TDP-43在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，尤其涉及一种TDP-43在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用。

背景技术

肝细胞癌是一种原发性肝脏恶性肿瘤，是全球第五大常见癌症，但其不良预后使其成为导致癌症死亡的第二大因，患者五年生存率小于10％，并且，全球肝癌发病率以每年3～9％的速度递增。大多数的肝癌病例是有乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染所导致的肝硬化的病史。其他情况，如酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、糖尿病和血色素沉着症也会导致肝癌的发生。对肝癌最有效的治疗是需要在早期发现疾病，早期发现的肝癌可以通过肝移植、手术切除或经皮射频消融治愈。因此，研究生物标志物早期发现对肝癌的病人治疗至关重要。

TDP-43是肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶变性(FTLD)特征性tau-阴性和泛素化阳性包裹体的主要成分。作为一个RNA结合蛋白，TDP-43具有两个RNA识别序列(RRM1和RRM2)和C端类朊病毒结构域，其中RNA识别序列和富含UG序列的单链RNA有高度的结合力，C端类朊病毒结构域与大多数家族性ALS相关突变有关。TDP-43在正常情况下以核定位为主，但在病理情况时，比如在病变的大脑和脊髓中发现TDP-43主要在细胞质中异常聚集，这与几种不同的致病机制引起TDP-43蛋白变化所导致的。对于TDP-43在肿瘤细胞中的作用知之甚少。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种TDP-43在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种TDP-43在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种用于诊断原发性肝癌的引物，所述引物包括扩增TDP-43的上下游引物，所述扩增TDP-43的上下游引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种用于诊断原发性肝癌的试剂盒，包括上述引物。

优选的，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂。

优选的，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为健康人的血清。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种TDP-43在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用，通过扩增TDP-43上下游引物，检测TDP-43基因的表达水平来诊断是否患原发性肝癌，所述TDP-43表达上调，若健康人血清中的TDP-43表达水平为1，原发性肝癌患者的TDP-43表达水平大于2.5判定为阳性。本发明在临床上证明个体血清TDP-43的变化对于HCC的诊断有较高的价值，本发明通过检测原发性肝癌的TDP-43，检测简便、快速，本发明为临床早期诊断原发性肝癌提供一种新的诊断手段。

附图说明

图1为肝癌细胞系中TDP43的表达量，其中DRS为肝癌细胞系中的TDP43在总RNA中的RNA-seq结果，RT-qPCR为肝癌细胞系中TDP43的Q-PCR结果；

图2中A为免疫组化染色检测TDP-43蛋白表达；B为TDP-43免疫组化染色结果统计分析；C为肝癌和癌旁血清中TDP-43蛋白表达量及统计分析；D为正常肝细胞和肝癌细胞系中TDP-43蛋白表达量及统计分析，其中，T表示肝癌病人被测试的血清，N健康阴性对照，#1表示随机病例1血清，#2表示随机病例2血清，#3表示随机病例3血清，#4表示随机病例4血清；

图3为TDP-43在肝癌中的表达情况及临床意义，A为来自TCGA数据集的HCC患者与正常人的TDP-43表达差异；B为HCC患者中TDP-43表达与HCC分级的相关性分析；C为HCC患者中TDP-43表达与HCC分期的相关性分析；D为HCC患者中TDP-43表达与淋巴结转移的相关性分析；Kaplan-Meier生存曲线对高表达TDP-43HCC患者和中/低表达TDP-43。

具体实施方式

本发明提供了本发明提供了一种TDP-43在制备诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用。

在本发明中，所述的TDP-43序列的GenBank号为EF434181.1，蛋白ID为ABO32290.1。

本发明还提供了一种用于诊断原发性肝癌的引物，所述引物包括扩增TDP-43的上下游引物，所述扩增TDP-43的上下游引物的序列，其中上游引物为GGTTGGGGATCAGCATCCAA(SEQ ID No.1)；下游引物为TACCAACCAACCACAACCCC(SEQ ID No.2)。

本发明还提供了一种用于诊断原发性肝癌的试剂盒，包括上述引物。

在本发明中，所述试剂盒优选的还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂。所述试剂盒优选的还包括阴性对照，所述阴性对照为健康人的血清。

本发明通过研究发明，本发明中低表达TDP-43患者的生存率显著高于高表达患者的生存率。因此，本发明提供了一种TDP-43抑制剂在制备治疗原发性肝癌的药物中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

在以下的实施例中，统计学分析方法均采用GraphpadPrism6.0软件进行数据统计和分析，数据以Mean±SD表示；两组独立样本采用t检验，两组以上采用one-wayANOVA检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

实施例1

1.实验材料

1.1.细胞系和组织

人肝癌细胞系(HCCLM3)，由中国科学院上海细胞库提供，人肝组织正常细胞系(LO2)，肝癌石蜡切片是由温州医科大学附属第一医院提供。

1.2.实验试剂

表1试剂信息

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1.3.相关试剂

1.3.1.细胞培养相关试剂：

(1)细胞培养基：将FBS加入到DMEM培养基中配制10％的培养基，再按照1％的比例加入双抗(青链霉素混合液)，待混合均匀后可暂时置于4℃冰箱中保存备用；

(2)细胞冻存液：50％FBS+40％DMEM+10％DMSO，现配现用；

(3)LB培养基：分别称量胰蛋白胨(tryptone)10g、酵母提取物(yeast extract)5g、氯化钠(NaCl)10g，固体培养基需另加琼脂粉15g～20g，最后加双蒸水至1000mL，121℃灭菌30min，液体LB培养基分装5mL到试管中4℃保存备用，用前按0.1％加入抗生素即可；若配置固体LB培养基,则在冷却至60～70℃时加入1mL抗生素/L，倒入细菌培养皿中4℃保存备用。

1.3.2.Western Blot实验相关试剂配方：

(1)8％SDS-PAGE分离胶溶液配制，具体组成见表2：

表2

(2)SDS-PAGE浓缩胶溶液配制，具体见表3：

表3

(3)转膜缓冲液(现配现用)，具体组成见表4：

表4

(4)TBST缓冲液配制，具体组成见表5：

表5

(5)5×SDS-PAGE电泳缓冲液，具体组成见表6：

表6

2.实验方法

2.1建立HCCLM3与LO2细胞模型，细胞中提取RNA，通过RNA-SEQ测序结果筛选表达高且差异倍数大的候选mRNAs。

2.1.1细胞培养

HCCLM3或LO2细胞转染

(1)细胞铺板：将处于对数生长期的细胞消化下来，进行细胞计数，以六孔板为例，每孔约接种2×10

(2)观察细胞状态和密度，当细胞融合度在70％～80％时即可进行转染。准备有关质粒、转染试剂盒Lipofectamine3000、若干无菌去酶Ep管、opti-MEM培养基试剂；

(3)每个转染组取2支去酶Ep管，A管中加入125μLopti-MEM培养基，再加入7.5μL的lipofectamine3000，混匀；B管中加入125μL的opti-MEM培养基，再加入10μL P3000和5μg质粒，混匀；(各成分用量可根据实际情况调整)；

(4)将A管液体加至B管中，待两者混合均匀后室温静置10min；

(5)细胞换液：将六孔板中原来的培养基吸去，用PBS轻轻洗涤细胞2次，再加入3mLDMEM；

(6)待步骤(4)中10min孵育后，分别向各孔细胞培养皿中加入相对应的转染混合液，并做好相应标记，轻轻摇晃六孔板，混匀培养液；

(7)将六孔板放置37℃恒温培养箱中孵育，24小时后置于荧光显微镜下观察，由于质粒上带有EGFP增强绿色荧光蛋白标签，若细胞内出现绿色荧光则表明质粒已转入细胞并成功表达，若荧光较少则可以48小时后再换液；

(8)弃去转染培养基，换成新的完全培养基(转染试剂lipofectamine3000对细胞有毒性影响细胞状态，不能长时间处理)，一般48小时后即可进行蛋白验证。

2.2荧光定量PCR

2.2.1.细胞总RNA的提取

(1)弃去六孔板中的培养基，每孔加1mL RNase-free PBS洗3遍；

(2)每孔加1mLTrizol,冰上静置5min后，用移液枪吹打培养皿底部数次使细胞脱离皿底后，将细胞裂解液转移至1.5mL的去酶Ep管中；

(3)每管按照Trizol：氯仿＝5：1的比例加入200μL氯仿，漩涡振荡仪上剧烈振荡15s；

(4)放置4℃离心机，12000rpm离心10min；

(5)吸取上层水相(约450～500μL)至另一新的去酶Ep管中，加入等体积异丙醇，轻柔颠倒混匀数次，冰上静置10min；

(6)4℃条件下12000rpm离心10min；

(7)此时管底可见少量白色沉淀，即为RNA，小心弃上清，加1mL现配的75％乙醇(用DEPC水配)，漩涡振荡混匀后，4℃条件下12000rpm离心10min；

(8)重复一次上述洗涤过程；

(9)去上清后(尽量去除干净)将Ep管开盖放在通风橱内干燥至半透明状态，(约10min)，加入30μLDEPC水溶解(加水量可视情况而定)，提取的RNA可放置-80℃保存。

2.2.2.RNA逆转录

(1)将-80℃保存的RNA放在冰上溶解，漩涡混匀后点离，用Nanodrop2000测总RNA浓度，当A260/A280的数值范围在1.8～2.2之间，则该样本RNA纯度较高，适合进行下一步逆转录；

(2)将逆转录试剂盒中所有试剂提前放在冰上溶解，配置反应体系：

表7

(3)在PCR仪上设置逆转录程序：50℃，15min；85℃，5s；4℃保存；

(4)反应完成后，cDNA可在-20℃长期储存。

2.2.3.Q-PCR

(1)使用软件Primer Premier 5设计引物序列：

表8

(2)将合成后的引物粉末点离，按说明书加适量ddH

(3)将SYBR Green放在冰上溶解，将逆转录所得cDNA用ddH

表9

(4)反应体系混匀点离，设置反应程序如下：

表10

(5)分析数据：数据从BioRad中导出后，用ΔΔCt法分析。

提取细胞中RNA，通过RNA-SEQ测序，筛选表达高且差异倍数大的TDP43，结果见图1。

由图1结果表明，与正常肝细胞相比，肝癌HCCLM3细胞中TDP43高表达。

实施例2

2.1病例来源

所有实验组对象均来自2017年1月至2019年5月在温州医科大学第二附属医院就诊的确诊原发性肝细胞型肝癌患者，共计48例；健康对照组来自温州医科大学第二附属医院健康查体中心，共计48例。

2.2血清样本处理

将采集的到的全血标本采用EDTA抗凝法处理后，在4℃下4000rpm离心10分钟全血标本得到血清。用500μL去RNA酶处理EP管对血清样本进行分装，分装后置于-80℃冰箱保存。

将提取血清中的总蛋白，将抽提的蛋白进行WB分析，将实施例1筛选出具有监测肝细胞性肝癌转移性的特异性生物标志物的TDP-43并对临床价值进行评估，肝癌组织以GAPDH蛋白为内参/血清以Transferrin为内参，健康人为1，病人大于2.5判定为阳性，对正常人和HCC患者进行逐个检测。具体步骤如下：

2.3免疫印迹(Westernblot)

2.3.1细胞总蛋白的提取

(1)准备冰盒，干净的细胞刮，将PBS、RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂混合物提前备好置于冰上；

(2)将细胞从培养箱中取出，置于冰上，弃掉培养基，加2mLPBS洗三遍，吸去残余液体，六孔板中加100μLRIPA细胞裂解液(含1％蛋白酶抑制剂混合液)，摇晃铺匀，冰上静置裂解5min；

(3)用细胞刮刮下裂解细胞，用移液枪收集至1.5mLEp管中，4℃，14.8×10

(4)吸取上清液至另一个新的EP管中，做好标记，于-20℃保存或-80℃长期保存。

2.3.2血清血浆蛋白提取(去除高丰度蛋白)

1)取40μL血浆/血清，以结合缓冲液(试剂盒：Binding Buffer)十倍稀释；

2)除去柱子上的盖子，以纸吸去贮存缓冲液；

3)除去柱底部的尖咀，放入大小适合的收集管；

4)加入850μL结合缓冲液，让其靠重力流过柱体；

5)将柱子放入一个新的大小适合的收集管中；

6)加入稀释后的样本，让其靠重力流过柱体；

7)以600μL结合缓冲液清洗柱体；

8)再次以600μL结合缓冲液清洗柱体收集上三步的洗脱组份，即为去除白蛋白/IgG后的样本真空冷冻干燥后备用；

9)将冻干的样品加入200μL SDS裂解进行复溶；

10)将溶液在室温下12000rpm离心10min，取上清，并再次离心取上清；

11)上清液即为组织的总蛋白溶液，采用BCA法测定提取的蛋白浓度并分装后储存于-80℃备用。

2.3.3.BCA法测定蛋白浓度

(1)用浓度为0.5mg/mL的蛋白标准品设置梯度标准蛋白孔：在96孔板中分别加入0，1，2，4，8，12，16，20μL蛋白标准液，再分别对应加入20，19，18，16，12，8，4，0μLPBS溶液补齐到20μL；

(2)待测样品孔中加入2μL待测蛋白和18μLPBS溶液；

(3)配制一定量的BCA工作液，用移液器混合均匀，避免气泡产生，置于37℃恒温箱反应30min；

(4)使用酶标仪检测波长为562nm的吸光度值，根据梯度标准蛋白孔制作标准曲线，得到曲线参数a和b计算出样品浓度。

2.3.4.蛋白样品变性

(1)根据样品浓度，计算将一定量蛋白样品稀释成1μg/μL浓度所需5×Load-ingbuffer和RIPA细胞裂解液的量；

(2)将蛋白样品、loading buffer和RIPA混匀点离，在100℃金属浴上加热10min，冷却后-20℃或-80℃冰箱保存。

2.3.5.蛋白电泳

(1)配制聚丙烯酰胺凝胶：取一套干净的1.5mm配胶板，固定在配胶架上，按照配方比例现配分离胶，缓慢加入约7.5mL分离胶，避免液面过高，然后缓慢注入自来水封胶，使胶面平整；

(2)约30min后(视温度而定)，待分离胶与水层之间出现明显的分界线，倒掉水层，并小心的用滤纸吸干；

(3)按照配方现配浓缩胶，每块约需3mL浓缩胶，缓慢注满剩余空间尽量不产生气泡，最后根据实验需要缓慢插入10孔或15孔样品梳，静置30min以上；

(4)待浓缩胶凝固后取下胶板，准备跑胶(也可暂时放入4℃冰箱保存待用)；

(5)将已配好的聚丙烯酰胺凝胶固定在电泳架上，加入1×SDS-PAGE电泳缓冲液测漏，不漏液的情况下放入电泳槽中，缓慢垂直拔出样品梳，准备上样；

(6)准备好蛋白marker和样品，按照顺序缓慢加入等量蛋白样品，并用1×loadingbuffer将所有的样品孔补齐至相同的体积；

(7)接通电源，设置程序：浓缩胶恒压70V，电泳时间30min；分离胶恒压为110V，时间为60min，待溴酚蓝染料接近胶底时停止电泳，拆下胶板准备转膜；

(8)配制转膜缓冲液：分别称量14.4g甘氨酸和3.0gTris至烧杯中，加蒸馏水溶解定容至800mL，再加200mL甲醇溶液至1000mL混匀，放在4℃冷却待用；

(9)同时准备医用托盘、转膜夹、海绵垫、转印滤纸，裁剪大小适量的PVDF膜约7.5cm×4cm，在甲醇中活化1min，浸泡在转膜缓冲液中；

(10)转膜：托盘中倒入转膜缓冲液，转膜夹黑面朝下，依次铺上两层海绵和一层滤纸，将取出的分离胶前后做标记，然后放到滤纸上，避免出现气泡，再将PVDF膜盖在胶上标记正反面，再依次铺上一层滤纸和两层海绵垫，夹紧转膜夹，放入转膜槽内，注意正负极，最后将所有转膜液倒入槽内，两侧放冰袋，接通电源，恒流300mA低温下转70min(转膜时间视所需蛋白分子量大小而定)；

(11)封闭：配制5％的脱脂牛奶，将1.5g脱脂牛奶溶于30mL的TBST中，摇床上混匀，将转好的PVDF膜在TBST里洗去残余的转膜液，再放入牛奶中室温摇晃封闭2h；

(12)一抗孵育：参照说明书的稀释比例，用Western一抗稀释液稀释相应一抗原液，抗体稀释后可置于4℃保存，封闭后的PVDF膜在TBST中洗去残余的牛奶，再根据蛋白marker切下所需分子量大小的条带，并放入对应的一抗中，置于4℃摇床上孵育过夜；

(13)二抗孵育：用TBST稀释二抗，将过夜后的条带放入TBST中快速摇晃洗涤10min，三次，洗去条带上未结合的残余一抗，再放入对应抗性的二抗中，室温摇床上缓慢孵育2h,然后将条带放入TBST中快速摇晃洗涤10min,三次，准备曝光；

(14)准备曝光夹，干净保鲜膜，滤纸，配制一定量的ECL曝光液，按照A液：B液＝1：1的比例混合，避光保存待用；

(15)曝光：选择按照一定顺序整齐的将条带用滤纸吸干水分后放到保鲜膜上，然后把保鲜膜放入暗夹，将ECL曝光液滴加到条带上，每根条带约加200μL曝光混合液，覆盖上所有条带后关上曝光夹孵育1min后，在凝胶成像仪上显影；

(16)选择化学发光模式，曝光时间视不同情况而定。将所有照片保存到文件夹中，待分析。

2.4.细胞免疫荧光

(1)细胞铺板：取出待用细胞进行消化处理(如：6cm细胞培养皿)，加入1mL细胞培养基吹打混匀，按细胞计数方法计数，取6×104个细胞约20μL，滴置放细胞爬片的24孔板中，再加1mL细胞培养基混匀后放置37℃恒温培养箱中培养；

(2)第二天待细胞融合度约40％～60％时，可进行实验。首先弃掉原培养基，沿侧壁加入1mL PBS清洗3次；

(3)每孔分别加500μL 4％多聚甲醛室温条件下固定30min；

(4)弃去4％多聚甲醛后，每孔加1mL PBS清洗3次，每次摇床上缓慢摇晃5min；

(5)弃去PBS后，每孔加500μL 0.5％TritonX-100溶液室温条件下通透15min；

(6)弃去0.5％TritonX-100溶液后，每孔加1mLPBS洗3次，每次摇床上缓慢摇晃5min；

(7)每孔加1mL免疫染色封闭液(或5％BSA溶液)室温摇床上缓慢摇晃封闭1h；

(8)用免疫染色封闭液(或5％BSA溶液)按一定比例稀释目的蛋白一抗，每孔150μL，4℃孵育过夜；

(9)第二天，回收一抗溶液，每孔先加1mL PBST(含0.1％Tween-20)洗3次，每次摇床上缓慢摇晃5min；再加1mL PBS洗3次，每次5min，洗去残余的一抗；

(10)每孔加200μL用免疫染色二抗稀释液稀释的相应抗性的二抗，室温条件下避光孵育1h；

(11)避光条件下，弃去二抗，每孔先加1mL PBST洗3次，每次摇床上缓慢摇晃5min；再加1mL PBS洗3次，每次5min；

(12)弃去PBS后，每孔加200μL DAPI染液，室温避光染色10min；

(13)弃去DAPI染液每孔加1mL PBS洗3次，每次摇床上缓慢摇晃5min；

(14)封片，将细胞爬片稍微晾干，在干净的载玻片上加约4μL抗荧光淬灭剂，将爬片倒扣，尽量不产生气泡，再用透明指甲油在四周封片。

2.5.细胞荧光原位杂交

(1)细胞铺板方法同细胞免疫荧光步骤，24孔板铺6×10

(2)弃去原培养基，每孔加入500μL去酶的4％多聚甲醛室温条件下固定10min；

(3)弃去4％多聚甲醛后，每孔加1mL去酶的PBS洗3次，每次摇床上缓慢摇晃5min；

(4)弃去PBS后，每孔加入500μL去酶的0.5％TritonX-100溶液冰上静置处理10min；

(5)弃去0.5％TritonX-100溶液后，每孔加1mL去酶的PBS洗3次，每次摇床上缓慢摇晃5min；

(6)每孔加200μL预杂交液(Pre-hybridization:Blocking buffer＝99:1)，37℃避光孵育30min；

(7)吸去预杂交液，每孔加100μL杂交液(Hybridization:Blocking buffer＝99:1)和2μL 20μM lncRNA FISH Probe MiX荧光探针，37℃恒温培养箱避光孵育过夜(一般16h)；

(8)避光条件下洗去多余未结合的头荧光探针，每孔加1mL 4×SSC洗液(含0.1％Tween-20)，室温摇床上缓慢摇晃5min，洗3次；再分别加入2×SSC洗液、1×SSC洗液以相同的方法洗涤；

(9)每孔加1mL去酶的PBS室温摇床上缓慢洗涤5min；

每孔加100μL RNase-free H

(10)每孔加1mL去酶PBS室温摇床上缓慢洗涤5min，洗3次；

(11)细胞爬片晾干后，加抗荧光淬灭剂，用封片剂或指甲油固定封片；

(12)激光共聚焦显微镜下拍照，保存结果后续分析。

2.6.免疫共沉淀

(1)设置实验组和阴性对照组，每组取一个10cm细胞培养皿，约1×10

(2)从培养箱中取出细胞放在冰上，加入2mL预冷的PBS洗两遍，每皿加1mL IP裂解液(含1％蛋白酶抑制剂混合液)，冰上裂解5min，用细胞刮收集至1.5mL Ep管中，14.8×10

(3)用BCA试剂盒法测蛋白浓度，每组取1mg总蛋白样本，加40μLProteinA+G琼脂糖珠子，4℃旋转预处理2h；

(4)4℃条件下，2500rpm离心1min，小心将上清液转移至另一新的去酶Ep管中；

(5)实验组加入兔源TDP-43一抗5μg，阴性对照组加入兔IgG一抗5μg，4℃旋转过夜(约16h)；

(6)每组取70μL Protein A+G琼脂糖珠子至去酶Ep管中，加PBS 1mL洗两遍，再加1mL 5％BSA旋转混匀封闭2h；

(7)4℃条件下，2500rpm离心1min，去除上清，每管加1mL PBS清洗珠子3遍，离心去上清；

(8)将封闭后的珠子分别加到过夜混匀后的样本和一抗中，4℃冷库中旋转结合3h；

(9)每组Ep管分别加1mL IP裂解液洗一遍，1mL PBS缓冲液洗三遍，离心去除上清；

(10)每组各加40μL 1×loading bufer重悬琼脂糖珠子，100℃金属浴中加热10min；

(11)将准备的IP样品进行WesternBlot实验，步骤同2.2，最后孵育的一抗可包括TDP-43抗体拉下的TDP-43蛋白和与之相互作用的蛋白。

2.7.实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)

2.7.1细胞悬液准备

(1)消化收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清；加入新鲜的完全培养基，吹打混匀；

(3)计数板计数完细胞悬液后，稀释成8×10

2.7.2.E-Plate96准备

(1)在E-Plate96的孔中加入50μL完全培养基；

(2)将E-Plate96放到RTCA Station上；

(3)设置程序，检测基线；

(4)取出E-Plate96，悬空加入100μL混合均匀的细胞悬液，使每孔中细胞数目为8000个/100μL；

(5)将E-Plate96室温放置30min；

(6)将E-Plate96放到RTCA Station上，在系统自动扫描“Scan Plate”后，开始过夜检测细胞增殖曲线。

2.8.免疫组织化学染色(IHC)

(1)融蜡：将4℃保存的肝癌石蜡切片放置于载玻片架上，置于65℃烘箱中融蜡1h以上；

(2)脱蜡：将融蜡后的玻片立即放在二甲苯I中10min，接着放入二甲苯II中5min，最后放入50％二甲苯(二甲苯：乙醇＝1:1)中过度1min；

(3)复水：将切片按以下顺序依次放入不同浓度的乙醇中：100％乙醇Ⅰ→100％乙醇Ⅱ→95％乙醇Ⅰ→95％乙醇Ⅱ→85％乙醇→75％乙醇→50％乙醇，各2min；

(4)水化，将玻片放入蒸馏水中充分水化5min；

(5)将切片放入PBS中浸洗3次，每次3min；

(6)抗原修复：把柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.0)加入烧杯中，放入切片，将微波炉调至中高火，加热6分钟后自然冷却6分钟，如此重复3个循环(共需36分钟)，最后一次冷却至室温(注意：抗原修复过程中不能干片，否则非特异性背景会比较高；抗原修复完成后，一定要将切片在缓冲液中恢复至室温后再放入PBS缓冲液中浸洗，否则容易出现脱片现象)；

(7)将切片放入PBS中浸洗3次，每次3min；

(8)每张切片上加约200μL的3％H

(9)每张切片上加约200μL免疫染色封闭液，室温封闭30min，同时用免疫染色封闭液按说明书比例稀释特异性的一抗；

(10)弃去免疫染色封闭液，每张切片分别加入150μL稀释后的一抗，4℃孵育过夜(注意：避免干燥，否则会引起非特异性染色)；

(11)一抗孵育过夜后将切片取出，在室温下复温30min，防止脱片以及让抗体和蛋白充分结合；

(12)将切片放入PBS中浸洗4次，每次5min；

(13)每张切片上加150μL对应抗性的二抗，室温孵育30min；

(14)弃去二抗，将切片放入PBS中浸洗4次，每次5min；每张切片上加150μL反应增强液，室温孵育30min；

(15)弃去反应增强液，PBS中浸洗4次，每次5min；

(16)每张切片上加200μL DAB显色液，室温孵育1～5min(根据不同蛋白在组织中表达量的多少以及一抗的稀释浓度调整染色时间，但是一般不超过8min)，结束后用流水冲洗5min；

(17)苏木精染色液中染色2～3min，然后用流水冲洗5min；

(18)将切片放入盐酸酒精分化液中分化2秒，流水冲洗3min；

(19)按以下浓度梯度进行组织脱水：50％乙醇→75％乙醇→85％乙醇→95％乙醇Ⅰ→95％乙醇Ⅱ→100％乙醇Ⅰ→100％乙醇Ⅱ各脱水2min；

(20)透明：玻片依次放入50％二甲苯(二甲苯：乙醇＝1:1)、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2min(若玻片出现雾状则脱水不完全，重新进行脱水步骤)；

(21)封片，待玻片上的二甲苯在通风橱内挥发完全后，用中性树胶进行封片；

(22)拍照：封片后室温保存，待胶干或过夜后可在光学显微镜不同放大倍数下观察并用尼康相机采集系统拍照记录保存。

由图2结果表明，TDP-43在肝癌组织，肝癌细胞系中及血清中表达上调，同时结果表明，48例原发性肝癌细胞患者血清中的TDP43均高表达，而48例健康对照组的血清中的TDP43均未高表达。

实施例3

病例来源

所有实验组对象均来自2017年1月至2019年5月在温州医科大学第二附属医院就诊的确诊原发性肝细胞型肝癌患者370例，其中对357例原发性肝癌患者进行临床分级，1级54例，二级173例，3级118例，4级12例，对其中的340例原发性肝癌患者进行分期，1期168例，2期84例，3期82例，4期6例；选取其中256例原发性肝癌患者进行淋巴结转移研究；健康对照组来自温州医科大学第二附属医院健康查体中心，共计50例。将实施例1筛选出具有监测肝细胞性肝癌转移性的特异性生物标志物的TDP-43并对临床价值进行评估，肝癌组织以GAPDH蛋白为内参/血清以Transferrin为内参，健康人为1，病人大于2.5判定为阳性，对正常人和HCC患者中的TDP-43表达水平进行逐个检测。

结果见图3可知，在370例HCC患者与50例正常人的样本分析中，TDP-43在370例肝癌患者中的表达明显高于正常人(P<0.001，图3中A)，且TDP-43与肝癌的临床分级、分期及淋巴结转移密切相关(P<0.001，图3中的B～D)。同时，通过Kaplan-Meier Plotter分析发现，与TDP-43高表达患者相比，TDP-43低/中表达患者具有更高的生存率(P<0.001，图3中的E)。上述结果显示TDP-43在肝癌中表达上调且与肝癌分级、分期、转移及患者预后具有明显的临床相关性，这提示TDP-43可能在肝癌的发生发展过程中起着重要作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。