一种富含多酚山茶油的提取方法

(一)技术领域

本发明涉及一种富含多酚山茶油的提取方法。

(二)背景技术

山茶油富含油酸和亚油酸，其不饱和脂肪酸约占90％。研究表明，人体长期摄入不饱和脂肪酸可以减少低密度脂蛋白的蓄积，有助于降低心血管疾病的风险。由于山茶油具有与橄榄油相似的物理化学性质和脂肪酸组成，因此被誉为“东方橄榄油”。山茶油除了具有优质的脂肪酸组成外，微量活性多酚、维生素和植物甾醇也赋予了山茶油多种健康特性。目前的山茶油主要以压榨制油为主，饼粕中的残油多采用溶剂浸提法。

水酶法因萃取条件温和、更好地保留油料自身的风味和微量VE、甾醇等活性物质，而越来越受到重视。然而，水酶法油产率低，成本高，且其对极性多酚的溶解有限，因而造成重要的活性物质未能有效萃取。山茶油多酚具有良好的抗氧化、抗肿瘤、调节血管等多种生物学活性，目前山茶油中已经鉴定27种酚类物质，包括酚酸和黄酮等。然而关于山茶油制油同时富集多酚的研究还鲜有报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种富含多酚山茶油的提取方法，首先山茶籽采用水酶法提取山茶油，再用山茶油萃取山茶籽壳中的多酚，或者山茶籽直接采用水酶法超声辅助提取富含多酚的山茶油，在保证山茶油提取率的条件下，得到了富含多酚的山茶油，该方法最大程度地保留山茶籽天然风味、营养，具有绿色、环保的优势。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种富含多酚山茶油的提取方法，所述方法按如下步骤进行：将山茶籽仁粉末和山茶籽壳粉末共同加入溶剂中，加热灭酶(优选在90℃下预处理10min以灭酶)；当温度冷却至50-60℃(优选55℃)时，调节pH至8-10(优选用1M NaOH水溶液调节至9)，加入碱性蛋白酶，混合液在45-60℃水浴中、100-300rpm连续搅拌下水解3-6h(优选55℃、200rpm、4h)；再在80-100℃下搅拌5-15min(优选90℃、10min)并冷却至室温后，将混合物离心(优选以8000rpm离心30min)，收集上清，即为富含多酚山茶油；所述溶剂为去离子水、体积浓度20％乙醇水溶液、体积浓度25％异丙醇水溶液、0.15M葡萄糖水溶液、0.1M KCl水溶液、含0.15M葡萄糖体积浓度25％异丙醇水溶液、含0.1M KCl的体积浓度25％异丙醇水溶液中的一种。

进一步，山茶籽仁粉末与溶剂质量比为1：5-10，优选1：7；所述山茶籽仁粉末与山茶籽壳粉末质量比为4-8：1，优选5：1；碱性蛋白酶酶活为20000U/mg，所述碱性蛋白酶与山茶籽仁粉末质量比为0.001-0.1：1，优选0.07:1。

进一步，溶剂为含0.15M葡萄糖体积浓度25％异丙醇水溶液。

进一步，山茶籽仁粉末按如下步骤制备：新鲜山茶籽人工去壳，山茶籽仁于50℃烘干4h至质量含水量为5％以下(优选3.6％)；冷却后，磨粉过40目筛，在-18℃下储存，获得山茶籽仁粉末。

进一步，山茶籽壳粉末按如下步骤制备：新鲜山茶籽人工去壳，山茶籽壳于50℃烘干4h至质量含水量为5％以下(优选4.5％)，冷却后，磨粉过40目筛，在-18℃下储存，获得山茶籽壳粉末。

本发明还提供一种富含多酚山茶油的提取方法，所述方法按如下步骤进行:将新鲜带壳山茶籽加入蒸馏水中，湿法破碎，添加纤维素酶和碱性蛋白酶，在40-60℃、100-300W超声辅助下揉捏提取60-120min，离心(优选8000rpm下离心30min)，取上清液，即为富含多酚山茶油。

进一步，所述新鲜带壳山茶籽质量含水量60％，所述新鲜带壳山茶籽与蒸馏水质量比为1：1-5，优选1：1；所述纤维素酶酶活优选10000U/g，质量添加量与新鲜山茶籽质量比为0.005-0.1：1，优选0.01：1；所述碱性蛋白酶酶活优选20000U/g，质量添加量与新鲜山茶籽质量比为0.001-0.01：1，优选0.007：1。

进一步，所述超声辅助萃取条件为150W、50℃、90min。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明以山茶籽仁和山茶籽壳粉末为原料，以含葡萄糖或盐的溶剂为提取剂，在酶的作用下提取得到富含多酚的山茶油；或者以新鲜带壳山茶籽为原料，以水为提取剂，超声辅助酶提取，得到富含多酚的山茶油。本发明方法不仅提高了山茶籽壳的利用率，同时选用添加葡萄糖的异丙醇或者蒸馏水为提取剂，减少了传统有机溶剂提取的溶剂污染问题，同时解决了乳化问题。本发明不采用有机溶剂，乳化少，产率高，制油条件温和，有质量好，更营养、更安全、更健康。

山茶籽制油条件温和，油产率高(高达41.8克油/100g山茶籽，接近有机溶剂存取法，且多酚含量达到48.32mg/kg)，最大程度地保留了山茶籽的微量营养素(维生素E、甾醇、角鲨烯等)和天然特征风味，尤其富集了高浓度、高活性的多酚功能因子，获得的油脂更营养、更安全、更健康。

(四)附图说明

图1、实施例12，13,14获得的山茶油多酚组成液相色谱图；曲线A代表实施例12，曲线B代表实施例13，曲线C代表实施例14。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：本发明山茶籽(Camellia seed)，别名油茶籽，是油茶树的果实，属于山茶科、山茶属。

实施例1、传统有机溶剂萃取法提取山茶油

将10Kg新鲜山茶籽于50℃烘干4h，冷却后，剥壳，山茶籽仁磨粉过40目筛，在-18℃下储存，获得山茶籽仁粉末2.8Kg。

将10g山茶籽仁粉末包裹在滤纸中，并置于装有180mL正己烷的索氏抽提器中。在80℃回流8h后，在50℃下旋转蒸发去除溶剂，收集浓缩液即为山茶油，计算油产率并测定油中总酚含量(TPC)，结果见表1。

油产率(％)＝油的质量/山茶籽仁粉的质量×100

总酚含量的测定方法(Folin-Ciocaltea法)：

将2g山茶油溶解到4mL正己烷中，然后与2mL乙醇-水(80:20，v/v)混合。涡旋萃取3min后，收集下层清液。重复萃取2次，合并下层清液后用正己烷进行洗涤，去除正己烷，获得多酚提取液。将1mL多酚提取液与1mL福林酚试剂稀释液(Folin-Ciocalteau试剂与水以体积比1：1的稀释液)混合。室温放置2min后，将混合物与4mL质量浓度10％ Na

多酚组成分析方法(UPLC-Triple-TOF/MS)：

山茶籽油5g如上萃取多酚并浓缩至1.5mL，0.22μm孔径滤膜过滤，滤液采用HPLC分析。

条件：HPLC分析由Agilent 1260(Agilent，Santa Clara，CA)进行，该公司配备了反相ZORBAX SB-C18柱(250mm×4mm×5μm)。流动相是甲醇(溶剂A)和水(溶剂B)的组合。梯度洗脱程序：10％A保持5min；然后5min升至20％A，保持5min；然后5min升至30％A，保持5min；重复该梯度直至100％A浓度。流动相的流速为1.0mL/min。用UV检测器在280nm处检测酚类化合物及含量。通过UPLC Triple TOF/MS 5600plus系统(AB Sciex Co.，Framingham，USA)对油中的酚类进行定性鉴定分析。

实施例2-4、传统有机溶剂种类对山茶油提取率的影响

将实施例1中正己烷分别替换为乙醇、异丙醇、丙酮，其他操作相同，结果见表1。

实施例5、水酶法提取山茶油

将10g实施例1方法制备的山茶籽仁粉末加入70g去离子水中，在90℃下预处理10min以灭酶。当温度冷却至55℃时，1M NaOH水溶液调节pH至9，加入0.07g碱性蛋白酶(酶活20000U/g)。然后，混合液在55℃水浴中、在200rpm连续搅拌下水解4h。在90℃下搅拌杀菌10min并冷却至室温后，将混合物以8000rpm离心30min。收集上清，即为山茶油0.258g，采用实施例1方法计算油产率，测定油中总酚含量，结果见表1。

实施例6-11、不同溶剂对水酶法提取山茶油的影响

将实施例5中去离子水分别替换为等质量的体积浓度20％乙醇水溶液、体积浓度25％异丙醇水溶液、0.15M葡萄糖水溶液、0.1M KCl水溶液、含0.15M葡萄糖的25％异丙醇水溶液及含0.1M KCl的体积浓度25％异丙醇水溶液，其他操作相同，结果见表1。

实施例12、籽壳同时水酶法

将10Kg新鲜山茶籽人工去壳，山茶籽仁和山茶籽壳分别于50℃烘干4h至山茶籽仁质量含水量3.6％，山茶籽壳质量含水量4.5％，冷却后，磨粉过40目筛，在-18℃下储存，获得山茶籽仁粉末2.8Kg和山茶籽壳粉末1.9Kg。

将10g山茶籽仁粉末及2g山茶籽壳粉末，加入70g含0.15M葡萄糖的体积浓度25％异丙醇水溶液中，在90℃下预处理10min以灭酶。当温度冷却至55℃时，1M NaOH水溶液调节pH至9，加入0.07g碱性蛋白酶(以山茶籽仁质量计0.7％)。然后，混合液在55℃水浴中、在150rpm连续搅拌下水解4h。在90℃下处理10min并冷却至室温后，将混合物以8000rpm离心30min。收集上清，即为山茶油0.403g，采用实施例1方法计算油产率，测定油中总酚含量，结果见表1，分析多酚含量。

实施例13、剪切法提取山茶油中总酚

称取20g精炼山茶油(千岛湖瑶记精练山茶油)加入0.5g实施例12方法制备的山茶壳粉末。先采用高速剪切机在10000rpm条件下剪切混合1min，重复3次；然后在200W下超声混合30min；最后混合液在8000rpm下离心30min，取上清液，采用实施例1方法测定山茶油中总酚含量，结果见表1。

实施例14、相转移法提取山茶油中总酚

称取5g实施例12方法制备的山茶籽壳粉，添加10ml乙醇，在300W下超声萃取30分钟，混合液在8000rpm下离心30min，取上清液与4g精炼山茶油(千岛湖瑶记精炼山茶油)混合，在150W下超声混合30min后，转移至25mL圆底烧瓶中，在45℃下旋转蒸发除去溶剂，采用实施例1方法测定山茶油中多酚含量，结果见表1。

实施例15、鲜山茶籽制油

称取500g新鲜带壳山茶籽(含水率60％)，添加500g蒸馏水，湿法破碎，加入5g纤维素酶(酶活10000U/g)和3.5g碱性蛋白酶(酶活20000U/g)，在150W超声辅助下50℃揉捏混合萃取90分钟，8000rpm下离心30min，取上清液，即为富含多酚山茶油，采用实施例1方法测油产率及多酚含量，结果见表1。

表1、不同提取方法下山茶油的产率及总酚含量

注：-代表不添加，E代表添加酶。

表1数据显示：

1、实施例1传统溶剂正己烷萃取清油产率最高为42.27％，但活性多酚不高，约为13.76mg/Kg。实施例2纯乙醇萃取油产率不高仅为32.3％，多酚含量最高48.92mg/Kg；实施例3异丙醇清油产率38.2％，油中多酚含量为143.74 mg/Kg；实施例4丙酮油萃取率和多酚含量均较高。但实施例1-4传统有机溶剂萃取山茶籽仁(脱壳)制油，尽管油产率高，部分多酚含量较高，但是有机溶剂法制得的油需要高强度精炼，绝大部分多酚会被脱除精炼脱除，因此将精炼油中多酚浓度低于10mg/Kg以下。此外有机溶剂法规模大、设备昂贵，主要适合大宗油料如大豆、菜籽制油等。易燃易爆，安全风险大，磷脂不能有效萃取，且环境不友好，有机溶剂萃取的山茶油品质不高，油中残留溶剂带来了食品安全隐患，消费者接受度低，因此实际中很少应用于原山茶籽萃取山茶油。

2、实施例5采用基本水酶法，水作溶剂，水解山茶籽仁(脱壳)制油，安全，但乳化严重，油产率低，多酚也不高。

实施例5以脱壳的山茶籽仁为原料，以水为溶剂的水酶法因乳化严重，清油产率仅为25.8％。

3、实施例6-11采用改良的水酶法，添加部分醇溶剂和盐或糖，水解山茶籽仁(脱壳)制油，乳化问题解决，油产率提高，多酚含量也改善，但仍不满足高多酚的要求。

实施例6-10，引入低浓度的异丙醇、乙醇和KCl、葡萄糖，可有效减少乳化，清油产率提升到了33.3～41.8％之间。重要的是水酶法条件温和、避免高温曝露，因此绿色安全，油品质量好且富集了更多的维生素E、角鲨烯和甾醇等微量营养物质。不足之处是油中活性多酚含量较低，在10 mg/Kg以下。

实施例11以脱壳的山茶籽仁为原料，组合异丙醇和葡萄糖溶液为溶剂采用水酶法提取山茶油，山茶油产率提高至41.8％，且多酚含量提高了1倍多至13.82mg/Kg，这可能是糖分子的加入降低了溶液的极性，使得饱和多酚部分转移至油相。

4、实施例12采用改良的水酶法，水解山茶籽仁+壳一起制油，油产率提高，多酚含量也改善到23 mg/kg，制得的油脂安全，不需高强度精炼，营养素保留度高。

实施例12采用了山茶籽仁和部分果壳共同水解，山茶油产率40.3％，多酚含量显著提高至23.1mg/Kg，实现了油产率与营养的平衡，同时解决了乳化问题，提高了山茶籽壳的利用率，降低了成本。

5、实施例13油萃取多酚法，用市售的精炼山茶油(几乎不含多酚)和山茶壳(高多酚、不含油)剪切混合萃取多酚，油中多酚含量提升至19.67mg/Kg，特点是工艺简单方便。缺点是市售山茶油主要是压榨法制得，其中维生素E、甾醇、角鲨烯含量不高。

实施例14相转移法，采用山茶皮的乙醇萃取溶液与山茶油按一定比例混合溶解，然后蒸发脱除乙醇溶剂，乙醇中的多酚转移至油相中，所得山茶油多酚含量提升至48.32mg/Kg。缺点是工艺稍显复杂，需要分别提取多酚、油脂，二者混合再蒸馏脱溶剂。

实施例15采用鲜果(壳+仁)酶法制油，山茶全果不需要干燥，直接破碎加部分酶制备，绿色、安全、营养。

实施例15开发从鲜果出发鲜榨山茶油，同时添加生物酶辅以超声物理场增强传质，山茶油得率36.9％，其多酚含量亦高达22.85mg/Kg，一方面蛋白生物解离促进了油脂的析出，同时促进多酚物质的溶出进入油相，此外纤维素酶可能也促进了糖基化多酚的分解转化为非极性增强的游离酚，因此有利于其向油中转移。油中多酚水平已完全满足富酚需求。

综合分析实施例12的山茶油中多酚组成发现，实施例12的多酚组成游离酚及糖基化酚含量高(见图1中曲线A)，活性好，工艺更天然。而实施例13、14多酚含量虽然高，但其中黄酮类含量高，活性糖基化酚较少(见图1中曲线B、C)。