CHMP1B基因作为靶标在筛选肿瘤治疗药物中的用途及其肿瘤治疗药物

技术领域

本发明属于基因肿瘤治疗技术领域，尤其是涉及一种CHMP1B基因作为靶标在筛选肿瘤治疗药物中的用途及其肿瘤治疗药物。

背景技术

肿瘤发生原因多种多样，包括遗传、物理、化学、生活习惯等因素，多种因素相互促进肿瘤的发生，而在体内往往表现为原癌基因或者抑癌基因的异常变化。原癌基因与细胞增殖相关，是维持机体正常生命活动所必需的，在进化上高度保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，并改变细胞的生物学活性，体现在侵袭性、转移性升高，凋亡降低，逐渐形成肿瘤。抑癌基因也是正常细胞中存在基因，激活后起抗肿瘤作用，但在多种癌症中抑癌基因被抑制或丢失，导致抑癌作用降低，细胞恶性程度增加及肿瘤发生。正常情况下它们对细胞的发育、生长和分化的调节均起着重要作用。

近年来，随着对肿瘤研究的不断深入，靶向疗法成为肿瘤治疗的重要手段之一。靶向治疗是指对癌细胞进行基因层面的筛选，找出和正常细胞基因不同的靶点，通过靶向目的基因使药物特异地结合进而产生抗癌作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会对肿瘤周围正常组织造成伤害，降低不良反应的发生。此外，靶向疗法联合放化疗及其他疗法可有效提升抗肿瘤效果，为肿瘤治疗提供更多潜在可选的方案。综上，考虑到原癌基因与抑癌基因在肿瘤发生发展过程中的重要作用以及靶向疗法的不断发展，不断探索有意义的治疗靶点对增强抗肿瘤治疗起着至关重要的作用。

然而，目前有效的抗肿瘤靶点仍然较少，多种肿瘤治疗效果仍不理想，有效靶点的发现成为目前迫切需要探究的方向。因此，迫切需要探索更多有效的抗肿瘤靶点，由于肿瘤异质性等多种原因，不同靶点往往针对某一种或某一类肿瘤，在研究抗肿瘤靶点时往往也主要依据具体肿瘤进行研究。

细胞膜具有流动性，不断发生膜重塑、融合、出芽和裂变等活动，膜的这种结构动力学特征对于细胞各种生物学功能有重要意义，包括细胞分裂、细胞迁移、细胞代谢、信号传递、防御病原体等。内吞体运输必需分选复合物（endosomal sorting complex requiredfor transport，ESCRT）是一种保守的膜重塑复合物，在许多涉及膜重塑事件的过程中可以进行膜切割。ESCRT包括4种主要核心复合物，即ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ和ALIX、AAA ATPase VPS4等辅助蛋白。

ESCRT参与细胞膜重塑、细胞分裂及多泡体（multivesicular body，MVB）的分选等过程，因此对肿瘤进展起着重要影响。ESCRT亚基众多，多项研究显示一些亚基与肿瘤发生发展密切相关，然而现有对ESCRT的研究较少，因此研究ESCRT亚基在肿瘤发展中的作用对抗肿瘤具有重要意义。本专利主要研究基因CHMP1B属于ESCRT-Ⅲ亚基，参与膜重塑并起重要作用，因而对肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及转移等行为有重要影响。

发明内容

本发明的主要目的为了依靠现有技术探索CHMP1B基因在肿瘤治疗中的作用，通过降低CHMP1B基因在肿瘤细胞中的表达，起到对肿瘤细胞恶性生物学行为如生长、增殖、迁移、侵袭的抑制作用，从而达到抗肿瘤的目的。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

本发明提供了一种CHMP1B基因作为靶标在筛选肿瘤治疗药物中的用途，所述CHMP1B基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述肿瘤为肺癌。

进一步的，所述肿瘤治疗药物包含shRNA，所述shRNA的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种肿瘤治疗药物，所述肿瘤治疗药物包含可降低肿瘤细胞中CHMP1B基因表达的试剂，所述CHMP1B基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述可降低肿瘤细胞中CHMP1B基因表达的试剂包含shRNA，所述shRNA的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的有益效果如下：

本发明中已知CHMP1B在肺癌中表达升高，利用shRNA敲低CHMP1B基因在肺癌中的表达，敲低后有效抑制了肺癌细胞的生长、增殖、迁移、侵袭。因此，可以将CHMP1B作为肿瘤治疗的靶点，通过敲低CHMP1B治疗肿瘤。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为蛋白质免疫印迹实验（Western Blot，WB）结果图。

图2为CCK-8法检测细胞增殖图。

图3为动物体内实验结果中肿瘤体积对比图。

图4为动物体内实验结果中肿瘤质量对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

下面结合说明书图1至图4描述本发明。

实施例1：体外细胞实验

作为观察CHMP1B基因对肺癌的作用的一种方法，该方法考察了CHMP1B shRNA基因对人肺癌细胞系A549生物学行为的影响，本方法的详细实施步骤：将实验组CHMP1B shRNA（实验组shRNA序列如SEQ ID NO：2所示）与对照组NC（具体序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT）两组分别转入A549细胞中，经过嘌呤霉素筛选后建立稳转细胞系，对两组稳转细胞系进行不同处理，包括提取蛋白进行Western Blot实验进行CHMP1B基因敲低效率的验证，结果如图1所示。在图1中，当实验组敲低CHMP1B基因与对照组NC的内参（TUBULIN）表达量（条带深浅代表蛋白表达量）类似的情况下，实验组敲低CHMP1B基因的目的蛋白CHMP1B的表达量（条带深浅代表蛋白表达量）比对照组NC的CHMP1B蛋白表达量明显降低，表示用CHMP1B shRNA对CHMP1B基因敲除效率很高。此外，进行细胞学实验，包括CCK-8实验测细胞增殖情况，Transwell实验测细胞迁移、侵袭情况。综合测定实验组与对照组对肺癌细胞恶性行为的影响及对比，结果如图2所示。

图2中用CCK-8试剂测量实验组敲低CHMP1B基因与对照组NC的细胞增殖情况，纵坐标OD值指吸光度，与细胞增殖速率呈正相关，对照组NC增殖速率高于敲低CHMP1B基因的实验组。右侧上方图为Transwell实验检测细胞迁移图：用结晶紫检测实验组敲低CHMP1B基因与对照组NC的细胞迁移情况，图中被结晶紫染色迁移穿过小室的细胞数量（cells perfield:每视野下细胞数量），对照组NC迁移能力高于敲低CHMP1B基因的实验组。右侧下方图为Transwell实验检测细胞侵袭图：用结晶紫检测实验组敲低CHMP1B基因与对照组NC的细胞侵袭情况，图中被结晶紫染色侵袭穿过小室的细胞数量（cells per field:每视野下细胞数量），对照组NC侵袭能力高于敲低CHMP1B基因的实验组。

（1）实验对象、实验材料

1）对象：肺癌细胞系A549

2）主要试剂、耗材、仪器

胎牛血清（Eallbio），RPMI-1640(上海源培生物技术公司)，0.25%胰蛋白酶（上海源培生物技术公司），1×PBS（上海源培生物技术公司），Cell Counting Kit-8（上海碧云天生物科技有限公司），结晶紫（上海碧云天生物科技有限公司），电泳槽、转膜槽（美国BIoRad公司），BioTek ELx800酶标仪（美国BioTek公司），低速台式自动平衡离心机（Eppendorf5415R）,计数板（上海市求精生化试剂仪器有限公司），倒置荧光显微镜（Olympus BX51），金属浴（德国Eppendorf公司），超净台（美国Thermo Fisher），细胞培养箱（美国ThermoFisher）。

（2）实验方法

1）实验分组

按照转入敲低shRNA基因的不同将细胞分为实验组（转入敲低CHMPIB shRNA靶向序列：GCTGGATTCTAAAGTTCTGTA）和对照组(转入对照NC shRNA靶向序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT)。

2）Western Blot实验验证敲低效率

分别提取实验组和对照组A549细胞的蛋白，将提取的两组蛋白用BCA法测量浓度后，计算上样量。对实验组和对照组蛋白进行Western Blot实验，观察两组蛋白表达量差异，验证实验组蛋白敲低效率，结果如图1所示。

3）增殖、迁移、侵袭实验

3-1）CCK8实验测定增殖

将实验组和对照组A549细胞培养至对数生长期，确保实验时细胞状态良好。用0.25%胰蛋白酶分别消化两组细胞，并用完全培养基中止消化并收集细胞，将收集好的细胞以800RPM 5min模式离心。离心完毕后弃上清，用含10%FBS的1640培养基重悬细胞沉淀，取部分用计数板计数，将细胞密度调整为约3×104/ml,取100μl/孔加入96孔板中，实验组及对照组细胞均需接种5个时间段（0h、24h、48h、72h）的孔数，每个时间段设置三复孔，即每组接种十二孔细胞，细胞箱培养。铺板后两组每隔0h、24h、48h、72h吸出对应时间点的孔内的培养基，加入CCK8（CCK8:无血清培养基：1:10）100μl/孔，孵育2h后，置于450nm波长酶标仪中进行检测，记录各孔吸光度（OD）值，0小时测得的OD值作为基础OD值。

3-2）侵袭实验

实验开始前提前在8μm Transwell小室底部铺上70μl稀释的Matrigel(Matrigel:无血清培养基=1：7)，放置在37℃培养箱中直至Matrigel胶凝固。实验时先在每个Transwell小室对应的孔中加入500μl/孔完全培养基，将小室置于上方。分别用0.25%胰酶将对数生长期的实验组及对照组A549细胞消化成单细胞，800RPM 5min模式离心后弃上清，并用不含血清的培养基重悬，计数后取2×104个/孔接种到Transwell铺胶上室中，细胞箱培养48h。48h后取出上室弃掉上室中的培养基，PBS冲洗2遍，置入甲醇中固定20min，弃掉上室甲醇，用0.5%结晶紫染色20min，染色结束后用自来水轻轻冲洗掉多余结晶紫并用棉签轻轻擦去上室未穿过膜的细胞。晾干后在显微镜下观察穿膜细胞并拍照计数。

3-3）迁移实验

迁移实验步骤基本与侵袭实验相似，区别在于迁移实验提前无铺胶步骤。

（3）实验结果

实验结果如图2所示：敲低CHMP1B基因后可有效抑制肺癌细胞A549在体外的增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为。

实施例2.体内动物实验

（1）实验动物

本实验提前在斯贝福（北京）生物技术有限公司订购约6周龄雌性裸鼠14只，收到裸鼠后进行分笼以便其尽快适应实验环境。

（2）实验分组

实验组：取7只裸鼠，用肺癌A549细胞（转入敲低CHMPIB shRNA靶向序列:GCTGGATTCTAAAGTTCTGTA）进行皮下成瘤。

对照组：取7只裸鼠，用肺癌A549细胞（转入对照NC shRNA靶向序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT)进行皮下成瘤。

（3）皮下成瘤

提前培养扩增两组细胞并保证细胞状态良好，成瘤时提前将细胞消化重悬准备好，将细胞密度调整约3×106个/100μl。将两组的细胞悬液按照100μl/只注射至对应组的小鼠左侧腹股沟皮下，每组注射7只小鼠。注射时保证注射位置正确及肿瘤细胞不漏，注射完毕后观察小鼠状态，无异常后方可离开。

（4）瘤体测量

皮下注射肿瘤细胞后2～3周左右长出瘤体，当瘤体达到约5mm3左右时开始测量肿瘤大小，每隔3天测量一次，实验终点定在肿瘤体积最大直径不超过15mm时。实验结束后处死小鼠并取出瘤体，对瘤体进行称重、拍照。

（5）实验结果

实验结果如图3、图4所示：敲低CHMP1B基因后可有效抑制肺癌细胞A549在体内的生长，明显控制肿瘤在体内的进展。

以上实验结果表明，利用基因敲低技术敲低CHMP1B基因在体内可降低肺癌细胞的生长，在体外可降低肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为，体内体外方法结合均表明敲低CHMP1B基因对肺癌起着明显的控制作用，这为肺癌的药物治疗提供了潜在的治疗靶点。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。