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抗体药物偶联物及其用途

文献发布时间：2023-06-19 19:28:50

技术领域

本发明涉及抗体药物偶联物以及该抗体药物偶联物的用途。

背景技术

靶向治疗癌症、免疫缺陷和感染性疾病等是目前精准医疗关注的核心。多年来许多文献报道了利用细胞表面受体结合分子作为药物输送工具与药物形成偶联物(共轭体)，进行靶向输送药物进攻各类致病细胞(Allen,T.M.and Cullis,P.R.,2004 Science,303(5665),1818-22，Hu,Q.Y.,etal.(2016)，Chem Soc Rev 45(6):1691-1719.)。

抗体药物偶联物由三部分组成：抗体、药物和连接二者之间的接头(Thomas,A.,etal.(2016)，Lancet Oncol 17(6):e254-e262)。三者之间各具有独特的功能：抗体需要对肿瘤细胞特异性结合，药物需要对肿瘤细胞足够的活性和广谱性，接头需要独特的功能性，在血液循环中稳定，到达肿瘤细胞后有效释放药物(Chari,R.V.(2008)，Acc Chem Res 41(1):98-107)，三者合理构建才能取得良好的临床效果(Singh,S.K.,etal.(2015)，PharmRes 32(11):3541-3571；Hamilton,G.S.(2015)，Biologicals 43(5):318-332)。

B7-H3(B7 homolog 3 protein)又名CD276，属于B7配体家族的I型跨膜糖蛋白。

目前发现B7-H3有两种存在形式：2Ig-B7-H3和4Ig-B7-H3。2Ig-B7-H3表达于鼠与人的细胞中，其有细胞外的IgV-IgC结构；4Ig-B7-H3仅表达于人细胞中，由串联重复的IgV-IgC-IgV-IgC结构组成。人类B7-H3的主要存在形式为4Ig-B7-H3。

B7-H3在正常组织中的表达水平有限，但在多种人类晚期实体瘤中异常高表达，包括但不限于头颈癌、肾癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌和肝癌。它的过度表达通常与患者较差的预后和较差的临床结果相关。因此，B7-H3被认为是某些肿瘤的诊断标志物，可作为抗肿瘤药物开发的有效的靶点。

发明内容

本发明的一个或多个实施方式提供了抗体药物偶联物，其包含通过接头与药物偶联的抗体或其抗原结合单元，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含(a)-(f)中的一个或多个氨基酸序列：

(a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(d)VL CDR1，其包含如SEQ ID NO:9-13中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:9-13中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(e)VL CDR2，其包含如SEQ ID NO:14-18中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:14-18中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(f)VL CDR3，其包含如SEQ ID NO:19-23中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:19-23中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

(a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；和

(b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；和

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

(d)VL CDR1，其包含如SEQ ID NO:9-13中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:9-13中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；和

(e)VL CDR2，其包含如SEQ ID NO:14-18中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:14-18中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；和

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:14所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:10所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:20所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:21所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:12所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:22所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:13所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:18所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；和

在一个或多个实施方式中，所述取代为保守氨基酸取代。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

(a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；和

(b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；和

(d)VL CDR1，其包含如SEQ ID NO:9-13中任一项所示的氨基酸序列；和

(e)VL CDR2，其包含如SEQ ID NO:14-18中任一项所示的氨基酸序列；和

(f)VL CDR3，其包含如SEQ ID NO:19-23中任一项所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3、如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:14所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3、如SEQ ID NO:10所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:20所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3、如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:21所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3、如SEQ ID NO:12所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:17所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:22所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3、如SEQ ID NO:13所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:18所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。

VH CDR的氨基酸序列(Kabat编号)

VL CDR的氨基酸序列(Kabat编号)

在一个或多个实施方式中，抗体或其抗原结合单元还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其组合。在一个或多个实施方式中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一个或多个实施方式中，抗体或其抗原结合单元是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD其中一种同种型。在一个或多个实施方式中，同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个或多个实施方式中，抗体或其抗原结合单元是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。

在一个或多个实施方式中，Fc是变体Fc区。在一个或多个实施方式中，相对于亲本Fc区，变体Fc区具有一个或多个氨基酸修饰，如取代、缺失或插入。在一个或多个实施方式中，相对于亲本Fc区活性，Fc区的氨基酸修饰改变了效应功能活性。在一个或多个实施方式中，变体Fc区可以具有改变的(即，增加的或降低的)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CDC)、吞噬作用、调理作用或细胞结合。在一个或多个实施方式中，相对于亲本Fc区，Fc区氨基酸修饰可以改变变体Fc区对FcγR(Fcγ受体)的亲和力。在一个或多个实施方式中，所述Fc区来源于IgG1或IgG4。在一个或多个实施方式中，Fc区突变是N297A、L234A或L235A(Eu编号)。在一个或多个实施方式中，Fc区突变是E345R或S440Y(Eu编号)。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为scFV、Fab、Fab'或F(ab)

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:24和35-38中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24和35-38中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80％或90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24和35-38中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或

所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:25-29和39-41中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25-29和39-41中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80％或90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25-29和39-41中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:24所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列相比具有至少80％或90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或

所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:25-29中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25-29中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80％或90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25-29中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:24所示的氨基酸序列，所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:24所示的氨基酸序列，所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:24所示的氨基酸序列，所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:24所示的氨基酸序列，所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:24所示的氨基酸序列，所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:35-38中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:35-38中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80％或90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:35-38中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或

所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:39-41中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:39-41中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80％或90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:39-41中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:35所示的氨基酸序列，所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:36所示的氨基酸序列，所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:36所示的氨基酸序列，所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:37所示的氨基酸序列，所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQID NO:38所示的氨基酸序列，所述抗体或其抗原结合单元的轻链可变区包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。

可变区的氨基酸序列(Kabat编号)

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元的重链恒定区包含如SEQID NO:32或33所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:32或33所示的氨基酸序列相比具有至少80％或90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:32或33所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或

所述抗体或其抗原结合单元的轻链恒定区包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列相比具有至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式提供了特异性结合B7-H3的抗体，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链恒定区；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的轻链可变区和如SEQID NO:34所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链恒定区；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链恒定区；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链恒定区；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链恒定区；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链恒定区；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链恒定区；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链恒定区；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链恒定区；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链恒定区；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

恒定区的氨基酸序列

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体或其抗原结合单元(例如双特异性抗体或其抗原结合单元)。

在一个或多个实施方式中，所述抗体具有两条序列相同的重链和两条序列相同的轻链。在一个或多个实施方式中，Fc区配对形成二硫键。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为分离的抗体或其抗原结合单元。

在一个或多个实施方式中，所述接头为可裂解的接头。

在一个或多个实施方式中，所述药物为抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物。

在一个或多个实施方式中，所述药物为抗癌药物。

在一个或多个实施方式中，所述药物为微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂或DNA拓扑异构酶抑制剂。

在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、美登素(maytansine)类。

在一个或多个实施方式中，所述药物为奥瑞他汀(auristatin)类，例如一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、一甲基澳瑞他汀F(MMAF)或澳瑞他汀F(AF)。

在一个或多个实施方式中，所述药物为DNA损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物PBD(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。

在一个或多个实施方式中，所述药物为DNA拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物SN-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、依喜替康衍生物，硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(D-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3H)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-N-(苯基甲基)-(2E)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-N-(3-羟基苯基丙基)-(E)-2-丙烯酰胺、12-β-D-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5H-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6H)-二酮、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。

在一个或多个实施方式中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康。

在一个或多个实施方式中，所述药物为Tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、CC-1065及其类似物、Amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(PBD)二聚体类、阿霉素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素C，马法兰或苯丁酸氮芥衍生物。

在一个或多个实施方式中，所述药物具有氨基或被一个烷基取代氨基，其与接头通过酰胺键连接。

在一个或多个实施方式中，所述药物为

H，

羟基，

C1-C6烷基，

被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的C1-C6烷基，

C2-C6烯基，

C2-C6炔基，

C1-C6烷氧基，

C1-C6氨基烷氧基，

卤素，

硝基，

氰基，

巯基，

烷硫基，

氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基，

在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基氨基，

连接至杂环的C1-C6烷基，所述杂环任选被一个或多个C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，

连接至杂环的C1-C6烷基氨基，所述杂环任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，

氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个C1-C6烷基取代，

杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或C1-C6烷基取代，

任选被氨基甲酰基保护基或C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，

吗啉-1-基，或

哌啶-1-基；

**与接头连接；

y为0、1或2；

Y为O、S或CR

s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪(niverazine)、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。

在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。

在一个或多个实施方式中，所述药物为

在一个或多个实施方式中，X

本发明的一个或多个实施方式提供了抗体药物偶联物，其具有式I所示的结构或其立体异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中

Abu为抗体或其抗原结合单元；所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3；

D为抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；

M为

B为

L为-(AA)

G为

p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一个或多个实施方式中，D为抗癌药物。

在一个或多个实施方式中，D为微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂或DNA拓扑异构酶抑制剂。

在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、美登素(maytansine)类。

在一个或多个实施方式中，D为奥瑞他汀(auristatin)类，例如MMAE、MMAF或AF。

在一个或多个实施方式中，D为DNA损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物PBD(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。

在一个或多个实施方式中，D为DNA拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物SN-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、依喜替康衍生物，硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(D-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3H)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-N-(苯基甲基)-(2E)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-N-(3-羟基苯基丙基)-(E)-2-丙烯酰胺、12-β-D-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5H-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6H)-二酮、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。

在一个或多个实施方式中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康。

在一个或多个实施方式中，D为Tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、CC-1065及其类似物、Amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(PBD)二聚体类、阿霉素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素C，马法兰或苯丁酸氮芥衍生物。

在一个或多个实施方式中，D具有氨基或被一个烷基取代氨基，其与FF通过酰胺键连接。

在一个或多个实施方式中，D为

H，

羟基，

C1-C6烷基，

被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的C1-C6烷基，

C2-C6烯基，

C2-C6炔基，

C1-C6烷氧基，

C1-C6氨基烷氧基，

卤素，

硝基，

氰基，

巯基，

烷硫基，

氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基，

在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基氨基，

连接至杂环的C1-C6烷基，所述杂环任选被一个或多个C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，

连接至杂环的C1-C6烷基氨基，所述杂环任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，

氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个C1-C6烷基取代，

杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或C1-C6烷基取代，

任选被氨基甲酰基保护基或C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，

吗啉-1-基，或

哌啶-1-基；

**与L连接；

y为0、1或2；

Y为O、S或CR

s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪(niverazine)、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。

在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。

在一个或多个实施方式中，D为

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，R为-(CH

在一个或多个实施方式中，各AA独立选自以下的氨基酸或肽序列：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu和Gly-Phe-Leu-Gly。

在一个或多个实施方式中，AA为Val-Cit，i为1。

在一个或多个实施方式中，各FF独立为

在一个或多个实施方式中，卤素为F，z为0、1、2、3或4。

在一个或多个实施方式中，R

在一个或多个实施方式中，z为0。

在一个或多个实施方式中，z为1或2。

在一个或多个实施方式中，各FF独立为

在一个或多个实施方式中，f为1。

在一个或多个实施方式中，FF为

在一个或多个实施方式中，L为

在一个或多个实施方式中，G为

在一个或多个实施方式中，n为4-8。

在一个或多个实施方式中，n为4。

在一个或多个实施方式中，n为8。

在一个或多个实施方式中，p为2-8。

在一个或多个实施方式中，p为4-8。

在一个或多个实施方式中，p为6-8。

在一个或多个实施方式中，p为7-8。

本发明的一个或多个实施方式提供了抗体药物偶联物，其具有式I所示的结构或其立体异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中

Abu为抗体或其抗原结合单元；所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含(a)-(f)中的一个或多个氨基酸序列：

(a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(f)VL CDR3，其包含如SEQ ID NO:19-23中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:19-23中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

D为抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；

M为

B为

L为-(AA)

G为

p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:14所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:10所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:20所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:21所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:12所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:22所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:13所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:18所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述取代为保守氨基酸取代。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为scFV、Fab、Fab’或F(ab)。在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为单克隆抗体。

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体具有两条序列相同的重链和两条序列相同的轻链。在一个或多个实施方式中，Fc区配对形成二硫键。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为分离的抗体或其抗原结合单元。

在一个或多个实施方式中，D为抗癌药物。

在一个或多个实施方式中，D为微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂或DNA拓扑异构酶抑制剂。

在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、美登素(maytansine)类。

在一个或多个实施方式中，D为奥瑞他汀(auristatin)类，例如MMAE、MMAF或AF。

在一个或多个实施方式中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康。

在一个或多个实施方式中，D具有氨基或被一个烷基取代氨基，其与FF通过酰胺键连接。

在一个或多个实施方式中，D为

H，

羟基，

C1-C6烷基，

被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的C1-C6烷基，

C2-C6烯基，

C2-C6炔基，

C1-C6烷氧基，

C1-C6氨基烷氧基，

卤素，

硝基，

氰基，

巯基，

烷硫基，

氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基，

在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基氨基，

连接至杂环的C1-C6烷基，所述杂环任选被一个或多个C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，

连接至杂环的C1-C6烷基氨基，所述杂环任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，

氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个C1-C6烷基取代，

杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或C1-C6烷基取代，

任选被氨基甲酰基保护基或C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，

吗啉-1-基，或

哌啶-1-基；

**与L连接；

y为0、1或2；

Y为O、S或CR

s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪(niverazine)、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。

在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。

在一个或多个实施方式中，D为

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，R为-(CH

在一个或多个实施方式中，AA为Val-Cit，i为1。

在一个或多个实施方式中，各FF独立为

在一个或多个实施方式中，卤素为F，z为0、1、2、3或4。

在一个或多个实施方式中，R

在一个或多个实施方式中，z为0。

在一个或多个实施方式中，z为1或2。

在一个或多个实施方式中，各FF独立为

在一个或多个实施方式中，f为1。

在一个或多个实施方式中，FF为

在一个或多个实施方式中，L为

在一个或多个实施方式中，G为

在一个或多个实施方式中，n为4-8。

在一个或多个实施方式中，n为4。

在一个或多个实施方式中，n为8。

在一个或多个实施方式中，p为2-8。

在一个或多个实施方式中，p为4-8。

在一个或多个实施方式中，p为6-8。

在一个或多个实施方式中，p为7-8。

在一个或多个实施方式中，所述抗体药物偶联物具有式I-1所示的结构或其立体异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中

Abu为抗体或其抗原结合单元；所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含(a)-(f)中的一个或多个氨基酸序列：

(a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

R选自：-(CH

D为抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；

n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；

p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:14所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:10所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:20所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:21所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:12所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:22所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:13所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:18所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述取代为保守氨基酸取代。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为scFV、Fab、Fab’或F(ab)

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如SEQ ID NO:24和35-38中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24和35-38中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80％或90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24和35-38中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体具有两条序列相同的重链和两条序列相同的轻链。在一个或多个实施方式中，Fc区配对形成二硫键。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为分离的抗体或其抗原结合单元。

在一个或多个实施方式中，D为微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂或DNA拓扑异构酶抑制剂。

在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类及美登素(maytansine)类。

在一个或多个实施方式中，D为奥瑞他汀(auristatin)类，例如MMAE、MMAF或AF。

在一个或多个实施方式中，D为DNA拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物SN-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(D-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3H)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-N-(苯基甲基)-(2E)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-N-(3-羟基苯基丙基)-(E)-2-丙烯酰胺、12-β-D-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5H-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6H)-二酮、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。

在一个或多个实施方式中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康。

在一个或多个实施方式中，D为Tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、CC-1065及其类似物、Amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(PBD)二聚体类、阿霉素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素C，马法兰，或苯丁酸氮芥衍生物。

在一个或多个实施方式中，D为

H，

羟基，

C1-C6烷基，

被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的C1-C6烷基，

C2-C6烯基，

C2-C6炔基，

C1-C6烷氧基，

C1-C6氨基烷氧基，

卤素，

硝基，

氰基，

巯基，

烷硫基，

氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基，

在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基氨基，

连接至杂环的C1-C6烷基，所述杂环任选被一个或多个C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，

连接至杂环的C1-C6烷基氨基，所述杂环任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，

氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个C1-C6烷基取代，

杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或C1-C6烷基取代，

任选被氨基甲酰基保护基或C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，

吗啉-1-基，或

哌啶-1-基；

**为连接点；

y为0、1或2；

Y为O、S或CR

s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。

在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。

在一个或多个实施方式中，D为

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，R为-(CH

在一个或多个实施方式中，n为4-12。

在一个或多个实施方式中，n为4-8。

在一个或多个实施方式中，n为4。

在一个或多个实施方式中，n为8。

在一个或多个实施方式中，p为2-8。

在一个或多个实施方式中，p为4-8。

在一个或多个实施方式中，p为6-8。

在一个或多个实施方式中，p为7-8。

在一个或多个实施方式中，所述抗体药物偶联物具有式I-2、I-2-1所示的结构或其立体异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中

Abu为抗体或其抗原结合单元；所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含(a)-(f)中的一个或多个氨基酸序列：

(a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

R选自：-(CH

D为抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；

n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；

p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:14所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:10所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:20所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:21所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:12所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:22所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:13所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:18所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述取代为保守氨基酸取代。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为scFV、Fab、Fab’或F(ab)

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体具有两条序列相同的重链和两条序列相同的轻链。在一个或多个实施方式中，Fc区配对形成二硫键。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为分离的抗体或其抗原结合单元。

在一个或多个实施方式中，D为微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂或DNA拓扑异构酶抑制剂。

在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、及美登素(maytansine)类。

在一个或多个实施方式中，D为奥瑞他汀(auristatin)类，例如MMAE、MMAF或AF。

在一个或多个实施方式中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康。

在一个或多个实施方式中，D为

H，

羟基，

C1-C6烷基，

被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的C1-C6烷基，

C2-C6烯基，

C2-C6炔基，

C1-C6烷氧基，

C1-C6氨基烷氧基，

卤素，

硝基，

氰基，

巯基，

烷硫基，

氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基，

在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基氨基，

连接至杂环的C1-C6烷基，所述杂环任选被一个或多个C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，

连接至杂环的C1-C6烷基氨基，所述杂环任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，

氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个C1-C6烷基取代，

杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或C1-C6烷基取代，

任选被氨基甲酰基保护基或C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，

吗啉-1-基，或

哌啶-1-基；

**为连接点；

y为0、1或2；

Y为O、S或CR

s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。

在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。

在一个或多个实施方式中，D为

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，R为-(CH

在一个或多个实施方式中，n为4-12。

在一个或多个实施方式中，n为4-8。

在一个或多个实施方式中，n为4。

在一个或多个实施方式中，n为8。

在一个或多个实施方式中，p为2-8。

在一个或多个实施方式中，p为4-8。

在一个或多个实施方式中，p为6-8。

在一个或多个实施方式中，p为7-8。

在一个或多个实施方式中，所述抗体药物偶联物具有式I-3所示的结构或其立体异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中

Abu为抗体或其抗原结合单元；所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含(a)-(f)中的一个或多个氨基酸序列：

(a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

D为抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；

n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；

p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:14所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:10所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:20所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:21所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:12所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:22所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:13所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:18所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述取代为保守氨基酸取代。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为scFV、Fab、Fab’或F(ab)

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体具有两条序列相同的重链和两条序列相同的轻链。在一个或多个实施方式中，Fc区配对形成二硫键。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为分离的抗体或其抗原结合单元。

在一个或多个实施方式中，D为微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂或DNA拓扑异构酶抑制剂。

在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类及美登素(maytansine)类。

在一个或多个实施方式中，D为奥瑞他汀(auristatin)类，例如MMAE、MMAF或AF。

在一个或多个实施方式中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康。

在一个或多个实施方式中，D为

H，

羟基，

C1-C6烷基，

被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的C1-C6烷基，

C2-C6烯基，

C2-C6炔基，

C1-C6烷氧基，

C1-C6氨基烷氧基，

卤素，

硝基，

氰基，

巯基，

烷硫基，

氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基，

在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基氨基，

连接至杂环的C1-C6烷基，所述杂环任选被一个或多个C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，

连接至杂环的C1-C6烷基氨基，所述杂环任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，

氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个C1-C6烷基取代，

杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或C1-C6烷基取代，

任选被氨基甲酰基保护基或C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，

吗啉-1-基，或

哌啶-1-基；

**为连接点；

y为0、1或2；

Y为O、S或CR

s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。

在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。

在一个或多个实施方式中，D为

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，n为4-12。

在一个或多个实施方式中，n为4-8。

在一个或多个实施方式中，n为4。

在一个或多个实施方式中，n为8。

在一个或多个实施方式中，p为2-8。

在一个或多个实施方式中，p为4-8。

在一个或多个实施方式中，p为6-8。

在一个或多个实施方式中，p为7-8。

在一个或多个实施方式中，所述抗体药物偶联物具有式I-4、I-4-1所示的结构或其立体异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中

Abu为抗体或其抗原结合单元；所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含(a)-(f)中的一个或多个氨基酸序列：

(a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

D为抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；

n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；

p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:14所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:10所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:20所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:21所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:12所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:22所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:13所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:18所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述取代为保守氨基酸取代。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为scFV、Fab、Fab’或F(ab)

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体具有两条序列相同的重链和两条序列相同的轻链。在一个或多个实施方式中，Fc区配对形成二硫键。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为分离的抗体或其抗原结合单元。

在一个或多个实施方式中，D为微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂或DNA拓扑异构酶抑制剂。

在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、及美登素(maytansine)类。

在一个或多个实施方式中，D为奥瑞他汀(auristatin)类，例如MMAE、MMAF或AF。

在一个或多个实施方式中，D为DNA损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物PBD(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)、DNA拓扑异构酶抑制剂。

在一个或多个实施方式中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康。

在一个或多个实施方式中，D为

H，

羟基，

C1-C6烷基，

被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的C1-C6烷基，

C2-C6烯基，

C2-C6炔基，

C1-C6烷氧基，

C1-C6氨基烷氧基，

卤素，

硝基，

氰基，

巯基，

烷硫基，

氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基，

在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基氨基，

连接至杂环的C1-C6烷基，所述杂环任选被一个或多个C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，

连接至杂环的C1-C6烷基氨基，所述杂环任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，

氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个C1-C6烷基取代，

杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或C1-C6烷基取代，

任选被氨基甲酰基保护基或C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，

吗啉-1-基，或

哌啶-1-基；

**为连接点；

y为0、1或2；

Y为O、S或CR

s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。

在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。

在一个或多个实施方式中，D为

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，n为4-12。

在一个或多个实施方式中，n为4-8。

在一个或多个实施方式中，n为4。

在一个或多个实施方式中，n为8。

在一个或多个实施方式中，p为2-8。

在一个或多个实施方式中，p为4-8。

在一个或多个实施方式中，p为6-8。

在一个或多个实施方式中，p为7-8。

在一个或多个实施方式中，所述抗体药物偶联物具有式I-5、I-5-1、I-6、I-6-1、I-7、I-7-1、I-8、I-8-1、I-9、I-9-1、I-10、I-10-1、I-11或I-11-1所示的结构或其立体异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中

Abu为抗体或其抗原结合单元；所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含(a)-(f)中的一个或多个氨基酸序列：

(a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

D为抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；

p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:14所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:10所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:20所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:21所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:12所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:22所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:13所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:18所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述取代为保守氨基酸取代。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为scFV、Fab、Fab’或F(ab)

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体具有两条序列相同的重链和两条序列相同的轻链。在一个或多个实施方式中，Fc区配对形成二硫键。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为分离的抗体或其抗原结合单元。

在一个或多个实施方式中，D为微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂或DNA拓扑异构酶抑制剂。

在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、及美登素(maytansine)类。

在一个或多个实施方式中，D为奥瑞他汀(auristatin)类，例如一甲基澳瑞他汀E(monomethylauristatinE；MMAE)、一甲基澳瑞他汀F(monomethylauristatinF；MMAF)或澳瑞他汀F(auristatinF；AF)。

在一个或多个实施方式中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康。

在一个或多个实施方式中，D为

H，

羟基，

C1-C6烷基，

被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的C1-C6烷基，

C2-C6烯基，

C2-C6炔基，

C1-C6烷氧基，

C1-C6氨基烷氧基，

卤素，

硝基，

氰基，

巯基，

烷硫基，

氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基，

在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基氨基，

连接至杂环的C1-C6烷基，所述杂环任选被一个或多个C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，

连接至杂环的C1-C6烷基氨基，所述杂环任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，

氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个C1-C6烷基取代，

杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或C1-C6烷基取代，

任选被氨基甲酰基保护基或C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，

吗啉-1-基，或

哌啶-1-基；

**为连接点；

y为0、1或2；

Y为O、S或CR

s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。

在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。

在一个或多个实施方式中，D为

在一个或多个实施方式中，X

在一个或多个实施方式中，p为2-8。

在一个或多个实施方式中，p为4-8。

在一个或多个实施方式中，p为6-8。

在一个或多个实施方式中，p为7-8。

在一个或多个实施方式中，所述抗体药物偶联物具有式I-12、I-12-1、I-13、I-13-1、I-14、I-14-1、I-15、I-15-1、I-16、I-16-1、I-17、I-17-1、I-18、I-18-1、I-19、I-19-1、I-20、I-20-1、I-21、I-21-1、I-22、I-22-1、I-23、I-23-1、I-24、I-24-1、I-25或I-25-1所示的结构或其立体异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中

Abu为抗体或其抗原结合单元；所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含(a)-(f)中的一个或多个氨基酸序列：

(a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:14所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:10所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:20所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:21所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:12所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:22所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:13所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:18所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:23所示的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元特异性结合B7-H3，并且包含：

在一个或多个实施方式中，所述取代为保守氨基酸取代。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为scFV、Fab、Fab’或F(ab)

在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述抗体具有两条序列相同的重链和两条序列相同的轻链。在一个或多个实施方式中，Fc区配对形成二硫键。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元为分离的抗体或其抗原结合单元。

在一个或多个实施方式中，p为2-8。

在一个或多个实施方式中，p为4-8。

在一个或多个实施方式中，p为6-8。

在一个或多个实施方式中，p为7-8。

一个或多个实施方式提供了药物组合物，其包含本文所述抗体或其抗原结合单元、抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物以及药物可接受的载体、赋形剂和/或辅料。在一个或多个实施方式中，所述药物组合物还包含任选的其他药物，例如其他抗癌药物。

本文所述抗体或其抗原结合单元、抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或包含其的药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，本文所述抗体或其抗原结合单元、抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或包含其的药物组合物可以静脉给药、口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。

一个或多个实施方式提供了抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其用作药物。

一个或多个实施方式提供了本文所述抗体或其抗原结合单元、抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或包含其的药物组合物在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用。在一个或多个实施方式中，所述药物还包含其他药物，例如其他抗癌药物。在一个或多个实施方式中，所述药物为抑制B7-H3活性的药物。在一个或多个实施方式中，本发明提供本文所述抗体或抗原结合单元、抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或包含其的药物组合物在治疗和/或预防疾病中的应用。一个或多个实施方式提供了治疗和/或预防疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的本文所述抗体或抗原结合单元、抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或包含其的药物组合物。

在一个或多个实施方式中，所述疾病选自肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病、传染性疾病、呼吸系统疾病、皮肤和肌肉骨骼疾病、泌尿生殖系统疾病、神经系统疾病和消化系统疾病。在一个或多个实施方式中，所述疾病为B7-H3表达异常相关的疾病。一个或多个实施方式中，所述疾病为B7-H3表达异常的肿瘤。在一个或多个实施方式中，所述疾病为B7-H3表达异常的的癌症。在一个或多个实施方式中，所述肿瘤为良性肿瘤或癌症。在一个或多个实施方式中，所述肿瘤为B7-H3表达阳性的肿瘤。所述有效量是指活性化合物或药剂的量，其导致研究人员﹑兽医﹑医生或其他临床医生正寻求的组织、系统、动物、个体以及人的生物或药用响应，这包含治疗一种疾病。

癌症的实例包括但不限于实体瘤、血液肿瘤及转移性病灶。此类癌症的实例包括但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤或白血病。此类癌症的更具体实例包括但不限于黑色素瘤、肺癌(例如，小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌)、胶质瘤(例如胶质母细胞瘤和小儿脑干胶质瘤)、前列腺癌(例如，去势抵抗性前列腺癌)、胰腺癌(例如，胰腺导管癌)、头颈癌、白血病(例如，急性髓性白血病(AML))、宫颈癌、肾癌、鳞状细胞肿瘤、鳞状细胞癌(例如鳞状肺癌或鳞状头颈癌)、结直肠癌、胃癌、肝癌、间皮瘤、肛门癌、皮肤癌、外阴癌、神经母细胞瘤、促纤维增生性小圆细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、腹膜恶性肿瘤、肉瘤、脑癌、中枢神经系统肿瘤、脑转移瘤。

在一个或多个实施方式中，可以将抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物配制成药物组合物，并以适合于所选给药途径的形式向患者给药，给药途径例如肠胃外、静脉内(iv)、肌肉内、局部或皮下。

在一个或多个实施方式中，所述抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物为本申请式I的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物的给药量为0.1mg/kg-100mg/kg；或者，0.1mg/kg-50mg/kg；或者，0.1mg/kg-10mg/kg；或者，0.6mg/kg-8.4mg/kg。在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物的给药量为约0.1mg/kg、约0.6mg/kg、约1.2mg/kg、约2.4mg/kg、约3.6mg/kg、约4.8mg/kg、约6.0mg/kg、约7.2mg/kg、约8.4mg/kg、约10mg/kg、约50mg/kg、约100mg/kg，或这些数值中任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。

在一个或多个实施方式中，所述方法包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个治疗周期。在一个或多个实施方式中，一个治疗周期为至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周或至少7周。在一个或多个实施方式中，一个治疗周期为约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。

在一个或多个实施方式中，单次给药。在一个或多个实施方式中，每2天给药1次到每6周给药1次。在一个或多个实施方式中，约1周给药2次，或约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周给药1次。在一个或多个实施方式中，每2天给药1次、每3天给药1次、每4天给药1次、每5天给药1次、每周给药2次、每周给药1次、每2周给药1次、每3周给药1次、每4周给药1次、每5周给药1次或每6周给药1次。

在一个或多个实施方式中，患者接受一个治疗周期治疗。在一个或多个实施方式中，患者接受多个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个)治疗周期治疗。在一个或多个实施方式中，患者接受治疗直至病症得到缓解而不再需要治疗。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物或包含其的药物组合物是通过注射给药。在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物或包含其的药物组合物是通过皮下(s.c.)注射、腹膜内(i.p.)注射、肠胃外注射、动脉内注射或静脉内(i.v.)注射等方式给药。在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物或包含其的药物组合物是输液方式进行给药。在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物或包含其的药物组合物是推注方式进行给药。在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物或包含其的药物组合物是通过静脉注射给药。在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物或包含其的药物组合物是通过静脉输注给药。抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物的给药量将取决于药物的性质、细胞表面触发药物的内在化、运输和释放的程度，以及所治疗的疾病和患者的状况(如年龄、性别、体重等)。

在一个或多个实施方式中，所述抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物或包含其的药物组合物是通过静脉内(i.v.)输液方式(即静脉输注)进行给药。在一个或多个实施方式中，静脉内输液持续时间为约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约81分钟、约85分钟、约87分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟，或这些数值中任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。

在一个或多个实施方式中，本发明提供了包含所述抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物的适合注射用的药物组合物，如推注型药物组合物或输液(滴注)型药物组合物。适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。在一个或多个实施方式中，药物组合物还包括药学可接受的载体。在一个或多个实施方式中，药学上可接受的载体可以包含抗细菌剂和/或抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在一个或多个实施方式中，药学上可接受的载体可以包含等渗剂，如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨醇)、氯化钠。在一个或多个实施方式中，药物组合物至少包含0.1％的抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物。百分比可以变化，并且为给定剂型重量的约2％至90％之间。这种药物组合物中的抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物的量可以为给药的有效量。

在一个或多个实施方式中，本发明提供了药物组合物的制备方法：分别将本文所述的抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物与药学上可接受的载体(例如注射用水，生理盐水等)混合。上述抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物与药学上可接受的载体的混合方法是本领域通常已知的。

在一个或多个实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，包含本文所述抗体或其抗原结合单元、抗体药物偶联物或包含其的药物组合物以及用于指导患者给药的说明书。

一个或多个实施方式提供了制品，其包含本文所述抗体或其抗原结合单元、抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或者药物组合物；

容器；和

包装插页、说明书或标签，其指示该抗体或其抗原结合单元、抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或者药物组合物用于治疗疾病，例如癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性等。

附图说明

图1显示了嵌合抗体与MDA-MB-468细胞的结合能力；其中，H1L4为对照抗体M30-H1-L4。

图2显示了嵌合抗体与Lag3-CHO细胞、VISTA-CHO细胞、Tim3-CHO细胞和Raji细胞的结合能力。

图3显示了人源化抗体与hB7-H3-Fc的结合能力；其中，H1L4表示对照抗体M30-H1-L4。

图4显示了人源化抗体与MDA-MB-468细胞的结合能力；其中，H1L4表示对照抗体M30-H1-L4。

图5显示了人源化抗体与VISTA-CHO细胞、Tim3-CHO细胞和Lag3-CHO细胞的结合能力；其中，H1L4表示对照抗体M30-H1-L4。

图6显示了ADC1的内化能力。

图7显示了ADC1的旁观者效应。

图8显示了ADC1在人源肝癌Hep3B细胞株皮下异种移植BALB/c裸鼠模型中的肿瘤抑制活性。

图9显示了ADC1在LU5215异种移植模型中各组小鼠肿瘤体积的生长曲线(平均值±标准误)。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：科学出版社科学与技术(Academic Press Dictionary of Science andTechnology)，Morris(编辑)，学术出版社(Academic Press)(第1版，1992年)；牛津生物化学和分子生物学词典(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology)，Smith等(编辑)，牛津大学出版社(Oxford University Press)，2000年修订；化学百科全书字典(Encyclopaedic Dictionary of Chemistry)，Kumar(编辑)，Anmol PublicationsPvt有限公司(2002)；微生物和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology andMolecular Biology)，Singleton等(编辑)，John Wiley和Sons(第3版，2002)；化学词典(Dictionary of Chemistry)，Hunt(编辑)，Routledge(第1版，1999)；药物医学词典(Dictionary of Pharmaceutical Medicine)，Nahler(编辑)，Springer-Verlag Telos(1994)；有机化学词典(Dictionary of Organic Chemistry)，Kumar和Anandand(编辑)，Anmol Publications Pvt.有限公司(2002)；以及生物词典(A Dictionary of Biology)(牛津平装参考，Oxford Paperback Reference)，Martin和Hine(编辑)，牛津大学出版社(Oxford University Press)(2000年第4版)。

定义

应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。

本文所用的术语“包含”或“包括”意味着抗体、组合物或方法等包括所列举的元素，例如组份或步骤，但不排除其它。“基本上由……组成”意味着抗体、组合物或方法等排除对组合的特征有根本影响的其它元素，但不排除对抗体、组合物或方法等无本质上影响的元素。“由……组成”意味着排除未特别列举的元素。

术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的氨基酸单体形成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得，它可能以包括化学合成的任何方式产生。

“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。

如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates,Sunderland 7 Mass.(1991))。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸(诸如α-、α-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸及其它非常规氨基酸也可为适用于本公开多肽的组分。非常规氨基酸的示例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酰、σ-N-甲基精氨酸及其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽表示方法中，左手方向为氨基末端方向，并且右手方向为羧基末端方向，与标准用法和惯例一致。常规(或天然)氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：Ala，一字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。

抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变化都涵盖在本公开之内，条件是氨基酸序列的同一性保持至少75％、如至少80％、90％、95％并又如99％。在一个或多个实施方式中，变化为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的取代。基因编码的氨基酸大致分以下类：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸盐、谷氨酸盐；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及(4)无电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。其它家族的氨基酸包括(i)脂肪族-羟基家族的丝氨酸和苏氨酸；(ii)含酰胺家族的天冬酰胺和谷氨酰胺；(iii)脂肪族家族的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；以及(iv)芳族家族的苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一个或多个实施方式中，保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。例如，可以合理地预测用异亮氨酸或缬氨酸单独的置换亮氨酸，用谷氨酸盐置换天冬氨酸盐，用丝氨酸置换苏氨酸，或用一个结构相关的氨基酸类似的置换一个氨基酸，且对所得分子的结合或特性不会有重要影响，特别是该置换不涉及结合位点内的氨基酸。氨基酸改变是否产生功能性肽可以容易地通过测定多肽衍生物的比活性来确定。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可由本领域普通技术人员容易地制备。

在一个或多个实施方式中，氨基酸取代具有如下效果：(1)降低对蛋白水解作用的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变用于形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改进此类类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可包括序列不同于天然存在的肽序列的各种突变蛋白。例如，可在天然存在的序列(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)中进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应当显著改变亲本序列的结构特性(例如，置换的氨基酸不应当趋于破坏亲本序列中存在的螺旋结构，或破坏表征亲本序列的其它类型二级结构)。人工识别的多肽的二级和三级结构的示例描述于Proteins,Structures and MolecularPrinciples(Creighton编辑，W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introductionto Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354:105(1991)。

VL、VH的保守氨基酸取代的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。重链恒定区、轻链恒定区、重链或轻链的保守氨基酸取代的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个、约18个、约19个、约22个、约24个、约25个、约29个、约31个、约35个、约38个、约41个、约45个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。

本发明中关于细胞、核酸、多肽、抗体等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA、RNA、多肽、抗体是指分别于细胞天然环境中的其它组分如DNA或RNA中的一种或多种所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽、抗体等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一个或多个实施方式中，分离的核酸、多肽、抗体等的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。

术语“编码”应用于多聚核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。

术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。

“同源性”、“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性或同一性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的或同一的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。“至少80％同一性”为约80％同一性、约81％同一性、约82％同一性、约83％同一性、约85％同一性、约86％同一性、约87％同一性、约88％同一性、约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约94％同一性、约95％同一性、约98％同一性、约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。“至少90％同一性”为约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约93％同一性、约95％同一性、约96％同一性、约97％同一性、约98％同一性、约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。

多聚核苷酸是由四个碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，或当多聚核苷酸是RNA时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(U)。“多聚核苷酸序列”可以以多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。

术语“多核苷酸”、“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多聚核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。

核酸或多聚核苷酸序列(或多肽或抗体序列)与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“同一性或序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用目测或本领域已知的软件程序来确定该比对和同一性百分比或序列同一性，比如Ausubel et al.eds.(2007)在Current Protocolsin Molecular Biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST，例如BLASTN和BLASTP，两者使用下列默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+Swi ssProtein+SPupdate+PIR。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同一性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。

“抗体”、“抗原结合片段”、“抗原结合单元”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。抗体、抗原结合片段和抗原结合单元包括但不局限重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)、框架区(FR)或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。CDR区包括轻链可变区的CDR区(VL CDR1-3)和重链可变区的CDR区(VH CDR1-3)。抗体或抗原结合单元可以特异性识别和结合一个或多个(如两个)抗原的多肽或多肽复合物。特异性识别和结合多个(如两个)抗原的抗体或抗原结合单元可以被称为多特异性(如双特异性)抗体或抗原结合单元。

术语“抗体片段”、“抗原结合片段”和“抗原结合单元”可互换使用。术语“抗体片段”、“抗原结合片段”或“抗原结合单元”指抗体的一部分，本发明抗体片段、抗原结合片段或抗原结合单元的组成形式可类似于单特异性抗体片段中的F(ab')

“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白。在一些方面，这些区域与约10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子通常是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。

术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。在一个或多个实施方式中，免疫球蛋白分子为IgG种类。两条重链和两条轻链通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”口开始并延续通过可变区包围重链。

本发明公开的抗体、抗原结合片段或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、全人源、人源化、灵长类化、嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段(例如类Fab、类Fab'和类F(ab')

轻链可以分为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为V

术语“恒定的”和“可变的”根据功能被使用。轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)决定了抗原识别和特异性。轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。

在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是形成抗原结合结构域的短的、非连续的与抗原特异性结合的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“框架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。框架区大部分采用β-折叠构象，CDR形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使CDR定位在正确的方位上。具有特定位置的CDR的抗原结合域形成了与抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其抗原表位的非共价结合。对于给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以通过已知方法鉴定出包含CDR和框架区的氨基酸(参见Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,Sequences ofProteins of Immunological Interest,(1983)和Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))。

如本文使用的，术语“CDR”是指在抗体可变区内的互补决定区。重链及轻链的可变区中各自存在三个CDR，针对各可变区，命名为CDR1、CDR2及CDR3(或具体地，VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3)。同一抗体的可变区的CDR的边界，根据不同的指派系统，可能有所差异。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体：其可变区序列包含本发明的CDR序列，但是由于应用了不同的方案而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。根据Kabat和Chothia定义的CDR包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的CDR都在本发明范围内。包含特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员通常可以根据抗体的可变区氨基酸序列确定出CDR包含哪些特定的残基。

如本文使用的，术语“框架”或“框架序列”是指可变区减去CDR后剩余的序列。因为CDR序列的精确限定可借由不同系统确定，所以框架序列的含义相对应地需要不同解释。六个CDR(轻链的CDR1、CDR2及CDR3及重链的CDR1、CDR2及CDR3)将轻链及重链上的框架区在各链上分成四个子区(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位于FR1与FR2之间，CDR2位于FR2与FR3之间，CDR3位于FR3与FR4之间。在不指定具体子区为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，如借由其他所提及的框架区表示单一天然产生的免疫球蛋白链的可变区内的组合的FR。如本文所用，FR表示四个子区之一，且FRs表示构成框架区的四个子区中的两者或两者以上。

人源化抗体的框架区及CDR区不必准确对应于亲本序列，例如供体抗体CDR或共有框架可通过至少一个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失而突变诱发，使得该位点的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。通常，至少80％、至少85％、更至少90％或至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR及CDR序列的那些残基。如本文使用的，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文使用的，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如，Winnaker,From Genes to Clones[从基因到克隆](Verlagsgesellschaft,Weinheim,德国1987))。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的各位置由该家族中最频繁出现于该位置的氨基酸占据。若两个氨基酸同等频繁地出现，则共有序列中可包括任一个。

在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“CDR”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences ofProteins of Immunological Interest(1983)和Chothia等在J.Mol.Biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过引用全部并入本文。

Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以不依赖于序列本身以外的其他实验数据将该“Kabat编号”系统应用到任何可变区序列。“Kabat编号”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services在“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。抗体还可以用EU或Chothia编号系统。

本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括但不限于鱼类、鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。

“重链恒定区”包括CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域，或变体或片段中的至少一种。抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方案中，重链恒定区可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方案中，部分重链可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。

“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的一部分氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链-重链对”是指可通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。

“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域。“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个恒定区。CH2结构域不与其它结构域紧密配对，而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入两个N-连接的分支碳水化合物链。CH3结构域从CH2结构域开始延伸到IgG分子的C-末端，大约包含108个残基。“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的部分重链区域。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个N端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Rouxetal.,J.Immunol 161:4083(1998))。

“二硫键”指两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸的硫醇基团可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接。

“嵌合抗体”指其可变区从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。某些实施方案中，可变区来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区来自人源。

“特异性结合”通常是指抗体或抗原结合单元与特定抗原通过其抗原结合结构域与表位互补性结合形成相对稳定的复合物。“特异性”可以用抗体或抗原结合单元与特定抗原或表位结合的相对亲和力表达。例如，如果抗体“A”比抗体“B”与同一抗原的相对亲和力大，可以认为抗体“A”比抗体“B”对该抗原具有更高的特异性。特异性结合可以用平衡解离常数(KD)来描述，较小的KD意味着较紧密的结合。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振、生物膜层光学干涉测量法等。“特异性结合”抗原a的抗体包括与抗原a平衡解离常数KD小于或等于约100nM、小于或等于约10nM、小于或等于约5nM。

“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受治疗时预期的生存期限等。需要治疗的患者包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体或药物组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的患者。

术语“癌症”意指或意在描述哺乳动物的生理状态，其典型特征是细胞生长失控。癌症的实例包括但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤或白血病。此类癌症的更具体实例包括但不限于头颈癌、肾癌、前列腺癌、肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、胃癌、肝癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、白血病(例如急性髓性白血病(AML))、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、鳞状细胞肿瘤、鳞状细胞癌(例如鳞状细胞肺癌或鳞状细胞头颈癌)、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、尿路上皮细胞癌、肛门癌、皮肤癌、间皮瘤和外阴癌。

术语“过表达”或“过表达的”可互换地指一种基因，与正常细胞相比，其通常在某些细胞，如癌细胞中以可检测到的更高水平的转录或翻译。过表达可以是蛋白质或RNA的过表达(由于增加的转录，转录后加工，翻译，翻译后加工，改变的稳定性和改变的蛋白质降解)，以及蛋白质运输模式改变导致的局部过表达(核定位增加)和增强的功能活性，例如，如增加底物的酶水解。与正常细胞或对照细胞相比，过表达可以是50％、60％、70％、80％、90％或更多。在某些实施例中，本发明的抗B7-H3抗体及抗体药物偶联物用于治疗可能过表达B7-H3的实体瘤。

如本文使用的，术语“B7-H3表达肿瘤”是指表达B7-H3蛋白的肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)。在一个实施例中，肿瘤样品中的B7-H3表达高于免疫组织的背景水平(例如用免疫组织化学染色测定)表明肿瘤是表达B7-H3的肿瘤。检测肿瘤中B7-H3表达的方法是本领域已知的，并且包括免疫组织化学测定法。相反，“B7-H3阴性肿瘤”为肿瘤样品中缺乏高于背景的B7-H3蛋白的肿瘤(例如通过免疫组织化学技术测定)。

如本文所用的，术语“给予”意指递送物质(例如，抗B7-H3抗体或ADC)以实现治疗目的(例如，治疗B7-H3相关失调)。给予方式可以是肠胃外、肠内和局部。肠胃外给予通常是通过注射，并且包括但不限于静脉、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、以及胸骨内注射和输注。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指药物，例如抗体或ADC的量，该量足以降低或改善病症(例如癌症)或其一种或多种症状的严重程度和/或持续时间；预防病症进展；引起病症消退；预防与病症相关的一种或多种症状复发、发展、发作或进展；检测病症；或增强或改善另一疗法(例如预防剂或治疗剂)的预防或治疗效果的量。例如，抗体的有效量可以抑制肿瘤生长(例如，抑制肿瘤体积的增加)；减少肿瘤生长(例如，减小肿瘤体积)；减少癌细胞的数量；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。例如，有效量可以改善无病生存(DFS)、改善总体存活(OS)或降低复发的可能性。

术语“患者”和“受试者”可互换使用，是指需要诊断、预后或治疗的任何哺乳动物，包括但不限于人类、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛等。在一些实施方案中，患者是人患者。

如本文所用，术语“有需要”是指已将患者鉴定为需要特定方法或治疗。在一些实施例中，可以通过任何诊断方式进行识别。在本文描述的任何方法和治疗中，患者可能需要。

本文所用术语“给药”是指施用一种物质以实现治疗目的(例如，治疗肿瘤)。

本文所用术语“试剂”表示化学化合物、化学化合物混合物、生物大分子或由生物材料制得的提取物。

术语“药剂”或“药物”是指适当施用于患者时能够诱导期望的治疗效果的化合物或组合物。

“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其±10％、±5％或±1％的范围。

“EC

“IC

如本文所用，术语“标记”或“经标记的”是指掺入可检测标记，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸，或者附着于可由标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可由光学方法或量热法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标记物或标记也可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下项：放射性同位素或放射性核素(例如，

术语“抗体药物偶联物”或“ADC”是指与一个或多个化学药物连接的结合蛋白(如抗体或其抗原结合单元)，其可以任选地为治疗剂或细胞毒性剂。在优选的实施例中，ADC包括抗体，药物(例如细胞毒性药物)和能够使药物与抗体附接或偶联的接头。可包含在ADC中的药物的非限制性实例是有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、用于基因治疗的载体、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢物、含硼剂、化学保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素剂、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂(例如，TEC-家族激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂)和放射增敏剂。

术语“抗体药物偶联物”和“ADC”可互换使用。术语“抗B7-H3抗体药物偶联物”和“抗B7-H3 ADC”可互换使用，是指包含特异性结合B7-H3的抗体的ADC，其中抗体与一种或多种药物偶联。在一个实施例中，抗B7-H3 ADC包含与依喜替康偶联的抗体V3。在一个或多个实施方式中，抗B7-H3抗体或ADC与B7-H3(例如人B7-H3)结合。

术语“药物抗体偶联比”或“DAR”是指ADC的与抗体附接的药物(例如，依喜替康)的数量。ADC的DAR可以在1到10的范围内，但是取决于抗体上的连接位点的数量，更高的负载(例如20)也是可能的。提及负载到单个抗体上的药物的数量时，或可替代地，提及一组ADC的平均或均值DAR时，可以使用术语DAR。在一些实施方式中，其值选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。当考虑小分子药物的平均结合个数时，即抗体的药物平均结合数，或称为平均药物抗体偶联比，其值选自约0至约10，或约2至约8。在一些实施方式中，药物抗体偶联比为约3至约6。在另一些实施方式中，药物抗体偶联比为约6至约8，或约7至约8。DAR值在本文可用p表示。

ADC的DAR值可利用紫外可见吸收光谱法(UV-Vis)、高效液相色谱-疏水色谱(HPLC-HIC)、高效液相色谱-反相色谱(RP-HPLC)、液相色谱质谱联用(LC-MS)等测定。这些技术在Ouyang,J.Methods Mol Biol,2013,1045:p.275-83中有记载。

各种取代基如下定义。在一些情况下，取代基(例如，烷基、烯基、炔基、烷氧基、氨基烷氧基、氨基烷基、氨基烷基氨基、烷基氨基、杂环基、杂环氨基、和芳基)中碳原子的数量由前缀“Cx-Cy”或“Cx-y”指示，其中x是碳原子的最小值并且y是碳原子的最大值。因此，例如，“C1-C6烷基”是指含有从1至6个碳原子的烷基。如果取代基被描述为“被……取代的”，则碳或氮上的氢原子被非氢基团取代。例如，被取代的烷基取代基是烷基取代基，其中烷基上的至少一个氢原子被非氢基团取代。用于说明，单氟烷基是被一个氟基取代的烷基，并且二氟烷基是被两个氟基取代的烷基。应该认识到，如果在取代基上存在一个以上的取代，则每个取代可以是相同的或不同的(除非另有说明)。如果取代基被描述为“任选被……取代”，则取代基可以是(1)未被取代的或(2)被取代的。可能的取代基包括但不限于羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6氨基烷氧基、卤素、硝基、氰基、巯基、烷硫基、氨基、C1-C6氨基烷基、C1-C6氨基烷基氨基、连接至杂环的C1-C6烷基、连接至杂环的C1-C6烷基氨基、杂环基、氨基取代的杂环基、杂环氨基、氨基甲酰基、吗啉-1-基、哌啶-1-基、-(CH

“烷基”指饱和脂肪族烃基基团，该术语包括直链和支链烃基。例如，C1-C20烷基，如C1-C6烷基。C1-C20烷基指具有1至20个碳原子的烷基，例如具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子、6个碳原子、7个碳原子、8个碳原子、9个碳原子、10个碳原子、11个碳原子、12个碳原子、13个碳原子、14个碳原子、15个碳原子、16个碳原子、17个碳原子、18个碳原子、19个碳原子或20个碳原子的烷基。烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基等。所述烷基可以是非取代的或被一个或多个取代基所取代，所述取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羟基、羰基、羧基、芳基、杂芳基、胺基、卤素、磺酰基、亚磺酰基、膦酰基等。

术语“烯基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链、直-链或环状烷基，双键通过从母体烯烃的单个碳原子上除去一个氢原子而得到。典型的烯基包括但不限于乙烯基；丙烯基(如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、丙-2-烯-2-基、环丙-1-烯-1-基)；环丙-2-烯-1-基；丁烯基(如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基、环丁-1-烯-1-基、环丁-1-烯-3-基、环丁-1,3-二烯-1-基等)等。

术语“炔基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链、直-链或环状烷基，三键通过从母体炔烃的单个碳原子上除去一个氢原子而得到。典型的炔基包括但不限于乙炔基；丙炔基(如丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等)；丁炔基(如丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等)等。

“碳环基”是指仅仅由碳和氢原子组成的稳定的非芳香族的单环或多环的烃自由基，其可包括稠合或桥接环系统，具有3至15个碳原子，例如具有3至10个(例如3、4、5、6、7、8、9或10个)碳原子，并且其是饱和的或不饱和的并且通过单键与分子的剩余部分连接。单环自由基包括，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环自由基包括，例如金刚烷基、降冰片基、十氢萘基等。当在说明书中具体说明时，碳环基可被独立地选自下列中的一种或多种取代基任选取代：烷基、卤素、卤代烷基、氰基、硝基、氧代、芳基、芳烷基、碳环基、碳环基烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基、杂芳基烷基。

“芳基”指具有完全共轭的π电子体系的全碳单环或全碳稠合环，通常具有5-14个碳原子，例如，6个、10个、12个、14个碳原子。芳基可以是非取代的，或被一个或多个取代基所取代，所述取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羟基、羧基、芳基、芳烷基、胺基、卤素、磺酰基、亚磺酰基、膦酰基。非取代的芳基实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。

“杂环基”是指稳定的3元至18元芳香性或非芳香性环取代基，其由2至8个(例如2、3、4、5、6、7或8个)碳原子和选自氮、氧和硫中的1至6个(1、2、3、4、5或6个)杂原子组成。除非在说明书中另外具体说明，杂环基可以是单环、双环、三环或四环环系统，其可以包括稠合或桥接环系统；且杂环基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子任选地被季铵化；且杂环基可以部分或完全饱和。此类杂环基的实例包括但不限于，二氧戊环基、二噁英基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、哌咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、1,2,4-亚噻二唑-5(4H)-基、四氢呋喃基、三氧杂环己基、三噻烷基、三嗪烷基(triazinanyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫代吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。当在说明书中具体说明时，杂环基可以被选自下列中的一个或多个取代基任选取代：烷基、烯基、卤素、卤代烷基、氰基、氧代、硫代(thioxo)、硝基、芳基、芳烷基、环烃基、环烃基烷基、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基。

“烷氧基”是指式-O-(烷基)，其中烷基为本文定义的烷基。烷氧基的非限制性列举为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。烷氧基可为取代的或未取代的。

“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、或碘(I)。

“氨基”指-NH

“氰基”，是指-CN。

“硝基”指-NO

“羟基”，是指-OH。

“羧基”，是指-COOH。

“巯基”是指-SH。

“羰基”是指C＝O。

药学上可接受的盐包括抗体或其抗原结合单元或抗体药物偶联物与该技术领域众所周知的各种各样的有机和无机抗衡离子产生的药学上可接受的盐，仅仅示例性盐包括，当分子含有酸性官能团时，有机或无机盐如锂盐、钠盐﹑钾盐﹑钙盐﹑镁盐﹑铵盐﹑异丙胺﹑三甲胺﹑二乙胺基﹑三乙胺﹑三丙胺、乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲葡糖胺、可可碱、嘌呤哌嗪、哌啶、N-乙基、哌啶、多胺树脂及四烷基铵盐等；以及当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、马来酸盐和草酸盐。酸的其它非限制例子包括硫酸、硝酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸水杨酸等。溶剂合物包括水合物。这些盐通常可以通过常规方法通过使例如适当的酸或碱与本发明ADC反应来制备。

本文中的其它化学术语根据本领域的常规用法使用，如The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(《麦格劳-希尔化学术语词典》)(Parker,S.编，格劳-希尔公司(McGraw-Hill)，旧金山(1985))。

本文中引用的所有出版物，专利，和专利申请全部内容通过参考并入本文用于所有目的。

抗B7-H3抗体

本发明提供了抗B7-H3抗体或其抗原结合单元。在一个或多个实施方式中，本发明提供了抗B7-H3鼠抗体或其抗原结合单元。在一个或多个实施方式中，本发明提供了抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元。在一个或多个实施方式中，本发明提供了人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元。本发明的抗B7-H3抗体或其抗原结合单元具有以下至少一种特性：与B7-H3(例如人B7-H3)结合，与表达B7-H3的细胞结合，强的内化能力，减少或抑制癌细胞或肿瘤生长。

本发明的抗B7-H3抗体的抗原结合部分可以与本文所述的药物偶联。因此，在一个或多个实施方式中，本文所述的抗B7-H3抗体或抗原结合片段通过接头与药物偶联，这也在本发明的范围内。

在一个或多个实施方式中，抗B7-H3抗体的抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')

在一个或多个实施方式中，抗原结合片段如Fab、F(ab’)

在一个或多个实施方式中，抗体包含重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。在一个或多个实施方式中，抗B7-H3抗体或抗原结合单元包含选自人IgG恒定结构域、人IgA恒定结构域、人IgE恒定结构域、人IgM恒定结构域和人IgD恒定结构域的免疫球蛋白重链恒定结构域。在一个或多个实施方式中，抗B7-H3抗体或抗原结合单元包含IgG1重链恒定区、IgG2重链恒定区、IgG3重链恒定区或IgG4重链恒定区。在一个或多个实施方式中，重链恒定区为IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。在一个或多个实施方式中，抗体或抗原结合单元包含轻链恒定区，例如κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。在一个或多个实施方式中，抗体或抗原结合单元包含κ轻链恒定区。

抗体的Fc部分介导若干种重要的效应功能(例如，细胞因子诱导、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、补体依赖的细胞毒性(CDC)和抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率)。在一些情况下，这些效应功能为治疗性抗体所需的，但在其他情况下，视治疗目标而定，可能为不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，尤其IgG1及IgG3，分别经由结合至FcγRs及补体C1q来介导ADCC及CDC。新生的Fc受体(FcRn)为决定抗体的循环半衰期的关键组分。在另一些实施方案中，抗体恒定区(例如抗体的Fc区)中的至少一个氨基酸残基发生置换，使得抗体的效应功能更改。抗体的Fc区中的氨基酸残基的替换以改变抗体效应功能在美国专利号5,648,260和5,624,821中有所描述，其通过引入并入本文。

在一个或多个实施方式中，本发明包括标记的抗B7-H3抗体或抗原结合单元，其中抗体衍生或连接于一种或多种功能分子(例如，另一种肽或蛋白质)。例如，经标记抗体可以通过将本发明抗体或抗原结合单元(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或以其他方式)功能上连接至一种或多种其他分子实体来衍生，该一种或多种其他分子实体诸如另一种抗体(例如双特异性抗体或双功能抗体)、可检测试剂、药物制剂、可以介导抗体或抗原结合单元与另一种分子(诸如抗生蛋白链菌素核心区或多聚组氨酸标签)的结合的蛋白质或肽和/或选自由以下组成的组的细胞毒性剂或治疗剂：有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、基因治疗用载体、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢产物、含硼剂、化学保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素剂、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂、放射增敏剂及其组合。

在一个或多个实施方式中，将本发明抗体或抗原结合单元连接至可检测试剂，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸，或者附着于可由标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可由光学方法或量热法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标记物或标记也可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下项：放射性同位素或放射性核素(例如，

在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元可用作检测样品中B7-H3(例如人B7-H3)或其片段是否存在。在一个或多个实施方式中，抗体包含可检测试剂。抗体为多克隆抗体，或更优选单克隆抗体。可使用完整的抗体或抗原结合单元(例如Fab、scFv或F(ab')

本文公开的抗B7-H3抗体可以为单克隆抗体。

本发明公开的抗体或其抗原结合单元的结合特异性可以通过体外实验，例如免疫共沉淀、放射免疫实验(RIA)、表面等离子共振、流式细胞术(Facs)或酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测。

本发明还包括与本文所述抗B7-H3抗体结合同一表位的抗体。例如，本发明的抗体特异性结合包括人B7-H3上一个或多个氨基酸残基的表位。

下面提供了一种示例性人B7-H3的氨基酸序列SEQ ID NO:44(GenBank登录号NP_001019907.1，其通过引用纳入本文)。信号序列(氨基酸1-28)用下划线+斜体表示。

SEQ ID NO:44：

1)抗B7-H3鼠抗体

本发明示例性抗B7-H3鼠抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性；轻链可变区包含如SEQ ID NO:25-29中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25-29中任一项所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。在一个或多个实施方式中，这些具有合适的序列同一性的氨基酸序列至少CDR不变。

2)抗B7-H3嵌合抗体

在一个或多个实施方式中，本发明提供抗B7-H3鼠抗体的可变区与人免疫球蛋白恒定区相连的抗B7-H3嵌合抗体。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。在一个或多个实施方式中，这些有序列同一性的氨基酸序列至少CDR不变。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:25-29中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:25-29中任一项所示的氨基酸序列具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。在一个或多个实施方式中，这些有序列同一性的氨基酸序列至少CDR不变。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3抗体或其抗原结合单元包含如SEQID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元包含：重链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的VH CDR1；(b)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(c)如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的VH CDR3；和轻链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的VL CDR1；(b)如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(c)如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元包含：重链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的VH CDR1；(b)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(c)如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的VH CDR3；和轻链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的VL CDR1；(b)如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(c)如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元包含：重链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的VH CDR1；(b)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(c)如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的VH CDR3；和轻链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的VL CDR1；(b)如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(c)如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元包含：重链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的VH CDR1；(b)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(c)如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的VH CDR3；和轻链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VL CDR1；(b)如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(c)如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元包含：重链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的VH CDR1；(b)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(c)如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的VH CDR3；和轻链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的VL CDR1；(b)如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(c)如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元还包含重链恒定区，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:32或33所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:32或33所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。

在一个或多个实施方式中，本发明抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元的重链还包含信号肽，例如MEFGLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:45)或MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ IDNO:46)。在一个或多个实施方式中，本发明抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元的轻链还包含信号肽，例如MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:47)或MVLQTQVFISLLLWISGAYG(SEQID NO:48)。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元与B7-H3结合的结合解离平衡常数(KD)为约1μM或更低。在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元与B7-H3结合的KD在约1μM至约1pM之间。在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元与B7-H3结合的KD在约100nM至约1pM之间。在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元与B7-H3结合的KD在约10nM至约1pM之间。在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元与B7-H3结合的KD在约1nM至约0.1nM之间。

在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元与hB7-H3-His(如SEQ ID NO:4所示)结合的KD为约1μM或更低。在一个或多个实施方式中，本发明的抗B7-H3嵌合抗体或其抗原结合单元与hB7-H3-His(如SEQ ID NO:4所示)结合的KD在约1μM至约1pM之间；或者，在约100nM至约1pM之间；或者，在约10nM至约1pM之间；或者，在约1nM至约1pM之间；或者，在约1nM至约0.1nM之间；或者，在约0.5nM至约0.3nM之间。

本文公开的鼠抗体或嵌合抗体可用于产生人源化抗B7-H3抗体。例如，选择嵌合抗体M1用于人源化。

3)人源化抗B7-H3抗体

本文所述抗体包括人源化抗体。这些抗体适用于给动物(例如人类)施用，而不会在待治疗的动物(例如人类)中引起有害的免疫应答。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元，其包含：重链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的VH CDR1；(b)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(c)如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的VH CDR3；和轻链可变区，包含(a)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的VL CDR1；(b)如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(c)如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元，其重链可变区包含如SEQ ID NO:35-38中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:35-38中任一项所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性；和/或其轻链可变区包含如SEQ ID NO:39-41中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:39-41中任一项所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。在一个或多个实施方式中，这些有序列同一性的氨基酸序列至少CDR不变。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元还包含重链恒定区，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:32或33所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:32或33所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元的重链还包含信号肽，例如MEFGLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:45)或MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQID NO:46)。在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元的轻链还包含信号肽，例如MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:47)或MVLQTQVFISLLLWISGAYG(SEQ ID NO:48)。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元与B7-H3结合的结合解离平衡常数(KD)为约1μM或更低。在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元与B7-H3结合的KD在约1μM至约1pM之间。在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元与B7-H3结合的KD在约100nM至约1pM之间。在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元与B7-H3结合的KD在约10nM至约1pM之间。在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元与B7-H3结合的KD在约1nM至约0.1nM之间。

在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元与hB7-H3-His(如SEQ ID NO:4所示)结合的KD为约1μM或更低。在一个或多个实施方式中，本发明的人源化抗B7-H3抗体或其抗原结合单元与hB7-H3-His(如SEQ ID NO:4所示)结合的KD在约1μM至约1pM之间；或者，在约100nM至约1pM之间；或者，在约10nM至约1pM之间；或者，在约1nM至约1pM之间；或者，在约1nM至约0.1nM之间；或者，在约0.5nM至约0.3nM之间。

抗B7-H3抗体药物偶联物

本发明的抗B7-H3抗体或其抗原结合单元可以与药物偶联形成抗B7-H3抗体药物偶联物(抗B7-H3 ADC)。在一个或多个实施方式中，本发明提供抗体药物偶联物(ADC)，其包含本文所述抗B7-H3抗体或抗原结合单元和至少一种药物(例如依喜替康)。本发明的ADC具有以下至少一种特性：与B7-H3(例如人B7-H3)结合，与表达B7-H3的细胞结合，强的内化能力，减少或抑制癌细胞或肿瘤生长。

在一个或多个实施方式中，本发明提供抗B7-H3抗体药物偶联物(抗B7-H3 ADC)，其包含通过接头与药物(例如依喜替康)偶联的本文所述抗B7-H3抗体或抗原结合单元。本文所述的抗B7-H3抗体或抗原结合单元为ADC提供了结合B7-H3的能力，使得附着于抗体的药物可以被递送至表达B7-H3的细胞，特别是表达B7-H3的癌细胞。

由于抗体药物偶联物(ADC)能够选择性地将一种或多种药物递送至靶组织(例如，表达B7-H3的肿瘤)，抗体药物偶联物(ADC)可以增加抗体在治疗疾病(例如癌症)中的治疗功效。因此，在一个或多个实施方式中，本发明提供了抗B7-H3 ADC在治疗疾病中的用途(例如，治疗癌症)。

本发明的抗B7-H3 ADC包含抗B7-H3抗体或其抗原结合单元，即与一个或多个药物连接的特异性结合B7-H3(例如人B7-H3)的抗体或其抗原结合单元。ADC的特异性可以由抗体(例如抗B7-H3抗体)的特异性决定。在一个或多个实施方式中，抗B7-H3抗体与一种或多种药物(例如DNA拓扑异构酶抑制剂)连接，所述药物(例如DNA拓扑异构酶抑制剂)被递送至表达B7-H3的癌细胞。

以下提供可以与抗B7-H3抗体或其抗原结合单元偶联的药物以及偶联抗体和药物的接头的示例。

在一个或多个实施方式中，ADC为结构如式I所示的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中

Abu为本文所述特异性结合B7-H3的抗体或其抗原结合单元，

D为抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；

M为

B为

L为-(AA)

G为

p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一个或多个实施方式中，Abu的实例包括但不限于抗体M1、M2、M3、M4、M5、V1、V2、V3、V4或V5。

在一个或多个实施方式中，ADC为ADC1或ADC3或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

治疗方法

本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC能够在体内和体外中和B7-H3(例如人B7-H3)活性。因此，本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC可用于抑制B7-H3活性，例如在含有B7-H3的细胞培养物中，在人患者或具有本发明的抗体与之交叉反应的B7-H3的其他哺乳动物中。在一个实施例中，本发明提供抑制B7-H3活性的方法，其包括使B7-H3与本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC接触，从而抑制B7-H3活性。例如，在含有或怀疑含有B7-H3的细胞培养物中，可以将本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC添加到培养基中以抑制培养物中的B7-H3活性。

在一个或多个实施方式中，提供用于降低患者中B7-H3活性的方法，所述患者来自患有B7-H3活性有害的疾病或病症的患者。本发明提供用于降低经受此类疾病或病症的患者中的B7-H3活性的方法，该方法包括向患者给予有效剂量的本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC，使得患者中的B7-H3活性降低。在一个或多个实施方式中，B7-H3是人B7-H3，并且患者是人患者。或者，患者可以是表达本发明的抗体能够结合的B7-H3的哺乳动物。此外，患者可以是已经引入B7-H3的哺乳动物(例如，通过给予B7-H3或通过表达B7-H3转基因)。可以将本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC出于治疗目的给予人患者。此外，本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC可以给予表达B7-H3的非人哺乳动物(出于兽医学目的或作为人类疾病的动物模型)。所述人类疾病的动物模型可用于评估本发明抗体或其抗原结合单元或ADC的治疗功效(例如，剂量测试和给药时间过程)。

在一个或多个实施方式中，提供了用于预防、治疗或改善各种类型的肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)等相关疾病的方法，所述方法包括向患者施用有效量的所述抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，提供了所述抗体或其抗原结合单元或ADC在用于预防、治疗或改善肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)等相关疾病中的应用。在一个或多个实施方式中，提供了所述抗体或其抗原结合单元或ADC在制备用于预防、治疗或改善肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)等相关疾病的药物中的应用。在一个或多个实施方式中，肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)是表达B7-H3的肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)。在一个或多个实施方式中，肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)是过表达B7-H3的肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)。用于鉴定表达B7-H3的肿瘤(例如，过表达B7-H3的肿瘤)的方法是本领域已知的。例如，通过免疫组织化学法检测B7-H3在正常和肿瘤组织中的表达。

在一个或多个实施方式中，本发明涉及治疗以B7-H3为治疗靶点的相关疾病的方法，从而改善、减缓、抑制、治疗或预防B7-H3表达异常(例如，B7-H3过表达)相关的任何疾病或病症；涉及提供治疗患者肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)的方法、缓解患者肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)症状的方法、避免患者肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)复发的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本文所述的任何抗体或其抗原结合单元或ADC。

本发明提供的抗体或其抗原结合单元或ADC和包含其的药物组合物可以用作治疗剂，用于诊断、预后、监控、治疗、缓解和/或预防患者中异常B7-H3的表达、活性和/或信号传递相关的疾病和病症。通过使用标准方法鉴定患者中存在异常B7-H3的表达、活性和/或信号传递相关的疾病和病症时，可以给药本发明公开的抗体或其抗原结合单元或ADC和包含其的药物组合物。

在一个或多个实施方式中，用本发明所述的抗体或其抗原结合单元或ADC治疗和/或预防的癌症包括但不限于实体瘤、血液肿瘤及转移性病灶。癌症的实例包括但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤或白血病。此类癌症的更具体实例包括但不限于黑色素瘤、肺癌(例如，小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌)、胶质瘤(例如胶质母细胞瘤、小儿脑干胶质瘤)、前列腺癌(例如，去势抵抗性前列腺癌)、胰腺癌(例如，胰腺导管癌)、头颈癌、白血病(例如，急性髓性白血病(AML))、宫颈癌、肾癌、鳞状细胞肿瘤、鳞状细胞癌(例如鳞状肺癌或鳞状头颈癌)、结直肠癌、胃癌、肝癌、间皮瘤、肛门癌、皮肤癌、外阴癌、神经母细胞瘤、促纤维增生性小圆细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、腹膜恶性肿瘤、肉瘤、脑癌、中枢神经系统肿瘤、脑转移瘤。在一个或多个实施方式中，将本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC给予患有一种或多种肿瘤(包括良性肿瘤或癌症)的患者，该患者过表达B7-H3。在一个或多个实施方式中，将本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC给予患有实体瘤的患者，该患者可能过表达B7-H3。在一个或多个实施方式中，向患有鳞状细胞非小细胞肺癌(NSCLC)的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有实体瘤(包括晚期实体瘤)的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有前列腺癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有非小细胞肺癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有胶质母细胞瘤的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有结肠癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有头颈癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有肾癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有透明细胞肾细胞癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有胶质瘤的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有黑色素瘤的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有胰腺癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有胃癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有卵巢癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有宫颈癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有结肠直肠癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有小细胞肺癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有下咽鳞状细胞癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有神经母细胞瘤的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有乳腺癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有子宫内膜癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有尿路上皮细胞癌的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。在一个或多个实施方式中，向患有急性髓性白血病(AML)的患者给予本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC。

对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定抗体或衍生物(例如ADC)、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及所需的效果。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。在一个或多个实施方式中，有效剂量的范围为从约0.1mg/kg到约100mg/kg，给药频率可以例如是每月给药一次，每两周给药一次，每三周给药一次，每三周给药两次，每四周给药三次，每周给药一次，每周给药两次等。例如，给药方式可以是静脉输注，静脉推注，也可以是皮下注射、肌肉注射等。应注意，剂量值可随欲缓解的病状的类型及严重程度变化。此外应了解，对任何特定患者而言，特定给药方案可根据患者需要及给予组合物或监督组合物给予的人员的专业判断而随时调整，且本文所阐述的剂量范围仅为例示性的，且不意欲限制所要求的组合物的范畴或实践。

抗体或其抗原结合单元或ADC的施用方法包括但不限于真皮内、肌肉、腹腔、静脉、皮下、鼻腔、硬脊膜外和口服。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，含有本发明抗体的药物组合物可以口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或鼻腔喷雾给药。

本发明使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。

施用方式可以是全身施用或局部施用。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管连接到如贮液囊(可以是Ommaya贮液囊)来辅助注射。也可以通过肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及使用雾化的制剂。

本发明抗体或其抗原结合单元或ADC可以局部施用于需要治疗的区域；可以通过但不限于以下方式：手术期间局部输注，例如与手术后伤口敷料联合的局部应用，通过注射，通过导管，借助栓剂或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。优选地，当施用本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。

通常在进行体外测试用于治疗疾病的方法，包括施用本发明所述抗体或ADC，然后在可接受的动物模型中体内测试期望的治疗性或预防性活性，最后施用于人体。合适的动物模型(包括转基因动物)是本领域普通技术人员所公知的。例如，用于证明本发明所述抗体或其抗原结合单元或ADC的治疗用途的体外测定包括抗体或其抗原结合单元或ADC对细胞系或患者组织样品的影响。抗体或其抗原结合单元或ADC对细胞系和/或组织样品的作用可以利用本领域技术人员已知的技术进行检测，例如本发明其他部分公开的技术。根据本发明的内容，可用于确定是否施用抗体或其抗原结合单元或ADC的体外测定实验包括体外细胞培养实验，其中患者组织样品在培养物中培养，并暴露于或以其他方式施用抗体或其抗原结合单元或ADC，并观察这种抗体或其抗原结合单元或ADC对组织样品的影响。

各种已知输送系统可用于施用本发明抗体或其抗原结合单元或编码其的多核苷酸或ADC，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。

联合疗法

在一个或多个实施方式中，本发明抗体或其抗原结合单元或ADC可以结合其它治疗或预防方案，包括施用一种或多种本发明抗体或其抗原结合单元或ADC以及一种或多种其它治疗剂或方法一起使用或组合使用。对于组合治疗，抗体或其抗原结合单元或ADC可以与其它治疗剂可同时或分开施用。当分开施用时，可以在施用另一种其它治疗剂之前或之后施用本发明抗体或其抗原结合单元或ADC。

在一个或多个实施方式中，在向患者施用本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC时，还可以向患者联合施用本文公开的抗体或其抗原结合单元或ADC或药物组合物，以及一种或多种其它疗法，例如治疗方式和/或其它制剂(例如治疗剂)。

此类联合疗法涵盖同时施用(其中两种或更多种制剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的疗法，例如治疗方式和/或治疗剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体或其抗原结合单元或ADC的施用。抗体或其抗原结合单元或ADC和/或其他疗法，例如治疗剂或治疗方式可以在活动性疾病期间或在缓解或活动度更小的疾病期间施用。抗体或其抗原结合单元或ADC可以在其他治疗前、与其他治疗同时、治疗后或在疾病缓解期间施用。

在一个或多个实施方式中，本发明抗体或其抗原结合单元或ADC与治疗剂联合施用。治疗剂包括但不限于：细胞因子及生长因子抑制剂、免疫抑制剂、消炎剂(例如全身性消炎剂)、抗纤维化剂、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒性或细胞生长抑制剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、基因治疗运载体、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢物、含硼剂、化学保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素剂、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂或放射增敏剂。

在一个或多个实施方式中，本发明抗体或其抗原结合单元或ADC与抗癌剂或抗肿瘤剂联合施用。术语“抗癌剂”和“抗肿瘤剂”是指用于治疗恶性肿瘤的药物，例如抑制癌性生长。例如，乳腺癌通常由雌激素刺激，并且可以用使性激素失活的药物治疗。类似地，前列腺癌可以用使雄激素失活的药物治疗。抗癌剂的实例包括但不限于：抗PD1抗体(例如，派立珠单抗)、抗PD-L1抗体(例如阿特唑单抗)、抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗)、MEK抑制剂(例如，曲美替尼)、ERK抑制剂、BRAF抑制剂(例如，达拉菲尼)、奥斯替尼、埃罗替尼、吉非替尼、索拉非尼、CDK9抑制剂(例如，迪那西利)、MCL-1抑制剂、替莫唑胺、Bcl-xL抑制剂、Bcl-2抑制剂(例如维奈托克)、依鲁替尼、mTOR抑制剂(例如，依维莫司)、PI3K抑制剂(例如，布帕利昔)、度维利塞、艾代拉里斯、AKT抑制剂、HER2抑制剂(例如，拉帕替尼)、Herceptin、紫杉烷(例如多西他赛、紫杉醇、纳米白蛋白结合型紫杉醇)、包含澳瑞他汀的ADC、包含PBD(例如，罗武匹妥珠-特西林)的ADC、包含美登木素生物碱(例如，TDM1)的ADC、TRAIL激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)、烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂、Panorex、利妥昔单抗、吉妥单抗、阿仑单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、西妥昔单抗、阿瓦斯汀和赫塞汀。

可以与本发明抗体或其抗原结合单元或ADC联合施用的细胞因子的实例包括但不限于以下一种或多种：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21和IL-31等。

可以与本发明抗体或其抗原结合单元或ADC联合施用的其他治疗剂的实例包括但不限于以下一种或多种：吸入性类固醇；β-激动剂，例如，短效或长效β-激动剂；白三烯或白三烯受体的拮抗剂；组合药物，如ADVAIR；IgE抑制剂，例如，抗IgE抗体(例如，奥马珠单抗)；磷酸二酯酶抑制剂(例如，PDE4抑制剂)；黄嘌呤；抗胆碱能药物；肥大细胞稳定剂，如色甘酸；IL-4抑制剂；IL-5抑制剂；嗜酸性粒细胞趋化因子/CCR3抑制剂；组胺或其受体(包括H1、H2、H3和H4)的拮抗剂，以及前列腺素D或其受体(DP1和CRTH2)的拮抗剂；抗PD1抗体(例如，派立珠单抗)、抗PD-L1抗体(例如阿特唑单抗)、抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗)、MEK抑制剂(例如，曲美替尼)、ERK抑制剂、BRAF抑制剂(例如，达拉菲尼)、奥斯替尼、埃罗替尼、吉非替尼、索拉非尼、CDK9抑制剂(例如，迪那西利)、MCL-1抑制剂、替莫唑胺、Bcl-xL抑制剂、Bcl-2抑制剂(例如维奈托克)、依鲁替尼、mTOR抑制剂(例如，依维莫司)、PI3K抑制剂(例如，布帕利昔)、度维利塞、艾代拉里斯、AKT抑制剂、HER2抑制剂(例如，拉帕替尼)、Herceptin、紫杉烷(例如多西他赛、紫杉醇、纳米白蛋白结合型紫杉醇)、包含澳瑞他汀的ADC、包含的PBD(例如，罗武匹妥珠-特西林)的ADC、包含美登木素生物碱(例如，TDM1)的ADC、TRAIL激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)、和烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)抑制剂；TNF拮抗剂(例如，TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kD TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL))；TNF酶拮抗剂，例如TNF转化酶抑制剂；毒蕈碱受体拮抗剂；TGF-β拮抗剂；干扰素γ；吡非尼酮；化学治疗剂，例如来氟米特或西罗莫司或其类似物，例如CCI-779；COX2和cPLA2抑制剂；NSAID；免疫调节剂；p38抑制剂，TPL-2、MK-2和NFkB抑制剂等。

在一个或多个实施方式中，本发明抗体或其抗原结合单元或ADC可以与免疫检查点抑制剂一起使用。在一个或多个实施方式中，本发明抗体或其抗原结合单元或ADC与其它治疗或预防方案联合施用，例如放射性疗法。

药物组合物

可将本文所述抗体或ADC掺入适于施用的药物组合物中。制备此类组合物所涉及的原理和考虑事项以及选择组分的指南在本领域中是熟知的，例如参见Remington'sPharmaceutical Sciences:The Science And Practice Of Pharmacy,第19版,MackPub.Co.,Easton,Pa.:1995；Drug Absorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,Harwood Academic Publishers,Langhorne,Pa.,1994；PeptideAnd Protein Drug Delivery,Advances In Parenteral Sciences,第4卷,1991,M.Dekker,New York。

此类组合物通常包含抗体或其抗原结合单元或ADC和药学上可接受的载体。在一个或多个实施方式中，使用抗原结合片段为与靶蛋白结合结构域特异性结合的最小抑制片段。如，基于抗体的可变区序列并保留结合靶蛋白质序列能力的肽。在一个或多个实施方式中，药物组合物还包含抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。

在一个或多个实施方式中，术语“药学上可接受的”是指由政府的监管机构批准的或公认药典中列出的用于动物，特别是用于人类的物质。此外，“药学上可接受的载体”通常指是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂等。

术语“载体”是指可以与活性成分一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington's PharmaceuticalSciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或其抗原结合单元或ADC，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。亲本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

在一个或多个实施方式中，根据常规步骤将抗体或其抗原结合单元或ADC配制成药物组合物(例如，适合静脉内注射于人体的药物组合物)。用于静脉内给药的组合物通常是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。药物组合物以剂量单位形式配制，易于施用，剂量均匀。如本文所用，剂量单位形式是指用于待治疗的患者，适合作为单位剂量的物理上可分离的单位；每个单位含有经计算与所需药物载体结合产生期望治疗效果的预定量的一种或多种所述抗体。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有药用级无菌水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。

在一个或多个实施方式中，待用于体内施用的药物组合物为无菌的。这可通过无菌滤膜过滤容易地实现。

药物组合物通常与其预期施用途径相容。给药途径的示例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部的)、经粘膜和直肠给药。药物组合物可包括以下组分中的一种或多种：注射用无菌稀释剂，例如水、盐溶液、固定油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抑菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如组氨酸盐酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；渗透压调节剂，例如氯化钠或右旋糖；稳定剂，例如精氨酸、甲硫氨酸、海藻糖、蔗糖、山梨醇；表面活性剂，例如吐温20、吐温80。pH可用酸或碱进行调节，例如盐酸或氢氧化钠。可将药物组合物包装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制多剂量小瓶内。在一个或多个实施方式中，适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。使用时，组合物必须是无菌的并且应当为流动性达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须能防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。注射用组合物的延长吸收可通过在所述组合物中包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。

对于经粘膜或透皮给药，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域是通常所知的，并且包括如用于经粘膜给药的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用喷鼻剂或栓剂来实现。对于透皮给药，可将一种或多种所述抗体配制成如本领域通常所知的膏剂、软膏、凝胶、或霜膏。

所述药物组合物可放于容器或分配器中，并与给药说明书一起包装。

本文所述药物组合物还可根据要治疗的具体情况而包含其它活性成分，优选具有互补活性但对彼此无负面影响的那些。在一个或多个实施方式中，组合物可包含增强其功能的试剂，诸如细胞毒素试剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类活性成分以对预期目的有效的量适当地联合存在。

本发明的组合物可以配制成中性的或盐的形式。

制备方法

抗B7-H3抗体可以通过用如膜结合的和/或可溶的B7-H3(例如，人B7-H3或其免疫原性片段、衍生物或变体)免疫动物来产生。或者可使用例如杂交瘤方法来制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，以引起淋巴细胞产生或能产生特异性结合免疫剂的抗体。另选地，可将淋巴细胞在体外免疫产生抗体。

杂交瘤方法中所用免疫剂通常包括蛋白抗原、其片段、或其融合蛋白(例如hB7-H3-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)。通常，如果需要人源细胞，则使用外周血淋巴细胞，或者如果需要非人哺乳动物源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后用适合的融合剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)第59-103页)。永生化细胞系通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在适当的培养基中培养，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)，所述物质防止HGPRT-缺陷的细胞生长。

单克隆抗体还可通过重组DNA方法制备，例如美国专利No.4,816,567中所述的那些。编码本文所述单克隆抗体的DNA可使用常规方法来分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可充当此类DNA的来源。一旦分离后，可以将DNA置入表达载体中，然后将其转染到宿主细胞例如不另外产生免疫球蛋白的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(例如CHO-K1细胞)、人胚胎肾293细胞(HEK293细胞)、猿COS细胞、PER.NS0细胞、SP2/0细胞、YB2/0细胞、或骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。DNA也可通过例如用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(参见美国专利No.4,816,567；Morrison,Nature 368,812-13(1994))或者通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价地连接进行修饰。此类非免疫球蛋白多肽能够取代本文所述抗体的恒定结构域，或者能够取代本文所述抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。

单链Fv(scFv)可参见生产单链单元的技术(美国专利4,694,778)。通过氨基酸桥接Fv区的重链和轻链片段形成单链单元，产生单链融合肽。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra et al.,Science 242:1038-1041(1988))。

可用于生产scFv和抗体的技术的实例包括如美国专利4,946,778和5,258,498中所述。

此外，在美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096中公开了另一种生产重组抗体的高效方法，特别地，该技术能产生含有猴可变区和人恒定区序列的灵长类抗体，每个专利的全部内容通过引用并入本文。

在一个或多个实施方式中，抗体不会在受治疗的动物(例如人类)中引起有害的免疫应答。在一些实施方案中，本发明公开的抗体、抗原结合片段、或衍生物使用本领域公认的技术修饰以降低其免疫原性。例如，抗体可以被人源化、灵长类化、去免疫化或者可以制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人抗体，通常是鼠类或灵长类抗体，其保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性但在人体中免疫原性较低。其可以通过多种方法来实现，包括(a)将整个非人源的可变区移植到人源的恒定区以产生嵌合抗体；生产嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见美国专利5,807,715、4,816,567和4,816,397，其全部内容通过引用并入本文；(b)将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一部分移植到人源的框架和恒定区中，保留或不保留关键的框架残基；或(c)移植整个非人源的可变区，但通过用类人源的部分置换表面残基从而“隐藏”它们。通常人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，比如能够改善抗原结合的残基。这些框架替换可以通过本领域公知的方法鉴定，例如通过模拟CDR和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合起重要作用的框架残基和通过序列对比以鉴定特定位置上异常的框架残基(参考美国专利5,585,089；其全部内容通过引用并入本文)。可以使用本领域公知的多种技术使抗体人源化，例如CDR移植(EP239,400；WO 91/09967；美国专利5,225,539,5,530,101和5,585,089)，修复或者表面重排(EP592,106；EP519,596)，以及链的重排(美国专利5,565,332)，其全部内容通过引用并入本文。

去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。在本发明中，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见例如WO/9852976A1和WO/0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列，并产生来自每个可变区的人T细胞表位“图谱”，显示表位相对于互补决定区(CDRs)和序列内其它关键残基的位置。分析来自T细胞表位图的单个T细胞表位，以鉴定具有较低改变抗体活性风险的可选择的氨基酸取代。设计包含氨基酸取代组合的一系列可选的重链可变区序列和轻链可变区序列，随后将这些序列掺入到一系列结合多肽中。然后将包含修饰过的可变区和人类恒定区的完整重链和轻链的基因克隆到表达载体中，随后将质粒转入细胞系以产生完整的抗体。然后利用合适的生物化学和生物学实验中比较抗体，鉴定出最佳的抗体。

抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来自免疫球蛋白序列的抗体文库进行的噬菌体展示方法。也可参考美国专利4,444,887和4,716,111，以及PCT公布文本WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO91/10741，每个专利的全部内容通过引用并入本文。

识别选择性表位的全人源抗体可以使用被称为“引导选择”的技术来生产。在该方法中，使用选择的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)来引导识别相同表位的全人源抗体的筛选(参见美国专利5,565,332，其全部内容通过引用并入本文)。

在另一实施方案中，使用常规方法(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以分离编码所需单克隆抗体的DNA并对其进行测序。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞可以作为此类DNA的来源。一旦分离出来，DNA可以被置于表达载体中，然后被转染到原核或真核宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(例如CHO-K1细胞)或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中。分离或合成的DNA也可用于制备抗体的恒定区和可变区的序列，如美国专利5,658,570中所述，其全部内容通过引用并入本文。该方法从所选细胞中提取RNA并转化成cDNA，然后使用Ig特异性引物通过PCR技术进行扩增。适于此目的的合适的探针在美国专利5,658,570中也有所提及。

此外，使用常规重组DNA技术，可将本发明的抗体的一个或多个CDR插入框架区，例如插入到人类框架区以构建人源化非全人源抗体。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人类框架区(参见Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。一些多核苷酸可以编码框架区和CDR组合产生的与目标抗原的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，可以选择能够改善抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。

抗体可以通过使用常规重组DNA技术制备。使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的载体及细胞系等。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technology for Production of ProteinTherapeutics in Cultured Mammalian Cells，D.L.Hacker,F.M.Wurm,in ReferenceModule in Life Sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。

在一个或多个实施方式中，对本发明的抗B7-H3抗体或其抗原结合单元进行糖基化修饰。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可更改糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类修饰可由例如更改抗体序列内的一或多个糖基化位点来完成。举例而言，可进行一个或多个氨基酸取代，从而消除一个或多个可变区糖基化位点，以借此消除该位点的糖基化。此类去糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此类方法进一步详细描述于PCT公开案WO 2003016466 A2及美国专利5,714,350及6,350,861中，其各自以全文引用方式并入本文中。

另外，可以制备糖基化类型改变的经修饰的抗B7-H3抗体或其抗原结合单元，例如低岩藻糖基化抗体或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。已证明这些改变可增加抗体的ADCC能力。此类修饰可由例如在糖基化机制更改的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制更改的细胞在本领域中已有描述且可用作表达本发明的重组抗体以借此产生糖基化更改的抗体的宿主细胞。参见例如欧洲专利号：EP 1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/5434280，其各自以全文引用的方式并入本文中。

本发明的抗体(例如抗B7-H3抗体)可以通过在宿主细胞中重组表达抗体的重链和轻链基因来制备。例如，用一种或多种携带编码抗体的重链和轻链DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得重链和轻链在宿主细胞中表达，表达的抗体可以分泌到培养宿主细胞的培养基内，从所述培养基中可以回收抗体。“转染”指通常用于将外源DNA引入真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如电穿孔、脂转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。用于获得抗体重链和轻链基因，将这些基因掺入表达载体内并将载体引入宿主细胞内的标准重组DNA方法在本领域众所周知，例如Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版(Sambrook，Fritsch和Maniatis(编辑)，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)、CurrentProtocols inMolecular Biology(Ausubel，F.M.等人，编辑，Greene PublishingAssociates，1989)以及美国专利号4,816,397中描述的那些。表达抗体重链和轻链的DNA可以置入同一载体中或置入不同载体中；若置入不同载体中，表达抗体重链的载体和表达抗体轻链的载体可以以适当比例转染宿主细胞(如Tihomir S.Dodev et al.,A tool kitfor rapid cloning and expression of recombinant antibodies,Scientific Reportsvolume 4,Article number:5885(2014)；Stefan Schlatter et al.,On the OptimalRatio of Heavy to Light Chain Genes for Efficient Recombinant AntibodyProduction by CHO Cells,Biotechnol Progress,21:122-133(2005)；Hadi Bayat etal.,Evaluation of different vector design strategies for the expression ofrecombinant monoclonal antibody in CHO cells,Preparative Biochemistry&Biotechnology,48(8):822-829(2018))。在一个或多个实施方式中，抗体表达载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polyA尾巴。其他元件可以包括增强子，Kozak序列(GCCACC，如SEQ ID NO:53所示)及插入序列两侧RNA剪接的供体和受体位点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，pLXSN，pLNCX，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，pSVL，pMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI，pCS2或pCHO1.0等。常使用的哺乳动物细胞(宿主细胞)包括HEK293细胞(例如HEK293F细胞)，Cos1细胞，Cos7细胞，CV1细胞，鼠L细胞和CHO细胞(例如CHO-K1细胞)等。

为了表达本发明的抗体(例如抗B7-H3抗体)，可将编码全长轻链和重链的DNA插入表达载体内，使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。“可操作地连接”意指抗体基因连接到载体内，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。

抗体(例如抗B7-H3抗体)基因可以通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点，则平端连接)插入表达载体内。在插入抗体相关的轻链或重链基因序列之前，表达载体可以已经携带抗体恒定区序列。例如，将抗B7-H3抗体相关的VH和VL序列转换为全长抗体基因的一种方法是将它们分别插入已经编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体内，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段，并且VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。或者，重组表达载体可以编码促进宿主细胞分泌抗体重链和轻链的信号肽。或者，可以将抗体重链和轻链基因克隆到编码促进宿主细胞分泌抗体重链和轻链的信号肽的载体中，使得信号肽与抗体重链和轻链基因的氨基末端框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白的信号肽)，例如，MEFGLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:45)、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO:46)、MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:47)或MVLQTQVFISLLLWISGAYG(SEQ ID NO:48)。

除抗体重链和轻链基因之外，重组表达载体还可以携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。调节序列包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调节序列在例如Goeddel，Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA，1990中有描述。本领域技术人员了解表达载体的设计，包括调节序列的选择可以取决于待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的合适调节序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，如衍生自巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如美国专利5,168,062，4,510,245和4,968,615。

除抗体链基因和调节序列之外，重组表达载体可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择(参见例如，美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择赋予已引入载体的宿主细胞针对药物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性的标记物基因。合适的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在具有氨甲蝶呤选择/扩增的DHFR-宿主细胞中使用)、neo基因(用于G418选择)和GS基因。对于重链和轻链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞内。

本发明的抗体(例如抗B7-H3抗体)能够在真核宿主细胞中表达。在某些实施方案中，抗体的表达在真核细胞例如哺乳动物宿主细胞中进行。用于表达本发明抗体的示例性宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(例如CHO-K1细胞)或从CHO细胞修饰的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44或ExpiCHO、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、SP2细胞、CV1细胞、鼠L细胞、人胚肾细胞HEK293或从HEK293细胞修饰的HEK293T、HEK293F或HEK293E细胞。将编码抗体链基因的重组表达载体引入宿主细胞内后，将宿主细胞在培养基内培养允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌到培养基的一段时间来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。

对于本发明的抗体(例如抗B7-H3抗体)的重组表达，可以用两种重组表达载体共转染宿主细胞，第一重组表达载体编码抗体重链，第二重组表达载体编码抗体轻链。两个重组表达载体可以含有相同的可选择标记物，或者它们可以各自含有分开的可选择标记物。可替代地，可以使用编码抗体重链和轻链的重组表达载体转染宿主细胞。

本发明的抗体(例如抗B7-H3抗体)还可以通过化学合成(例如，通过Solid PhasePeptideSynthesis，第2版，1984 The Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.中描述的方法)来生产。还可以使用无细胞平台(参见例如，Chu等人，Biochemia No.2，2001(RocheMolecularBiologicals)以及Murray等人，2013，Current Opinion in Chemical Biology，17:420–426)生成变体抗体。

通过重组表达产生的本发明的抗体(例如抗B7-H3抗体)，可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法将它纯化，例如通过层析(例如，离子交换、亲和层析和分级柱层析)、离心、差异溶解度、或纯化蛋白质的任何其它标准技术。例如利用蛋白A或蛋白G进行亲和层析，其主要提供了免疫血清中的IgG级分。另外，可将免疫球蛋白所靶向的特异抗原或其表位固定于柱上，以通过免疫亲和色谱来纯化免疫特异性抗体。本发明的抗体(例如抗B7-H3抗体)可以与本领域已知的异源多肽序列融合，以促进纯化。免疫球蛋白的纯化可参考D.Wilkinson的文章(The Scientist，由The Scientist,Inc.,PhiladelphiaPa.出版，第14卷，第8期(2000年4月17日)，第25-28页)。

此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明的抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点突变和PCR介导的突变。变体(包括衍生物)编码相对于原重链可变区VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3和轻链可变区VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的取代、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代或少于2个氨基酸的取代。或者可以沿着全部或部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和突变，以及可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。

在一个或多个实施方式中，本文所述取代为保守氨基酸取代。

在一个或多个实施方式中，编码抗体V3重链的基因序列如SEQ ID NO:49所示，其中，下划线部分编码VH CDR；抗体V3的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示，其中，下划线部分为VH CDR。

SEQ ID NO:49如下：

GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGAGCGGCGAGTCCCTGAAGATCTCCTGTAAGGCTAGCGGCTATACCTTTACC

SEQ ID NO:50如下：

EVQLVQSGAEVKKSGESLKISCKASGYTFT

在一个或多个实施方式中，编码抗体V3轻链的基因序列如SEQ ID NO:51所示，其中，下划线部分编码VL CDR；抗体V3的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示，其中，下划线部分为VL CDR。

SEQ ID NO:51如下：

CAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGTCCCTGAGCCCTGGAGAGAGGGCCACCCTGAGCTGT

SEQ ID NO:52如下：

QIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC

合成方法

本发明还提供了抗体药物偶联物及中间体的制备方法。本发明的抗体药物偶联物及中间体可以通过已知制剂和方法制备。在一些实施方式中，制备方法如下所述。

如式II所示的接头的制备方法

其中

M’为

B为

L’为-(AA)

G如式I中所述。

在一个或多个实施方式中，各FF’独立为

在一个或多个实施方式中，R

在一个或多个实施方式中，z为0。

在一个或多个实施方式中，z为1或2。

在一个或多个实施方式中，B为

在一个或多个实施方式中，各FF’独立为

在一个或多个实施方式中，FF’为

在一个或多个实施方式中，L’为

第一步：通式1-1化合物和通式1-1’化合物在碱性条件下反应得到通式1-2化合物；

第二步：通式1-2化合物和通式(AA)

第三步：去除通式1-3化合物氨基保护基W

第四步：通式1-4化合物和通式1-5化合物在碱性条件下反应得到通式1-6化合物；

第五步：通式1-6化合物和二(对硝基苯)碳酸酯在碱性条件下反应得到通式1-7化合物。

第一步：通式1化合物和通式1’化合物在碱性条件下反应得到通式2化合物；

第二步：通式2化合物和通式(AA)

第三步：去除通式3化合物氨基保护基W

第四步：通式4化合物和通式5化合物在碱性条件下反应得到通式6化合物；

第五步：通式6化合物和二(对硝基苯)碳酸酯在碱性条件下反应得到通式7化合物。

其中

在一个或多个实施方式中，R

在一个或多个实施方式中，z为0。

在一个或多个实施方式中，z为1或2。

上述碱性条件可以用试剂来提供，该试剂包括有机碱和无机碱类，所述有机碱类包括但不限于三乙胺、二乙胺、N-甲基吗啉、吡啶、六氢吡啶、N,N-二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾，所述无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂。

上述缩合剂可以选自N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐、1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-二环己基碳化二亚胺、N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。

如式III所示的中间体的制备方法

其中，G、L、D如式I中所述，M’如式II中所述，B为

在一个或多个实施方式中，B为

通式1-7化合物和D在缩合剂存在下、在碱性条件下反应得到通式1-8化合物。

通式7化合物和D在缩合剂存在下、在碱性条件下反应得到通式8化合物。

其中，n、AA、R、i、f、FF

的制备方法/>

通式1-8化合物和Abu在弱酸性条件下偶联得到通式1-9化合物。

通式8化合物和Abu在弱酸性条件下偶联得到通式9化合物。

其中，M、B、G、L、p、n、AA、R、i、f、FF、D、Abu如式I中所述。

上述弱酸性条件可以用试剂来提供，该试剂包括有机酸和无机酸类，所述有机酸类包括但不限于乙酸、苯甲酸、酒石酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、抗坏血酸、柠檬酸、枸椽酸、水杨酸、咖啡酸、山梨酸、奎宁酸、齐墩果酸、丁二酸、绿原酸、甲酸、丙酸，所述无机酸类包括但不限于碳酸、亚硝酸、乙酸、次氯酸、氢氟酸，亚硫酸、氢硫酸、硅酸、偏硅酸、磷酸、偏磷酸、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠。

药物偶联物可以采用常规方法进行纯化，例如用制备型高效液相色谱(prep-HPLC)等方法。

实施例

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改或调整仍属于本发明的保护范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径或已知方法得到。

VISTA-CHO细胞构建流程：将编码VISTA(NCBI Reference Sequence:NP_071436.1)的基因序列插入到表达载体中，然后稳转CHO-K1细胞(ATCC#CCL-61)，获得VISTA-CHO细胞。

Tim3-CHO细胞构建流程：将编码Tim3(NCBI Reference Sequence:NP_116171.3)的基因序列插入到表达载体中，然后稳转CHO-K1细胞(ATCC#CCL-61)，获得Tim3-CHO细胞。

Lag3-CHO细胞构建流程：将编码Lag3(NCBI Reference Sequence:NP_002277.4)的基因序列插入到表达载体中，然后稳转CHO-K1细胞(ATCC#CCL-61)，获得Lag3-CHO细胞。

CHO-K1-FRα细胞构建流程：将编码FRα(NCBI Reference Sequence:NP_057937.1)的基因序列插入到表达载体中，然后稳转CHO-K1细胞(ATCC#CCL-61)，获得CHO-K1-FRα细胞。

CHO-K1-B7-H3细胞构建流程：将编码B7-H3(NCBI Reference Sequence:NP_001019907.1)的基因序列插入到表达载体中，然后稳转CHO-K1细胞(ATCC#CCL-61)，获得CHO-K1-B7-H3细胞。

实施例1抗原的制备

抗原hB7-H3-Fc的制备：将编码抗原hB7-H3-Fc(抗原hB7-H3-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，由人B7-H3胞外域(如SEQ ID NO:2所示)C-末端添加IgG1的Fc(如SEQ IDNO:3所示)构建而成)的基因序列克隆至表达载体，然后瞬时转染HEK293F细胞，经ProteinA亲和层析纯化后获得抗原hB7-H3-Fc。

抗原hB7-H3-His制备：将编码抗原hB7-H3-His(抗原hB7-H3-His的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，由人B7-H3胞外域(如SEQ ID NO:2所示)C-末端添加10×HIS标签(HHHHHHHHHH，如SEQ ID NO:5所示)构建而成)的基因序列克隆至表达载体，然后瞬时转染HEK293F细胞，经镍柱纯化后获得抗原hB7-H3-His。

抗原hB7-H3-Fc的氨基酸序列：

MLRRRGSPGMGVHVGAALGALWFCLTGALEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(如SEQ ID NO:1所示)。

人B7-H3胞外域的氨基酸序列：

IgG1的Fc的氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(如SEQ ID NO:3所示)。

抗原hB7-H3-His的氨基酸序列：

实施例2嵌合抗体

鼠抗体的VH CDR、VL CDR、VH和VL的氨基酸序列见表1-3。

表1 VH CDR的氨基酸序列(按Kabat进行划分)

表2 VL CDR的氨基酸序列(按Kabat进行划分)

表3鼠抗体可变区的氨基酸序列(按Kabat进行划分)

嵌合抗体的组装方案见表4，VH与CH组成抗体的重链，VL和CL组成抗体的轻链；用“抗体”+抗体编号表示，如抗体M1的重链由如SED ID NO:24所示的VH和如SED ID NO:32所示的CH组成，抗体M1的轻链由如SED ID NO:25所示的VL和如SED ID NO:34所示的CL组成。对照抗体M30-H1-L4的重链如SEQ ID NO:30所示，轻链如SEQ ID NO:31所示(见表5)。嵌合抗体的CDR见表6，恒定区的氨基酸序列见表7。

将编码抗体的重链和轻链的基因序列分别克隆至表达载体中，获得重组表达载体，然后瞬转HEK293F细胞，培养后经Protein A亲和层析纯化获得抗体，测序后与预期序列一致。

表4嵌合抗体编号、组装方案

表5对照抗体M30-H1-L4的氨基酸序列

表6嵌合抗体的CDR

实施例3嵌合抗体的亲和力和特异性

1、嵌合抗体亲和力验证-1

采用BiaCore T200(GE Healthcare)，用Protein A芯片(GE Healthcare，Cas#29127556)进行检测，抗体使用1×HBS-EP+(1×HBS-EP+的制备：取HBS-EP+(10×)(GEHealthcare，cat#BR-1006-69)50mL，加超纯水450mL，混匀)稀释至5μg/mL，以10μL/min的流速通过实验流路(Fc2、Fc4)，捕获20秒(s)使捕获量约为235RU；之后流速调为30μL/min，依次进不同浓度的hB7-H3-His稀释液(0nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM，用1×HBS-EP+稀释)，同时经过实验流路(Fc2、Fc4)和参比流路(Fc1、Fc3)表面，结合时间180s，解离时间600s，最后用Glycine pH1.5(GE Healthcare，cat#BR100354)对芯片进行再生60s，然后进行下一个循环。用数据分析软件Evaluation Software3.1对试验结果进行分析，将样品试验流路采集所得传感信号进行参比流路、样品空白双扣减，并选用动力学“1:1”模型进行拟合，得出各样品同hB7-H3-His结合的动力学参数(ka：结合速率；kd：解离速率；kD：结合解离平衡常数)。

表7嵌合抗体与hB7-H3-His结合的结合速率、解离速率和结合解离平衡常数

结果如表7所示，抗体M1和M2都能结合hB7-H3-His，抗体M1与hB7-H3-His结合的亲和力更高。

2、嵌合抗体亲和力验证-2

取对数生长期的MDA-MB-468细胞，1500rpm离心5分钟(min)，去掉上清，用1×PBS重悬，1500rpm离心5分钟，去掉上清，重复一次。将MDA-MB-468细胞加入V型96孔板，50μL/孔(20万个细胞)，1500rpm离心5分钟并弃去PBS；100μL/孔加入梯度稀释的嵌合抗体(初始浓度为100nM，3倍梯度稀释，溶媒为1×PBS)，重悬细胞；冰上孵育1小时(h)；孵育结束之后，2000rpm离心5分钟，去掉上清，用200μL/孔的1×PBS重悬细胞之后再次进行离心，去掉上清，重复两次；100μL/孔加入PE标记山羊抗人IgG Fc二抗(Invitrogen，货号12-4998-82；用1×PBS稀释至1:500)，重悬细胞；避光，冰上孵育30分钟；孵育结束之后，2000rpm离心5分钟，去掉上清，用200μL/孔的1×PBS重悬细胞之后再次进行离心，去掉上清，重复两次；200μL/孔加入1×PBS重悬细胞；在cytoflex流式细胞仪(Beckman)上进行检测。

检测结果如图1所示。

3、嵌合抗体特异性验证-流式

取对数生长期的细胞(Lag3-CHO细胞、VISTA-CHO细胞、Tim3-CHO细胞或Raji细胞)，1500rpm离心5分钟，去掉上清，用1×PBS重悬，1500rpm离心5分钟，去掉上清，重复一次。将细胞加入V型96孔板，50μL/孔(50万个细胞)，1500rpm离心5分钟并弃去PBS；100μL/孔加入抗体M1(浓度为100nM)，重悬细胞；冰上孵育1小时；孵育结束之后，2000rpm离心5分钟，去掉上清，用200μL/孔的1×PBS重悬细胞之后再次进行离心，去掉上清，重复两次；100μL/孔加入PE标记山羊抗人IgG Fc二抗(Invitrogen，货号12-4998-82；用1×PBS稀释至1:500)，重悬细胞；避光，冰上孵育30分钟；孵育结束之后，2000rpm离心5分钟，去掉上清，用200μL/孔的1×PBS重悬细胞之后再次进行离心，去掉上清，重复两次；200μL/孔加入1×PBS重悬细胞；在cytoflex流式细胞仪(Beckman)上进行检测。

结果如图2所示，抗体M1不结合Lag3-CHO细胞、VISTA-CHO细胞、Tim3-CHO细胞和Raji细胞。

实施例4人源化抗体

人源化抗体VH和VL的氨基酸序列见表8。人源化抗体的组装方案见表9，VH与CH组成抗体的重链，VL和CL组成抗体的轻链；用“抗体”+抗体编号表示，如抗体V3的重链由如SEDID NO:36所示的VH和如SED ID NO:32所示的CH组成，抗体V3的轻链由如SED ID NO:40所示的VL和如SED ID NO:34所示的CL组成。对照抗体M30-H1-L4的重链如SEQ ID NO:30所示，轻链如SEQ ID NO:31所示。对照抗体Trop2的重链如SEQ ID NO:42所示，轻链如SEQ ID NO:43所示(见表10)。

表8人源化VH和VL的氨基酸序列

注：CDR(Kabat编号)用加粗+下划线标出

表9人源化抗体编号、组装方案

表10对照抗体Trop2的氨基酸序列

将抗体的重链和轻链的基因序列分别克隆至表达载体中，获得重组表达载体，然后瞬转HEK293F细胞，培养后经ProteinA亲和层析纯化获得人源化抗体，测序后与预期序列一致。

实施例5人源化抗体的亲和力、内化能力和特异性

1、人源化抗体亲和力验证-1 ELISA

实验前一天，将目标抗原hB7-H3-Fc用1×PBS稀释到2μg/mL，然后100μL/孔加入ELISA板(96孔板)，4℃包被过夜；第二天，甩干包被液，用洗涤液PBST洗涤2次，拍干之后，200μL/孔加入封闭液(含1％BSA的PBST)，37℃封闭2小时；甩干封闭液，用洗涤液PBST洗涤2次，拍干之后，100μL/孔加入梯度稀释的人源化抗体(初始浓度为300nM，3倍梯度稀释，溶媒为1×PBS)，37℃反应1小时；甩干人源化抗体，用洗涤液PBST洗涤5次，拍干之后，100μL/孔加入HRP标记山羊抗人Kappa轻链二抗(Invitrogen，货号A18853；用1×PBS稀释至1:2000)，37℃反应1小时；甩干二抗，用洗涤液PBST洗涤8次，拍干之后，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃反应5-10分钟；加入ELISA终止液，100μL/孔，15分钟内用酶标仪在450nm波长下读取吸光度值。

结果如图3所示。

2、人源化抗体亲和力验证-2流式

取对数生长期的MDA-MB-468细胞，1500rpm离心5分钟，去掉上清，用1×PBS重悬，1500rpm离心5分钟，去掉上清，重复一次。将MDA-MB-468细胞加入V型96孔板，50μL/孔(20万个细胞)，1500rpm离心5分钟并弃去PBS；100μL/孔加入梯度稀释的人源化抗体(初始浓度为100nM，3倍梯度稀释，溶媒为1×PBS)，重悬细胞；冰上孵育1小时；孵育结束之后，2000rpm离心5分钟，去掉上清，用200μL/孔的1×PBS重悬细胞之后再次进行离心，去掉上清，重复两次；100μL/孔加入PE标记山羊抗人IgG Fc二抗(Invitrogen，货号12-4998-82；用1×PBS稀释至1:500)，重悬细胞；避光，冰上孵育30分钟；孵育结束之后，2000rpm离心5分钟，去掉上清，用200μL/孔的1×PBS重悬细胞之后再次进行离心，去掉上清，重复两次；200μL/孔加入1×PBS重悬细胞；在cytoflex流式细胞仪(Beckman)上进行检测。

结果如图4所示。

3、流式细胞术检测人源化抗体内化

用冰预冷的细胞洗液(含2％FBS的PBS)配制30μg/mL的人源化抗体，然后按体积比为1:1与细胞(MDA-MB-468细胞或N87细胞，50万个细胞)混合(终体积100μL)，混匀后冰浴1h；4℃1200r/min离心5min，弃上清；用冰预冷的细胞洗涤液重悬细胞，4℃1200r/min离心5min，去掉上清，重复两次；加入200μL冰预冷的细胞洗液重悬细胞，于37℃孵育2h，使结合细胞表面的抗体内化，然后移至冰浴，并加入冰预冷的细胞洗液终止内化，4℃1200r/min离心5min，弃上清，加入100μL PE标记山羊抗人IgG Fc二抗稀释液(Invitrogen，货号12-4998-82；以冰预冷的细胞洗液：PE标记山羊抗人IgG Fc二抗＝500:1配制PE标记山羊抗人IgG Fc二抗稀释液)，重悬细胞，4℃避光孵育30min，4℃1200r/min离心5min，弃上清；用冰预冷的细胞洗液重悬细胞，4℃1200r/min离心5min，弃上清，用冰预冷的1×PBS重悬细胞，4℃1200r/min离心5min，弃上清，加入200μL冰预冷的1×PBS重悬细胞，用流式细胞仪测平均荧光强度。

表11人源化抗体内化能力

4、人源化抗体特异性验证-流式

取对数生长期的细胞(VISTA-CHO细胞、Tim3-CHO细胞或Lag3-CHO细胞)，1500rpm离心5分钟，去掉上清，用1×PBS重悬，1500rpm离心5分钟，去掉上清，重复一次。将细胞加入V型96孔板，50μL/孔(50万个细胞)，1500rpm离心5分钟并弃去PBS；100μL/孔加入人源化抗体(浓度为100nM，溶媒为1×PBS)，重悬细胞；冰上孵育1小时；孵育结束之后，2000rpm离心5分钟，去掉上清，用200μL/孔的1×PBS重悬细胞之后再次进行离心，去掉上清，重复两次；100μL/孔加入PE标记山羊抗人IgG Fc二抗(Invitrogen，货号12-4998-82；用1×PBS稀释至1:500)，重悬细胞；避光，冰上孵育30分钟；孵育结束之后，2000rpm离心5分钟，去掉上清，用200μL/孔的1×PBS重悬细胞之后再次进行离心，去掉上清，重复两次；200μL/孔加入1×PBS重悬细胞；在cytoflex流式细胞仪(Beckman)上进行检测。

检测结果见图5，抗体V1-V5均不结合VISTA-CHO细胞、Tim3-CHO细胞或Lag3-CHO细胞。

5、人源化抗体的种属特异性

实验前一天，将目标抗原食蟹猴B7-H3(novoprotein CA61)、小鼠B7-H3(SinoBiological,50973-M08H)和hB7-H3-his用1×PBS稀释到2μg/mL，然后100μL/孔加入ELISA板(96孔板)，各两行，4℃包被过夜。第二天，甩干包被液，用洗涤液PBST洗涤2次，拍干之后，200μL/孔加入封闭液，37℃封闭2小时；甩干封闭液，用洗涤液PBST洗涤2次，拍干之后，100μL/孔加入梯度稀释的抗体V3(初始浓度为2μg/mL，2倍梯度稀释)，37℃反应2小时；甩干抗体V3，用洗涤液PBST洗涤5次，拍干之后，100μL/孔加入anti-human kappa lightChains HRP(Sigma，A7164；用1×PBS稀释至1:10000)，37℃反应1h；甩干二抗，用洗涤液PBST洗涤8次，拍干之后，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃反应10分钟；加入0.1MH

表12抗体V3与B7-H3结合的亲和力

从表12可以看出，抗体V3可结合人、食蟹猴B7-H3，不结合小鼠B7-H3。

实施例6化合物(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮盐酸盐(D-1)的合成步骤

1.N,N'-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1,7-二基)二乙酰胺的合成

氮气氛围中，将叔丁醇钾四氢呋喃溶液(42mL，1M)加入干燥反应瓶中搅拌，降温至0-5℃。将溶于四氢呋喃(25mL)的N-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺(CAS号：143655-49-6，5g，21mmol)，缓慢滴加到反应瓶中，随后滴加亚硝酸叔丁酯(4.32g，2eq)(控温0-5℃)，升温至15-20℃搅拌2h。反应完全后，降温至0-5℃，滴加醋酸(25mL)、醋酸酐(25mL)(控温不超过10℃)，滴完搅拌20min。保持5-10℃根据N-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺的量加锌粉(8eq)，20-25℃搅拌1h。过滤，乙酸乙酯(50mL)漂洗固体，降温至0-5℃，滴加15％NaCO

2.N-(8-氨基-5,6-二氟-1-氧代-1,2,3,4-四氢萘-2-基)乙酰胺的合成

将N,N'-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1,7-二基)二乙酰胺(500mg，1.68mmol)加入2M盐酸乙醇溶液(5mL)，50℃搅拌4h，检测反应完全后，加水(7.5mL)，降温至0-5℃，滴加三乙胺(1.03g)搅拌3h。过滤，分别用40％冷乙醇水溶液(3mL)，水(3mL)洗涤。真空干燥得灰色粉末(320mg，74.6％)。LC-MS:[M+H]

3.N-((9S)-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H苯并[de]哌喃并[3'；4':6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺的合成

氮气氛围下将N-(8-氨基-5,6-二氟-1-氧代-1,2,3,4-四氢萘-2-基)乙酰胺(1.1g，1eq)、(S)-4-乙基-4-羟基-7,8-二氢-1H-哌喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4H)-三酮(1.15g，1eq)及甲苯(50mL)加入到反应瓶，升温至回流，搅拌1h后加入4-甲基苯磺酸吡啶(100mg)，继续搅拌回流20h。降至室温搅拌1h。过滤，固体分别用丙酮(10mL)，冷乙醇(5mL)洗涤。真空干燥得灰褐色粉末(1.1g，53％)。LC-MS:[M+H]

4.(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮盐酸盐的合成

将N-((9S)-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺(1.1g，2.28mmol)、6M盐酸水溶液(44mL)加入到反应瓶，氮气氛围下回流搅拌4h。浓缩除去溶剂，HPLC纯化得到白色粉末(200mg，18％)。LC-MS:[M+H]

实施例7 4-((30S,33S)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(CB07)的合成步骤

1)(S)-30-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-26-氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27-氮杂-三十一烷-31-酸(CB01)的合成。

0-5℃氮气保护下，将8.14g N2-芴甲氧羰基-L-2,4-二氨基丁酸(CB00-2)用40mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加入10g 4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂二十六烷酸-N-琥珀酰亚胺酯(CB00-3)和10mL DMF，保持0-5℃滴加6.5mL DIPEA，加完1h后室温下搅拌反应4h，反应完成后减压除去DMF，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比20:1作为洗脱溶剂)得到淡黄色油状液体14.2g CB01。

2)[(S)-1-[[(S)-1-[[4-(羟甲基)苯基]氨基]-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基]氨基]-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(CB02)的合成。

室温氮气保护下，11g(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酸(CB00-4)和5.5g对氨基苯甲醇(CB00-5)用400mL二氯甲烷和200mL甲醇溶解，机械搅拌下，分批加入17g 2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)，避光下反应15h。反应完成后减压除去溶剂得到糊状固体，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比20:1作为洗脱溶剂)得到灰白色固体11.9g。

3)(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(CB03)的合成。

室温氮气保护下，11.9g[(S)-1-[[(S)-1-[[4-(羟甲基)苯基]氨基]-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基]氨基]-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(CB02)中加入300mL乙腈，搅拌下滴加18mL哌啶，滴加完毕后室温下反应2h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂和哌啶，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比20:1作为洗脱溶剂)得到白色固体7.5gCB03。

4)(9H-芴-9-基)甲基((30S,33S)-41-氨基-36-((4-(羟甲基)苯基)氨基甲酰基)-33-异丙基-26,31,34,41-四氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,32,35,40-四氮杂-30-基)氨基甲酸酯(CB04)的合成。

0℃氮气氛围下，将14.2g(S)-30-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-26-氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27-氮杂-三十一烷-31-酸(CB01)溶解于100mL DMF中，分批加入11g N,N,N′,N′-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(HATU)，搅拌反应30min后，加入7.5g的(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(CB03)，保持0℃下反应2.5h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比10:1作为洗脱溶剂)得到固体9.66g CB04。

5)N-((3S)-3-氨基-4-(((2S)-1-((1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基)胺基)-4-氧基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(CB05)的合成。

室温氮气保护下，9.66g的(9H-芴-9-基)甲基((30S,33S)-41-氨基-36-((4-(羟甲基)苯基)氨基甲酰基)-33-异丙基-26,31,34,41-四氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,32,35,40-四氮杂-30-基)氨基甲酸酯(CB04)溶解于50mL DMF，加入12mL二乙胺，搅拌反应1.5h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比7.5:1作为洗脱溶剂)得到淡黄色固体7.7g CB05。

6)N-((3S)-3-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-4-(((2S)-1-((1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧-5-脲基戊烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-丁酮-2-基)胺基)-4-氧代)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(CB06)的合成。

7.7g N-((3S)-3-氨基-4-(((2S)-1-((1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基)胺基)-4-氧基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(CB05)溶于40mL DMF中，0-5℃氮气氛围下，分批加入马来酰亚胺基乙酸琥珀酰亚胺酯(CB00-1)，保持0-5℃反应4h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比10:1作为洗脱溶剂)得到淡黄色固体9.5g CB06。

7)4-((30S,33S)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(CB07)的合成。

9.5g N-((3S)-3-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-4-(((2S)-1-((1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧-5-脲基戊烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-丁酮-2-基)胺基)-4-氧代)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(CB06)溶于50mL DMF中，0℃氮气氛围下，加入14.0g二(对硝基苯)碳酸酯((PNP)

实施例8 4-((18S,21S)-18-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基)-21-异丙基-14,19,22-三氧-24-(3-脲丙基)-2,5,8,11-四氧-15,20,23-三氮杂二十五烷-25-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(CB14)的合成

CB14的制备参考实施例7中CB07的合成，将4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂二十六烷酸-N-琥珀酰亚胺酯替换为4,7,10,13-四氧杂十四烷酸-N-琥珀酰亚胺酯。最终得到白色固体CB14。

实施例9中间体(CB07-Exatecan)的合成

4-(30S,33S)-30-(2-(2,5-二氧六环-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧代-36-(3-脲基丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-三七庚基-37-乌头烷基)-(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃[3’,4’:6,7]吲哚啉[1,2-b]喹啉-1-氨基甲酸酯的合成。

将4-((30S,33S)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(CB07)(2.6g，2.21mmol)与N,N-二甲基甲酰胺(23mL)加入反应瓶R1，氮气保护下搅拌降温至0-5℃。同时取(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[3’,4’:6,7]吲哚啉[1,2-b]喹啉-10,13-二酮甲磺酸盐(依喜替康甲磺酸盐，0.98g，1.84mmol，Advanced ChemBlocks公司)与N,N-二甲基甲酰胺(5mL)加入到另一个反应瓶R2，0-5℃滴加三乙胺(230mg，2.27mmol)，搅拌至全溶后。将反应瓶R2中溶液滴加到反应瓶R1中，然后用N,N-二甲基甲酰胺(2mL)洗涤反应瓶R2后，洗涤液加入到反应瓶R1中。再称取1-羟基苯并三唑(497mg，3.68mmol)、吡啶(1.45g，18.4mmol)加入到反应瓶R1。0-5℃搅拌10min，升至室温搅拌5.5h反应完全后，35℃减压浓缩除去溶剂。用制备型高效液相色谱(prep-HPLC)纯化，冻干，得到白色粉末(1.6g，59％)。LC-MS:[1/2M+H]

实施例10中间体(CB07-D-1)的合成

4-(30S,33S)-30-(2-(2,5-二氧六环-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧代-36-(3-脲基丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-三七庚基-37-乌头烷基)-(1S,9S)-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃[3’,4’:6,7]吲哚啉[1,2-b]喹啉-1-氨基甲酸酯的合成

将4-((30S,33S)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(CB07)(220mg，0.189mmol)与N,N-二甲基甲酰胺(5mL)加入反应瓶R1，氮气保护下搅拌降温至0-5℃。同时取(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮盐酸盐(D-1)(90mg，0.189mmol)与N,N-二甲基甲酰胺(5mL)加入到另一个反应瓶R2，0-5℃滴加三乙胺3滴，搅拌至全溶后。将反应瓶R2中溶液滴加到反应瓶R1中，再称取1-羟基苯并三唑(60mg，0.44mmol)、吡啶(0.5mL)加入到反应瓶R1。0-5℃搅拌10min，升至室温搅拌3h反应完全后，减压浓缩除去溶剂。用制备型高效液相色谱(prep-HPLC)纯化，冻干，得到白色粉末(55mg，20％)。LC-MS:[1/2M+H]

实施例11中间体(CB14-Exatecan)的合成

4-(18S,21S)-18-(2-(2,5-二氧六环-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-21-异丙基-14,19,22-三氧代-24-(3-脲基丙基)-2,5,8,11-四氧-15,20,23-三氮杂二十五烷-25-胺基)-(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃[3’,4’:6,7]吲哚啉[1,2-b]喹啉-1-氨基甲酸酯的合成

类似地，将4-((18S,21S)-18-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-21-异丙基-14,19,22-三氧-24-(3-脲丙基)-2,5,8,11-四氧-15,20,23-三氮杂二十五烷-25-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(190mg，0.19mmol)与N,N-二甲基甲酰胺(23mL)加入反应瓶R1，氮气保护下搅拌降温至0-5℃。同时取(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[3’,4’:6,7]吲哚啉[1,2-b]喹啉-10,13-二酮甲磺酸盐(依喜替康甲磺酸盐；101mg，0.19mmol；Advanced ChemBlocks公司)与N,N-二甲基甲酰胺(5mL)加入到另一个反应瓶R2，0-5℃滴加三乙胺(3滴)，搅拌至全溶后。将反应瓶R2中溶液滴加到反应瓶R1中，然后用N,N-二甲基甲酰胺(1mL)洗涤反应瓶R2后，洗涤液加入到反应瓶R1中。再称取1-羟基苯并三唑(60mg，0.44mmol)、吡啶(0.5mL)加入到反应瓶R1。0-5℃搅拌10min，升至室温搅拌5.5h反应完全后，35℃减压浓缩除去溶剂。用制备型高效液相色谱(prep-HPLC)纯化，冻干，得到白色粉末。

实施例12 ADC1的合成

取7.0L 23.9g/L抗体V3溶液，用10mM琥珀酸水溶液将抗体V3浓度调整至18g/L得到抗体溶液，加入0.1M EDTA水溶液至EDTA终浓度为2mM，调pH至7，根据抗体物质的量，加入5.4摩尔当量0.2M TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)水溶液(体积30.2mL)，25℃180rpm搅拌反应2h；用10mM琥珀酸水溶液、使用截留分子量为30KD的超滤膜包超滤换液10个体积去除TCEP。

偶联反应时，根据抗体物质的量，加入15倍摩尔当量的100mM CB07-Exatecan的二甲基乙酰胺(DMA)溶液，25℃180rpm搅拌反应2小时，加入0.4M N-乙酰半胱氨酸水溶液至其终浓度为2mM，继续搅拌15分钟终止偶联反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mM琥珀酸水溶液经Sephadex G-25树脂洗脱交换。

最终获得ADC1的浓度为18.8mg/mL，通过反相色谱测得的DAR即p为8.0。

实施例13 ADC2的合成(对照药物)

取5mL 3.08g/L的抗体V3溶液，加入0.1M EDTA水溶液至EDTA终浓度为2mM，根据抗体物质的量，加入2.7摩尔当量10mM TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)水溶液(体积27.7μL)，调pH至7，25℃摇床振荡反应2h；用10mM琥珀酸水溶液、使用截留分子量为30KD的超滤膜包超滤换液10个体积去除TCEP。

偶联反应时，根据抗体物质的量，加入6倍摩尔当量的MC-GGFG-DXD(MedChemExpress，Lot#41557，CAS：1599440-13-7，产品名称：Deruxtecan)，25℃摇床振荡反应2小时，加入0.1M N-乙酰半胱氨酸水溶液至其终浓度为1.5mM，继续振荡15分钟终止偶联反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mM琥珀酸水溶液经Sephadex G-25树脂洗脱交换。

最终获得ADC2的浓度为6.3mg/mL，通过反相色谱测得的DAR即p为3.7。

实施例14 ADC3的合成

取10mL 21.5g/L抗体V3溶液，加入0.1M EDTA水溶液至EDTA终浓度为2m M，调pH至7，根据抗体物质的量，加入2.7摩尔当量TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)水溶液(10mM，386.6μL)，25℃摇床振荡反应2h；用10mM琥珀酸水溶液、使用截留分子量为30KD的超滤膜包超滤换液10个体积去除TCEP。

偶联反应时，根据抗体物质的量，加入5倍摩尔当量的10mM CB07-Exatecan的DMA溶液，补加DMA至在体系中DMA的体积比为20％，25℃摇床振荡反应3小时，加入0.1MN-乙酰半胱氨酸水溶液至其终浓度为1.5mM，继续摇床振荡15分钟终止偶联反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mM琥珀酸水溶液经Sephadex G-25树脂洗脱交换。

最终获得ADC3的浓度为2.8mg/mL，通过反相色谱测得的DAR即p为3.4。

实施例15 ADC1的体外生物学活性

1、ADC亲和力验证

采用BiaCore T200(GE Healthcare)，用Protein A芯片(GE Healthcare，Cas#29127556)进行检测，ADC或抗体使用1×HBS-EP+(1×HBS-EP+的制备：取HBS-EP+(10×)(GEHealthcare，cat#BR-1006-69)50mL，加超纯水450mL，混匀)稀释至5μg/mL，以10μL/min的流速通过实验流路(Fc2、Fc4)，捕获20s使捕获量约为235RU；之后流速调为30μL/min，依次进不同浓度的hB7-H3-His稀释液(0nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM，用1×HBS-EP+稀释)，同时经过实验流路(Fc2、Fc4)和参比流路(Fc1、Fc3)表面，结合时间180s，解离时间600s，最后用Glycine pH1.5(GE Healthcare，cat#BR100354)对芯片进行再生60s，然后进行下一个循环。用数据分析软件Evaluation Software3.1对试验结果进行分析，将样品试验流路采集所得传感信号进行参比流路、样品空白双扣减，并选用动力学“1:1”模型进行拟合，得出各样品同hB7-H3-His结合的动力学参数(ka：结合速率；kd：解离速率；kD：结合解离平衡常数)。

表13 ADC和抗体V3与hB7-H3-His结合的结合速率、解离速率和结合解离平衡常数

结果如表13所示，ADC1的亲和力约等于抗体V3。

2、ADC1内化能力验证

将HELA细胞以每孔500万个接种入玻底培养皿(NEST，801002)，37℃，5％CO

结果见图6，ADC1在0小时结合于细胞膜表面，随着时间的延长迅速内化，与溶酶体共定位。

3、ADC1的体外细胞毒性

使用B7-H3阳性细胞Calu-6和CHO-K1-B7-H3和B7-H3阴性细胞CHO-K1评价ADC1对肿瘤细胞的体外细胞毒性。简而言之，对于Calu-6，将细胞重悬于2％胎牛血清的DMEM培养基中，按照100μL/孔(5000个细胞)接种于96孔板，37℃，5％CO

对于CHO-K1或CHO-K1-B7-H3，将细胞重悬于含有2％胎牛血清的CD CHO AGT培养基(gibco，货号12490-003)中，按照100μL/孔(4000个细胞)接种于96孔板，37℃，5％CO

表14 ADC1对肿瘤细胞的体外细胞毒性

注：“-”代表杀伤作用不显著

结果见表14，ADC1对B7-H3阳性细胞Calu-6和CHO-K1-B7-H3呈现出较强的体外细胞毒性，ADC1对B7-H3阴性细胞CHO-K1杀伤作用不显著。

4、ADC1的旁观者效应

使用B7-H3阳性细胞CHO-K1-B7-H3和B7-H3阴性细胞CHO-K1-FRα评价ADC1的旁观者效应。简而言之，将B7-H3阳性细胞CHO-K1-B7-H3或B7-H3阴性细胞CHO-K1-FRα重悬于含有2％胎牛血清的CD CHO AGT培养基(gibco，货号12490-003)中，按照100μL/孔(10000个细胞)接种于96孔板，37℃，5％CO

结果如图7所示，ADC1处理的B7-H3阳性细胞CHO-K1-B7-H3培养上清液对B7-H3阴性细胞CHO-K1-FRα有显著的杀伤作用，而ADC1处理的B7-H3阴性细胞CHO-K1-FRα培养上清液对B7-H3阴性细胞CHO-K1-FRα没有显著的杀伤作用。

实施例16 ADC1的体内肿瘤抑制活性

1、ADC1在人源肝癌Hep 3B细胞株皮下异种移植BALB/c裸鼠模型中的药效学评价。每组的动物数及详细的给药途径、剂量和方案见表15。

表15人源肝癌Hep 3B细胞株皮下异种移植BALB/c裸鼠模型中的给药途径、剂量及方案

注：分组当天定义为第0天；分组当天给药；i.v.：静脉注射

Hep 3B细胞培养在含10％FBS和1％NEAA(GIBCO,货号11140050)的MEM培养基(Hyclone,货号SH30024.01)中。收集指数生长期的Hep 3B细胞，细胞重悬在与基质胶1:1混合的PBS中。选用6-8周雄性BALB/c nude小鼠，每组10只。实验小鼠于右前肩胛处皮下接种5×10

肿瘤细胞接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。开始给药后，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm

表16 Day 25的肿瘤体积和肿瘤抑制率

肿瘤抑制结果如表16和图8所示，ADC1对Hep 3B肿瘤有着剂量依赖的非常强的生长抑制作用；相同小分子量的情况下，ADC1对肿瘤生长抑制作用显著强于ADC2组(第5组对比第3组)。

2、ADC在

评价ADC1在

表17

从

肿瘤接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低(体重每周测量2次)情况，眼睛、被毛及其它异常情况。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm

LU5215模型在开始给药后第27天结束。对照组及ADC1各剂量组无小鼠死亡或明显异常，耐受良好。

LU5215异种移植模型各治疗组和对照组肿瘤生长情况见表18和图9。对照组(第1组)在给药27天后平均瘤体积达到1828.62mm

1mg/kg、3mg/kg和5mg/kg ADC1(即第2、3、4组)给药27天后，平均肿瘤体积分别为1445.72mm

表18 LU5215异种移植模型中各组药效分析表

注：a.数据以“平均值±标准误差”表示；

b.TGI％＝[1-(Ti-T0)/(Ci-C0)]x100，其中T0及C0分别是给药组及溶媒对照组分组当天(第0天)的平均肿瘤体积，Ti及Ci分别是给药组及溶媒对照组第27天时的平均肿瘤体积；

c.nsP>0.05,*P<0.05，**P<0.01及***P<0.001与溶媒对照组肿瘤体积相比。

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专利发明人：汤伟佳;齐学康;周鑫;严辉;李硕旭;范建军;麦思琪;俞金泉;李胜峰;
专利申请人：百奥泰生物制药股份有限公司;