很强的免疫原性。

表2：本实施例中使用的示例性序列。

在BALB/c小鼠中进行初级药效学研究以测试下表中示出的候选疫苗的免疫原性。

表3：候选疫苗

在研究中，将4组各8只雌性BALB/c小鼠用三种不同剂量的动物试验材料或用缓冲液(对照组；见表4)免疫一次。虽然临床试验材料在盐水中稀释，但是动物试验材料在包括300mM蔗糖的PBS中稀释。因为这是材料本身的储存缓冲液，所以测试项目对于计划的临床试验中使用的疫苗具有代表性。使用20μL的剂量体积IM进行免疫。

表4：研究设计

在第7、14、21和28天采集免疫动物的血液，并且通过ELISA和基于假病毒的中和测定(pVNT)分析抗体免疫应答。

通过ELISA检测针对重组S1亚基或RBD的SARS-CoV-2-S特异性抗体反应。简而言之，将高蛋白结合96-孔板(MaxiSorp ELISA板，VWR International GmbH,Cat.No.7341284)用100ng重组S1亚基(Sino Biological Inc.,Cat.No.40591-V08H)或RBD(Sino Biological Inc.,Cat.No.40592-V02H)每孔在100μL包被缓冲液(50mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)中于4℃下包被过夜。将板用300μL/孔补充了0.01％Tween 20(CarlRoth GmbH&Co.KG,Cat.No.9127.1)的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS,VWR International GmbH,Cat.No.0780-10L)洗涤三次，并且用250μL/孔1x酪蛋白封闭缓冲液(Sigma-Aldrich GmbH,Cat No.B6429-500ml)在37℃的微孔板振荡器上封闭1小时。将板用300μL/孔补充了0.01％Tween 20的1x PBS再次洗涤三次，并且用1x酪蛋白封闭缓冲液中稀释的小鼠血清样品在37℃的微孔板振荡器上温育1小时。将板用300μL/孔补充了0.01％Tween 20的1x PBS洗涤三次，随后用过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠二抗(Jackson ImmunoResearch Ltd.,Cat.No.115-036-071；在1x酪蛋白封闭缓冲液中1:7500稀释)在37℃的微孔板振荡器上温育45分钟。将板用300μL/孔补充了0.01％Tween 20的1x PBS洗涤三次，并且添加100μL/孔TMB底物(Biotrend Chemiekalien GmbH,Cat.No.4380A)。将板在室温下温育8min，并且通过添加100μL 25％硫酸(VWR International GmbH,Cat.No.1007161000)终止反应。在酶标仪上读取板，并且通过减去620nM处的参考吸光度来校正450nm处的记录吸光度。

通过pVNT检测对候选疫苗的功能性抗体应答。pVNT使用复制缺陷的水疱性口炎病毒(VSV)，其缺少VSV包膜糖蛋白G的遗传信息，但是包含绿色荧光蛋白(GFP)的开放阅读框(ORF)。根据已公开的方案产生VSV/SARS-CoV-2假病毒(Hoffmann et al.,Cell,2020；PMID32142651)。假型病毒包含SARS-CoV-2S蛋白，其介导细胞进入。因此，可以通过结合SARS-CoV-2S的中和抗体将假病毒灭活。这种灭活可以通过体外方法进行分析。

简而言之，将4x10

为了研究LNP配制的编码BNT162a1的uRNA疫苗的效力，将BALB/c小鼠按照表3所述IM免疫一次。通过关注抗体免疫应答研究RNA疫苗的免疫原性。

第一次免疫后7、14、21和28天的ELISA数据显示针对S1蛋白和受体结合结构域的早期、剂量依赖性免疫激活(图5)。

为了研究LNP配制的编码BNT162b1的modRNA疫苗的效力，将BALB/c小鼠按照表3所述IM免疫一次。通过关注抗体免疫应答研究RNA疫苗的免疫原性。

第一次免疫后7、14、21和28天的ELISA数据显示针对S1蛋白和受体结合结构域的早期、剂量依赖性免疫激活(图6)。免疫后14、21和28天获得的血清显示出高SARS-CoV-2假病毒中和，特别是来自用1或5μg BNT162b1免疫小鼠的血清，并且与IgG抗体滴度的强烈增加相关(图7)。

为了研究LNP配制的编码BNT162c1的saRNA疫苗的效力，将BALB/c小鼠按照表3所述IM免疫一次。通过关注抗体免疫应答研究RNA疫苗的免疫原性。

第一次免疫后7、14和21天的ELISA数据显示针对S1蛋白和受体结合结构域的早期、剂量依赖性免疫激活(图8)。免疫后14和21天获得的血清显示出剂量依赖性SARS-CoV-2假病毒中和活性(图9)。

为了研究LNP配制的编码病毒S蛋白-V8(RBL063.1)的uRNA疫苗的效力，将BALB/c小鼠按照表3所述IM免疫一次。通过关注抗体免疫应答研究RNA疫苗的免疫原性。

第一次免疫后7、14、21和28天的ELISA数据是可获得的，显示针对S1蛋白和受体结合结构域的早期、剂量依赖性免疫激活(图10)。免疫后14、21和28天获得的血清显示出剂量依赖性SARS-CoV-2假病毒中和活性(图11)。

为了研究疫苗BNT162b2(RBP020.1)的效力，研究构建体的免疫原性。为了这个目的，在BALB/c小鼠中启动剂量滴定研究，其中对免疫应答进行分析，重点是抗体免疫应答。

第一次免疫后7、14和21天的ELISA数据是可获得的，显示针对S1蛋白和受体结合结构域的早期、剂量依赖性免疫激活(图12)。免疫后14和21天获得的血清显示出剂量依赖性SARS-CoV-2假病毒中和活性(图13)。

为了研究LNP配制的编码V9的saRNA疫苗的效力，将BALB/c小鼠按照表3所述IM免疫一次。通过关注抗体免疫应答研究RNA疫苗的免疫原性。

第一次免疫后7、14和21天的ELISA数据是可获得的，显示针对S1蛋白和受体结合结构域的早期、剂量依赖性免疫激活(图14)。免疫后14和21天获得的血清显示出剂量依赖性SARS-CoV-2假病毒中和活性(图15)。

上述数据证实在所有测试的平台(包括疫苗BNT162a1、BNT162b1、BNT162b2和BNT162c1)中，体内对具有三聚结构域("V5")和突变的全长S蛋白("V8"/"V9")的免疫应答。通过ELISA，在非常早的时间点已观察到抗体免疫应答(即，在免疫后7天)。重要的是，诱导的抗体能够在体外有效地中和SARS-COV-2假病毒感染。而且，在使用modRNA平台(BNT162b1、BNT162b2)以及saRNA平台(BNT162c1)时使用0.2μg/小鼠的极低免疫剂量诱导抗体应答，表明候选疫苗的高效力。

在小鼠中，与用相同RNA平台编码的BNT162b1相比，BNT162b2诱导更高的抗原特异性滴度。正如预期的，小鼠中对抗原的免疫原性在不同RNA平台之间是不同的。在小鼠中，基于抗原特异性抗体诱导的最具有免疫原性的平台是modRNA，其次是saRNA。uRNA平台诱导最低的抗原特异性抗体滴度。

实施例3：LNP制剂

开发了一种示例性LNP递送系统以在体内局部给药后将治疗性核酸有效和安全地递送至各种细胞类型的胞质溶胶中。早期制剂工作是用几种有前途的LNP制剂和编码萤光素酶的替代RNA进行的。实验的目的是关联不同可电离的阳离子脂质对LNP在体内递送RNA的效力的影响。在RNA包封效率、表观pKa、LNP大小和多分散性方面比较制剂。

在筛选的阳离子脂质中，ALC-0315在粒径、均质性和RNA包封效率方面表现出合适的物理特征。

在此基础上，提交ALC-0315/DSPC/CHOL/ALC-0159原型用于体内筛选。图16中示出的结果总结了使用萤光素酶(Luc)RNA的两个独立试验批次的体内测试。结果证实与内部基准(ALC-0218)相比，ALC-0315原型的效力提高。在这些研究的基础上，鉴定ALC-0315为高效的阳离子脂质，并且提出将其用于进一步的产品开发研究。

上述制剂筛选程序涉及静脉内给药，导致主要递送至肝脏。LNP摄取进入肝细胞的机制是通过内源性载脂蛋白结合至LNP，然后是受体介导的内吞作用，例如通过低密度脂蛋白受体。为了研究肌肉内给药是否涉及相同的机制，在存在或不存在重组人ApoE3的情况下，将包含ALC-0315的含有Luc RNA的LNP静脉内注射(0.3mg/kg)和肌肉内注射(0.2mg/kg)至ApoE敲除小鼠中。作为对照，将野生型C57Bl/6小鼠也通过不同给药途径进行处理。在给药之前将RNA-LNP与重组人ApoE3(1mg包封的mRNA与1mg ApoE3)在室温(RT)下预温育1小时。在给药后4、24、72和96小时监测Luc表达(图17)。

当小鼠静脉内给药时，在野生型C57Bl/6小鼠中检测到Luc表达。在ApoE敲除小鼠中，Luc表达显著减少，但是当与外源ApoE预温育时，Luc的表达恢复至与野生型小鼠相似的表达水平(图18)。

使用小鼠模型的体内Luc表达实验表明，在肌肉内给药的情况下，RNA-LNP的吸收涉及与静脉内给药相似的机制，并且这不仅适用于肝细胞，还适用于给药部位的局部细胞。

最终ALC-0315/DSPC/CHOL/ALC-0159的肌肉内给药后的体内实验，证实在生物分布、免疫原性(疫苗活性)和耐受性方面的最小问题(drainage)。

等同

本领域技术人员会认识到或者能够使用不超过常规实验确定本文描述的本发明的具体实施方案的多个等同物。应当理解本发明涵盖所有变化、组合和排列，其中来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、元素、条款、描述性术语等被引入引用相同基本权利要求(或相关的任何其他权利要求)的另一权利要求中，除非另有说明，或者除非对于本领域普通技术人员，显而易见会产生矛盾或不一致。此外，还应当理解，本发明的任何实施方案或方面都可以明确地从权利要求排除，不管具体的排除是否在说明书中提及。本发明的范围并不打算受限于以上描述，而是如所附权利要求所示。