二价铂配合物及其衍生物、制备方法、药物组合物和应用

技术领域

本发明涉及一类含非甾体抗炎药结构单元的二价铂配合物及其衍生物、制备方法、药物组合物和应用，尤其涉及一种可制备为在一定程度能够克服顺铂耐药、降低肿瘤炎症、高效低毒的抗肿瘤药物的二价铂配合物及其衍生物、制备方法、药物组合物和应用。

背景技术

大量的临床和流行病学研究表明，15％～20％的恶性肿瘤是由感染和非可控性炎症引起的，如炎症性肠病与结肠癌相关，慢性乙型肝炎病毒感染会导致肝癌，幽门螺旋杆菌感染与胃癌显著相关，人类疱疹病毒感染会引起鼻咽癌，人类乳头状瘤病毒感染会引起宫颈癌或伯基特淋巴瘤等。慢性炎症参与了恶性肿瘤发生、发展、侵袭、转移等全部病理过程，因此，炎症也被称为恶性肿瘤的第八大特征。

非甾体抗炎药(NSAID)是一类不含有甾体结构的抗炎药。NSAID在1981年时被发现对头颈部鳞状细胞癌的治疗有利。这是首次发现NSAID对癌症的作用。在后续研究中，不断有NSAID对不同癌症的作用被报道。但是，NSAID作为环氧化酶2(COX-2)抑制剂，在单独使用时，对癌细胞仅有适度的杀伤活性。

铂类药物是临床上最主要的抗癌药物之一，它们在肿瘤治疗中起着举足轻重的作用。然而，以顺铂(cisplatin)为代表的二价铂类药物由于具有严重的毒性，且由于铂摄取减少、外排增加、药物失活和DNA损伤修复等原因造成的耐药性也限制了其应用。

有临床研究表明，NSAID与多种抗肿瘤药物(如顺铂、紫杉醇或阿霉素)联合给药具有一定的协同作用，但是多种药物的联合给药往往会导致复杂的代谢产物，造成一些毒副作用的产生。此外，一些联合给药产生的药效也并不理想。近年来文献报道了一些在四价铂轴向位置结合非甾体抗炎药形成的抗肿瘤前药，虽然它们在抗肿瘤的同时也能下调COX-2的表达，但是这些四价铂配合物前药通常在制备、药物代谢和质控等方面存在一定的缺陷，导致难以用于抗肿瘤药物。

发明内容

发明目的：针对现有非甾体抗炎药、一些抗肿瘤药物单独用药或它们的联合用药以及非甾体抗炎药与四价铂配合物结合形成的抗肿瘤前药的不足，本发明旨在供一类在一定程度能够克服顺铂耐药、降低肿瘤炎症、高效低毒的含非甾体抗炎药结构单元的二价铂配合物及其衍生物、制备方法、药物组合物和应用。

技术方案：作为本发明涉及的第一方面，本发明的二价铂配合物及其衍生物具有如下的结构：

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所述衍生物为所述二价铂配合物的异构体或它们的混合物；

其中：

Q为依托度酸、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、吲哚美辛、菲诺洛芬、氟比洛芬、酮基布洛芬、酮咯酸、甲芬那酸、奥沙普秦、双水杨酯、舒林酸或托美汀化学结构中不含羧基的结构片段。

本发明将一些含羧酸基团的非甾体抗炎药与已知的二价铂配合物键合，具体将含有一羧酸基团的非甾体抗炎药通过连接基团肼与含酮羰基的抗肿瘤铂化合物键合，合成了一类既可以抑制肿瘤生长又可以降低肿瘤炎症的单一分子实体，对于发现新的抗肿瘤药物是十分有益的。

优选，所述二价铂配合物及其衍生物结构中：

Q为依托度酸(Eto)、布洛芬(Ibu)、萘普生(Nap)或双氯芬酸(Dic)化学结构中不含羧基的结构片段。

优选，所述二价铂配合物及其衍生物为以下任一化合物：

优选，所述二价铂配合物及其衍生物具有如下的结构：

其中：

Q为依托度酸、布洛芬、萘普生或双氯芬酸化学结构中不含羧基的结构片段。

作为本发明涉及的第二方面，本发明的二价铂配合物及其衍生物的制备方法为：

化合物1经酰化、缩合反应得到所述二价铂配合物；

其中，Q的定义如前所述，DN603、DN604结构分别如下：

作为本发明涉及的第三方面，本发明的药物组合物包含所述二价铂配合物和/或其衍生物以及药学上可接受的载体。

所述二价铂配合物及其衍生物可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、糖浆、悬浮剂或注射剂，制剂可以加入香料、甜味剂、液体/固体填料、稀释剂等常用药用辅料。

作为本发明涉及的第四方面，本发明的二价铂配合物及其衍生物、药物组合物应用于制备抗肿瘤药物，具体治疗乳腺癌、肝癌或卵巢癌，尤其适合顺铂耐药性肿瘤。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

(1)该类二价铂配合物可通过诱导DNA损伤和活性氧产生造成癌细胞凋亡，还可下调环氧化酶2表达降低炎症有效抑制癌细胞生长；代表性化合物对顺铂敏感和顺铂耐药癌细胞的抗肿瘤活性都优于顺铂，且对正常肝细胞的毒性小于顺铂；

(2)该类二价铂配合物不仅可以增强原有铂化合物对癌细胞的毒性，而且在一定程度上还可以提高原有铂化合物对顺铂耐药细胞的敏感性；

(3)该类具有C＝N双键的二价铂配合物可利用肿瘤酸性微环境靶向肿瘤，降低组织毒性；

(4)制备方法简便、易操作。

附图说明

图1为酸性体系(pH 6.0)中Eto-DN604(5μM，PBS)在24h内的水解结果；

图2为中性体系(pH 7.4)中Eto-DN604(5μM，PBS)在24h内的水解结果；

图3为癌细胞凋亡结果，其中(A)为cisplatin(5μM)和Eto-DN604(5μM)分别处理A2780细胞24h后的结果；(B)为cisplatin(5μM)和Eto-DN604(5μM)分别处理A2780/CDDP细胞24h后的结果；

图4为癌细胞中DNA损伤结果，其中(A)为cisplatin(5μM)和Eto-DN604(5μM)分别在A2780、A2780/CDDP细胞中作用12h后DNA的损伤结果；(B)为DNA定量分析结果；(C)为cisplatin(5μM)和Eto-DN604(5μM)分别在A2780、A2780/CDDP细胞中作用12h后γ-H2AX的表达水平；

图5为cisplatin(5μM)和Eto-DN604(5μM)分别在A2780、A2780/CDDP细胞中作用12h后产生ROS的结果；

图6为COX-2表达结果，其中(A)为cisplatin(5μM)、Eto(5μM)、Eto+DN604(5μM)和Eto-DN604(5μM)分别与A2780细胞作用24h后对COX-2表达的调节结果；(B)为COX-2表达定量分析结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：1,8-二乙基-1,3,4,9-四氢吡喃并[3,4-b]吲哚-1-乙酰肼(化合物2a)的制备

称取574mg依托度酸(1a)于烧瓶中，加入10mL甲醇，室温搅拌下继续加入2滴浓硫酸，室温下继续搅拌4h，使用TLC监测反应。反应完成后，减压浓缩，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取1-2遍，二氯甲烷层旋干。然后用10mL甲醇溶解，加入1g水合肼，油浴加热至80℃回流，2h后TLC监测反应。反应完成后，旋干，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取1-2遍，旋干，柱层析，得白色固体500mg，产率83.1％。

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实施例2：(S)-2-(4-异丁基苯基)丙酰肼(化合物2b)的制备

合成方法同实施例1，白色固体，产率79.5％。

1

实施例3：(S)-2-(6-甲氧基萘-2-基)丙酰肼(化合物2c)的制备

合成方法同实施例1，白色固体，产率79.5％。

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实施例4：2-(2-((2,6-二氯苯基)氨基)苯基)乙酰肼(化合物2d)的制备

合成方法同实施例1，白色固体，产率79.5％。

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实施例5：化合物Eto-DN604的制备

分别取150mg化合物2a和192mg DN604于烧瓶中，加入50mL甲醇，油浴加热至60℃，滴加2滴乙酸，搅拌24h后，TLC监测反应。反应完成后，过滤，分别用甲醇和蒸馏水冲洗产物，得白色固体200mg，产率60.0％。

1

实施例6：化合物Ibu-DN604的制备

合成方法同实施例5，白色固体，产率88.7％。

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实施例7：化合物Nap-DN604的制备

合成方法同实施例5，白色固体，产率85.9％。

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实施例8：化合物Dic-DN604的制备

合成方法同实施例5，白色固体，产率82.2％。

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实施例9：化合物Eto-DN603的制备

分别取129mg化合物2a和200mg DN603于烧瓶中，加入50mL甲醇，油浴加热至60℃，滴加2滴乙酸，搅拌24h后，TLC监测反应。反应完成后，浓缩，加二氯甲烷溶解，继续滴加乙醚，过滤，不溶物用蒸馏水冲洗，得灰白色固体270mg，产率84.1％。

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实施例10：化合物Ibu-DN603的制备

合成方法同实施例9，白色固体，产率81.9％。

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实施例11：化合物Nap-DN603的制备

合成方法同实施例9，白色固体，产率79.1％。

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实施例12：化合物Dic-DN603的制备

合成方法同实施例9，白色固体，产率80.0％。

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实施例13：铂配合物的细胞毒活性

实验方法：采用MTT法对所合成的目标化合物进行体外细胞毒性评估。选取处于对数期、状态良好的细胞经胰酶消化后，接种到96孔板中，每孔大约1×10

表1铂配合物的细胞毒活性

*.RF(耐药因子)＝IC

采用MTT法分析合成的铂配合物对人乳腺癌(MCF-7)、人肝癌(HepG2)、人卵巢癌(A2780)、人卵巢癌顺铂耐药(A2780/CDDP)细胞以及人正常肝细胞LO2的细胞毒性。顺铂、DN604和DN603作为阳性对照。如表1所示，在合成的所有铂配合物中，Eto-DN604对所测试的癌细胞株显示出最强的细胞毒性，IC

实施例14：Eto-DN604在癌细胞中的铂摄取和DNA铂化水平

实验方法：将生长状态良好的A2780和A2780/CDDP细胞分别转移到6孔板中，然后置于含有5％二氧化碳的37℃恒温箱中培养至细胞贴壁长满到80％左右。随后更换新的培养基，加入已配制好的待测化合物溶液，放入恒温箱中继续孵育4h。然后，将细胞和培养基一起收集转移到离心管中，经离心移除上清液后收集细胞，用冰的PBS洗涤细胞三次，加入PBS将细胞悬浮，计数后离心移除PBS，再加入200μL 65％的硝酸，于65℃消化4h，最后用ICP-MS检测细胞内的铂含量。为检测DNA的铂化量，利用DNA Extraction Kit提取DNA。PCR用于确定DNA的含量，ICP-MS用于分析DNA中的铂含量。每组实验均进行三次，结果取三次平均值。结果见表2。

表2Eto-DN604在顺铂敏感和耐药卵巢癌细胞中的铂摄取和DNA铂化量

利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定了A2780和A2780/CDDP细胞摄取的铂元素和DNA中的铂含量。如表2所示，Eto-DN604处理后的A2780细胞铂摄取量均明显增加，并且细胞中DNA的铂水平也明显高于顺铂对照组。由于顺铂耐药，顺铂处理的A2780/CDDP细胞中铂含量和DNA铂化水平较A2780细胞均有一定程度降低。然而，经Eto-DN604处理的A2780/CDDP细胞仍具有较高的铂积累和DNA铂化水平，这与细胞毒活性的结果一致。

实施例15：Eto-DN604在溶液中的稳定性

实验方法：称取一定量的化合物溶解于少许DMSO中，加入pH 6.0的PBS溶液稀释至浓度为5.0μM，经有机滤头过滤后，分别在0、4、12、24h利用HPLC进样检测。流动相为乙腈和含0.3％三氟乙酸的水(乙腈：水＝60:40)，流速为1.0mL/min，检测的波长为254nm。结果见图1。

由于肿瘤组织具有酸性微环境的特点，我们选择体外抗肿瘤活性较高的铂配合物Eto-DN604考察其在酸性环境(pH 6.0)下的水解行为。如图1所示，随着时间的增加Eto-DN604在酸性环境中逐渐被水解释放出DN604。然而，Eto-DN604在中性环境中24h内没有变化(图2)。这些结果表明这类具有C＝N双键的铂配合物可利用肿瘤酸性微环境靶向肿瘤，降低组织毒性。

实施例16：Eto-DN604诱导细胞凋亡

实验方法：将处于对数期的A2780和A2780/CDDP细胞转移到6孔板中，置于恒温细胞培养箱中培养，待细胞贴壁长满到80％左右，加入准备好的待测化合物，化合物最终浓度为5μM，随后放入恒温细胞培养箱中继续孵育24h。孵育结束后，将培养基和细胞(包括胰酶消化的贴壁细胞)全部收集于离心管中，离心(2000rpm)移除上清液，收集沉淀的细胞。用冰的PBS洗涤细胞1次，随后加入500μL预先准备好的Binding Buffer溶液使细胞悬浮，充分悬浮后再加入5μL Annexin V，摇匀避光孵育5min，紧接着加入5μL PI，继续孵育15min。最后通过流式细胞仪进行细胞凋亡检测(激发波长和发射波长分别为Ex＝488nm和Em＝530nm)。结果见图3。

通过Annexin V-FITC/PI染色评估了Eto-DN604处理后A2780和A2780/CDDP细胞的凋亡诱导能力。如图3所示，顺铂有效诱导A2780细胞凋亡，凋亡率为33.73％。与顺铂相比，Eto-DN604在A2780细胞中显示出更显著的凋亡率(41.6％)。另外，在A2780/CDDP细胞中，Eto-DN604诱导的细胞凋亡(39.59％)也明显高于顺铂(27.5％)。这些结果表明，与顺铂相比，Eto-DN604可以更有效地诱导癌细胞凋亡并增加癌细胞对铂化合物的敏感性。

实施例17：彗星实验

实验方法：将A2780和A2780/CDDP细胞和待测化合物共孵育12h后，洗涤并收集细胞。将正常熔点的琼脂糖滴在磨砂玻璃载玻片上，4℃下凝固10min。取10μL细胞悬液(含约10

我们利用彗星试验评估了Eto-DN604诱导DNA损伤的能力。如图4A所示，在Eto-DN604或顺铂分别处理的A2780和A2780/CDDP细胞中均发现了明显的荧光拖尾现象。定量分析显示(图4B)，Eto-DN604处理后的A2780和A2780/CDDP细胞尾部DNA显著高于顺铂处理组，说明Eto-DN604能有效诱导DNA损伤，有更好的抗肿瘤效果。

实施例18：癌细胞中γ-H2AX的表达水平

实验方法：使用与实施例17实验相同的方式培养和收集细胞。将细胞重新悬浮在RIPA裂解缓冲液中，在冰上裂解1h，然后在4℃离心机中以13000r/min离心30min。使用BCA试剂盒测定蛋白质的OD值。然后，将经10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上。35℃下，将膜在5％脱脂牛奶中浸泡1h，然后在相应的一抗中浸泡过夜。随后，将膜与HRP偶联的抗体孵育1h，并通过Tanon自动化学发光成像分析系统进行检测。结果见图4C。

γ-H2AX作为组蛋白H2A家族的一员，被认为是DNA双链断裂的典型标志物。我们通过蛋白质印迹(WB)实验评估γ-H2AX的表达，以检测Eto-DN604是否具有比顺铂诱导更高水平的DNA损伤。如图4C所示，经Eto-DN604或顺铂处理后，在A2780和A2780/CDDP细胞中发现γ-H2AX的蛋白表达水平增加。与顺铂组相比，Eto-DN604组显示出更高的γ-H2AX表达水平，说明Eto-DN604诱导DNA损伤的能力强于顺铂。

实施例19：癌细胞中ROS产生

实验方法：A2780和A2780/CDDP细胞在6孔板中培养过夜，然后加入已配制好的待测化合物溶液，放入恒温箱中继续孵育。24h后，除去上清液，用PBS洗涤细胞3次。然后加入ROS探针DCFH-DA并在室温下孵育30min。利用共聚焦显微镜成像。结果见图5。

ROS介导的反应与各种致病性DNA损伤过程有关，我们研究了Eto-DN604诱导细胞内ROS产生的情况。如图5所示，Eto-DN604或顺铂处理后A2780和A2780/CDDP细胞中均有明显的ROS产生，且Eto-DN604处理的A2780和A2780/CDDP细胞中ROS水平高于顺铂。这些结果表明Eto-DN604能诱发ROS的产生，造成比顺铂更高的DNA损伤水平。

实施例20：癌细胞中COX-2的表达

实验方法：将A2780细胞接种在6孔板中，待细胞完全贴壁时，去掉上清，加入新鲜的DMEM培养基，然后加入5μM的待测配合物Eto-DN604以及阳性对照物，作用24h。收集细胞，离心后用1mL的PBS洗一次，再次离心，将上清液倒干净，并向其中加入适量裂解液(PAPI裂解液：PMSF＝100：1)，冰上裂解1h，然后4℃下13300rpm离心30min，收集上清液，从中取2μL用于测定蛋白含量，剩余的上清液加入蛋白上样缓冲液，在100℃水浴锅中加热10min，然后放入-20℃冰箱备用。96孔板中加入18μL纯水，200μL配好的BCA试剂，2μL蛋白样，在37℃下孵育0.5h，在570nm下测定OD值，再根据OD值计算出上样量。接下来进行western blot实验，首先用SDS-PAGE电泳处理，将提取的分子质量不同的蛋白质分离。然后进行转膜，通过形成“正极-三层滤纸-膜-胶-三层滤纸-负极”转膜结构将凝胶上的条带转移至NC膜上，在电流作用下蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中移出并吸附在膜表面。在37℃用5％的牛奶孵育1h，去除杂带。将膜放入配好的目标蛋白的抗体(一抗)中孵育过夜，第二天再用PBST洗去未结合的抗体，使膜上仅有与目标蛋白结合的一抗。再用标记的二抗进行酶免疫定位。用ECL显影液进行显影分析，最后分析结果。在实验中以顺铂、依托度酸、依托度酸和DN604(1:1)的混合物为阳性对照。结果见图6。

COX-2是非甾体抗炎药的生化靶点，在人卵巢癌中过表达，我们测定了Eto-DN604对人卵巢癌细胞中COX-2表达的影响。如图6所示，在A2780细胞中，Eto-DN604显著下调了细胞中COX-2的表达，而顺铂或依托度酸对COX-2表达的影响不显著。当依托度酸与DN604联合作用时，A2780细胞中COX-2的表达稍有下调。结果表明Eto-DN604能够有效下调癌细胞中COX-2的表达，降低肿瘤炎症。