用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的组合物、产品及系统

技术领域

本发明涉及分子生物领域，特别涉及用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的组合物、产品及系统。

背景技术

尽管安全有效的HBV疫苗问世已有40年的历史，但慢性乙型病毒感染仍然是严重危害人类健康的公共卫生学问题。目前临床上抗HBV一线药物主要有干扰素(Interferon，IFN)和核苷(酸)类似物(nucleoside/nucleotide analogues，NAs)。功能性治愈，即血清HBV DNA及HBsAg清除，被视为慢性乙型肝炎的重要治疗目标。大量研究表明，血清HBsAg清除与慢乙肝患者肝癌发病率降低等远期良好预后密切相关。然而，根据现有的慢性乙型肝炎治疗方案，仅有少数患者能够实现功能性治愈。

研究表明，IFN主要通过激活JAK-STAT通路，诱导干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)表达，从而发挥抗病毒和免疫调节功能。IFN主要以聚乙二醇修饰的长效干扰素α(Peg-IFNα)形式用药。IFNα治疗慢性乙型肝炎涉及到多种机制，其既具有直接的抗病毒作用，还能抑制cccDNA转录，促进cccDNA降解，还能通过激活免疫系统杀伤带有HBV DNA整合的细胞。通过Peg-IFNα治疗慢性乙型肝炎，血清HBsAg的清除率大约为3％-10％。对于治疗前血清HBsAg低于200IU/ml的慢乙肝患者，Peg-IFNα治疗的HBsAg的清除率甚至高于20％。

尽管如此，这一清除率仍然无法满足临床需求，因此寻找影响Peg-IFNα治疗慢性乙型肝炎HBsAg清除率的因素一直是研究的焦点。既往研究研究已经证实病毒载量、HBV的基因型、HBV突变等病毒因素以及年龄、性别、治疗前的血清ALT水平等宿主因素都与Peg-IFNα治疗慢性乙型肝炎HBsAg清除率相关。许多临床研究还发现，不同地域以及不同人种经Peg-IFNα治疗，HBsAg清除率也存在极大差异，这提示宿主遗传因素同样起了重要作用。

对于Nas药物，临床研究表明治疗慢性乙型肝炎后血清HBsAg的清除的发生率极低，通常小于1％。HBsAg有两大来源，分别是cccDNA和整合HBV DBA。而NAs主要通过抑制HBV逆转录来抑制HBV复制，对cccDNA的抑制作用有限，对整合HBV DNA更是无能为力。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种用于预测药物疗效的组合物、系统及用途，本发明通过全基因组关联分析已经证实，宿主遗传因子SNP rs7519753可用于预测干扰素治疗慢性乙型肝炎的治疗效果。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的组合物，其包括用于检测生物样本中核酸SNP位点信息的试剂，所述SNP位点选自rs7519753、rs12021785、rs12030094、rs12026098和rs4653644中的至少一种。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的组合物，其中，所述干扰素药物包括聚乙二醇干扰素α或聚乙二醇干扰素α和其他药物的组合，所述其他药物包括核苷(酸)类似物、免疫调节类药物和/或直接抗病毒药物。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的组合物，其中，所述试剂包括用于检测SNP位点信息的引物、探针或基因测序试剂。

本发明的第二方面，提供一种用于预测药物疗效的产品，其包括本发明所述的组合物。

在某些实施方案中，根据本发明所述的产品，其中，所述产品包括检测芯片、检测试剂盒或检测装置。

本发明的第三方面，提供一种用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的系统，其包括：

数据获取单元，其设置为能够获取来自受试者的信息，所述信息包括以下SNP位点的信息：rs7519753、rs12021785、rs12030094、rs12026098和rs4653644中的至少一种；和

判断单元，其设置为判断rs7519753位点的信息，并且当该位点为CC和CT基因型时，将干扰素药物判断为有效或HBsAg转阴率高。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的系统，其中，进一步包括SNP位点检测单元，其设置为能够与数据获取单元通信连通，并获取所述SNP位点检测单元产生的数据；所述SNP位点检测单元包括用于进行以下分析的单元之一：聚合酶链反应PCR、毛细管电泳、质谱、单链构象多态性SSCP、电化学分析、变性HPLC及凝胶电泳、限制性片段长度多态性、单碱基延伸SBE、等位基因特异性引物延伸ASPE、限制酶消化、链置换扩增SDA、转录介导的扩增TMA、连接酶链反应LCR、基于核酸序列的扩增NASBA、引物延伸、滚环扩增RCA、自主序列复制3SR、环介导的等温扩增LAMP、核酸测序和微阵列。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的系统，其中，SNP位点检测单元包括能够进行以下核酸测序的单元：Maxam-Gilbert测序、链终止方法、鸟枪测序、桥式PCR、单分子实时测序、离子半导体或离子流测序、合成测序、SOLiD测序、链终止或Sanger测序、大规模平行测序MPSS、聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、DNA纳米球测序、单分子实时测序、纳米孔DNA测序、隧穿电流DNA测序、杂交测序、质谱测序、微流体Sanger测序、基于显微镜的测序、RNAP测序和体外病毒高通量测序。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的系统，其中，所述来自受试者的信息进一步包括受试者年龄、性别、基线血清ALT、AST、HBsAg和HBeAg水平信息。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的系统，其中，判断单元设置为能够根据来自受试者的信息计算评估值的步骤。

本发明提供了用于预测干扰素治疗乙肝患者疗效的分子标记，该分子标记包括rs7519753或与其在遗传学上高度连锁不平衡的其他SNP位点。通过对慢乙肝患者的SNP进行基因分型，能够预测干扰素治疗慢性乙型肝炎的治疗效果，例如rs7519753为CC或CT基因型的慢乙肝患者在接受干扰素治疗时，其血清HBsAg的清除率显著高于TT基因型的患者。

附图说明

图1为时间分辨飞行质谱法检测rs7519753基因型的示意图。

图2示出了全基因组关联分析的质量控制。

图3示出了全基因组关联分析的结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明中，术语“试剂”和“检测剂”可互换地用于指包括那些能够显示基因位点或其mRNA的量的任何试剂。

用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的组合物

本发明的第一方面，提供一种用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的组合物，其优选适用于亚洲人种，因此，本发明提供一种用于亚洲人种或人群中预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的组合物，其包括用于检测生物样本中核酸SNP位点信息的试剂，所述SNP位点包括但不限于rs7519753、rs12021785、rs12030094、rs12026098和rs4653644中的至少一种。在一个优选的实施方案中，SNP位点为rs7519753。

本发明中，药物包括干扰素类和核苷(酸)类似物及可能的免疫调节类药物和/或直接抗病毒药物。干扰素类药物包括普通干扰素IFN和聚乙二醇干扰素(也称为长效干扰素)。免疫调节类药物包括那些能够用于免疫增强，治疗免疫缺陷疾病、慢性感染和作为肿瘤的辅助治疗的任何免疫增强药。直接抗病毒药物(有时也称为“DAAs”)包括那些能够直接作用于丙肝病毒蛋白酶、RNA聚合酶等病毒复制的任何能够抑制病毒复制的药物，其实例包括但不限于利巴韦林、索非布韦(sofosbuvir)、司美匹韦(simeprevir)、雷迪帕韦(ledipasvir)、奥比他韦(ombitasvir)、帕利普韦(paritaprevir)、利托那韦(ritonavir)、达塞布韦(dasabuvir)、达卡他韦(daclatasvir)、阿那匹韦(asunaprevir)或它们的组合。

在某些实施方案中，本发明使用的药物为聚乙二醇干扰素。核苷(酸)类似物的实例包括但不限于拉米夫定(LMV)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)、替比夫定(LdT)和替诺福韦。在某些实施方案中，本发明使用的药物为阿德福韦酯(ADV)。本发明的组合物及系统和预测方法不仅适用于上述药物单用，而且适用于两者联用或联合治疗，例如聚乙二醇干扰素和阿德福韦酯联用以用于乙型肝炎病毒抗原血清学转换或以乙型肝炎病毒表面抗原血清学阴转。

在某些实施方案中，治疗效果包括至少下述情形之一：

(a’)HBsAg转阴；

(b’)降低、抑制、减少或降低HBV的复制；

(c’)增强或提高干扰素应答效果，优选地，所述干扰素应答效果包括抗HBV效果；

(d’)降低病毒量和/或活性，或持续的病毒学应答；

(e’)降低HBsAg和/或HBeAg的量和/或活性。

本发明中，“HBsAg和/或HBeAg的量和/或活性”包括HBsAg的量、HBsAg的活性、HBeAg的量、HBeAg的活性中至少任何之一的含义，其可通过本领域已知的方法测定获得测量值。测定方法包括但不限于化学发光免疫分析、酶联免疫吸附测定、实时荧光定量PCR、基因芯片技术或免疫印迹等。

本发明中，样品的类型不限定，其实例包括但不限于组织样品或流体样品。组织样品包括体细胞样品，流体样品包括血液或其成分例如血浆、血清等。生物样品可以是任何哺乳动物来源的样品，优选为来源于人的样品。可用于本发明的生物样品类型的实例包括但不限于以下的一种或多种：尿、粪便、泪液、全血、血清、血浆、血液成分、骨髓、细胞、组织、器官、体液、唾液、脸颊拭子、淋巴液、脑脊髓液、病变渗出物和由身体产生的其他流体。生物样品也可以是冷冻、固定、石蜡包埋或新鲜的活检样品。

本发明中，涉及SNP检测方法不特别限定，可以采用以下方法中至少一种或它们的联合检测进行测定：聚合酶链反应PCR、毛细管电泳、质谱、单链构象多态性SSCP、电化学分析、变性HPLC及凝胶电泳、限制性片段长度多态性、单碱基延伸SBE、等位基因特异性引物延伸ASPE、限制酶消化、链置换扩增SDA、转录介导的扩增TMA、连接酶链反应LCR、基于核酸序列的扩增NASBA、引物延伸、滚环扩增RCA、自主序列复制3SR、环介导的等温扩增LAMP、核酸测序和微阵列。

在某些实施方案中，所述核酸测序选自由以下组成的组：Maxam-Gilbert测序、链终止方法、鸟枪测序、桥式PCR、单分子实时测序、离子半导体或离子流测序、合成测序、SOLiD测序、链终止或Sanger测序、大规模平行测序MPSS、聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、DNA纳米球测序、单分子实时测序、纳米孔DNA测序、隧穿电流DNA测序、杂交测序、质谱测序、微流体Sanger测序、基于显微镜的测序、RNAP测序和体外病毒高通量测序。

可以理解的是，本发明的组合物可以包含能够用于上述检测过程的任何合适的试剂，这些试剂的类型包括但不限于例如引物、探针或基因测序试剂。虽然本发明没有示出具体的核苷酸序列，但是本领域技术人员根据本发明公开的SNP位点可以设计并合成检测用的引物、探针等序列。

本发明的试剂除了上述试剂外还可包括其它成分。其它成分的实例包括但不限于稀释液、显色液、终止液、洗涤液等。在某些实施方案中，任何上述物质之一可以与其他物质分离的状态单独存在分别存放于不同的容器(例如，小瓶)中，只要在使用时它们能够相互接触即可。另外，优选地，任何两种以上的上述物质可混合作为混合物存在。

在某些实施方案中，其它成分可以溶液形式提供，例如水溶液的状态存在。在以水溶液状态存在的情况下，这些物质的浓度或量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，物质的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。

本发明中的试剂可被进一步制备为预测或评价干扰素抗病毒治疗效果的诊断剂。该诊断剂的形式或为诊断组合物、诊断试剂盒，或者多种单独存在的试剂组合使用的其他任何形式。

用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的系统

本发明提供一种用于预测干扰素药物治疗慢性乙型肝炎效果的系统，其包括：

数据获取单元，其设置为能够获取来自受试者的信息，所述信息包括以下SNP位点的信息：rs7519753、rs12021785、rs12030094、rs12026098和rs4653644中的至少一种，优选为rs7519753；

判断单元，其设置为判断rs7519753位点的信息，并且当该位点为CC和CT基因型时，则将干扰素药物判断为有效或HBsAg转阴率高，相反地，当rs7519753位点的信息不为CC和CT基因型，则将干扰素药物判断为对治疗慢性乙型肝炎没有效果或HBsAg转阴率低。

在一个优选的实施方案中，本发明的系统进一步包括SNP位点检测单元，其设置为能够与数据获取单元连通，并获取所述SNP位点检测单元产生的数据；所述SNP位点检测单元包括用于进行以下检测的单元之一：聚合酶链反应PCR、毛细管电泳、质谱、单链构象多态性SSCP、电化学分析、变性HPLC及凝胶电泳、限制性片段长度多态性、单碱基延伸SBE、等位基因特异性引物延伸ASPE、限制酶消化、链置换扩增SDA、转录介导的扩增TMA、连接酶链反应LCR、基于核酸序列的扩增NASBA、引物延伸、滚环扩增RCA、自主序列复制3SR、环介导的等温扩增LAMP、核酸测序和微阵列。

在一个优选的实施方案中，本发明的系统中的SNP位点检测单元包括能够进行以下核酸测序的单元：Maxam-Gilbert测序、链终止方法、鸟枪测序、桥式PCR、单分子实时测序、离子半导体或离子流测序、合成测序、SOLiD测序、链终止或Sanger测序、大规模平行测序MPSS、聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、DNA纳米球测序、单分子实时测序、纳米孔DNA测序、隧穿电流DNA测序、杂交测序、质谱测序、微流体Sanger测序、基于显微镜的测序、RNAP测序和体外病毒高通量测序。

可以理解的是，来自受试者的信息可选地包括其它临床信息，其实例包括但不限于受试者年龄、性别、基线血清ALT、AST、HBsAg和HBeAg水平信息等。

本发明的系统进一步包括输出单元，其用于输出干扰素药物对慢性乙型肝炎是否有效，或HBsAg转阴率高或低的预测结果。

在示例性实施方案中，本发明的系统体现为电子设备。电子设备可以通用计算设备的形式表现。电子设备的组件可以包括但不限于：至少一个处理器、至少一个存储器、连接不同系统组件(包括存储器和处理器)的总线。

本发明的存储器可以包括具有一组(至少一个)程序模块的程序/实用工具，这样的程序模块包括但不限于：操作系统、一个或者多个应用程序、其它程序模块以及程序数据，这些示例中的每一个或某种组合中可能包括网络环境的实现。

总线可以为表示几类总线结构中的一种或多种，包括存储器总线或者存储器控制器、外围总线、图形加速端口、处理单元或者使用多种总线结构中的任意总线结构的局域总线。

电子设备也可以与一个或多个外部设备(例如键盘、指向设备、蓝牙设备等)通信，还可与一个或者多个使得用户能与该电子设备交互的设备通信，和/或与使得该电子设备能与一个或多个其它计算设备进行通信的任何设备(例如路由器、调制解调器等等)通信。

这种通信可以通过输入/输出(I/O)接口进行。并且，电子设备还可以通过网络适配器与一个或者多个网络(例如局域网(LAN)，广域网(WAN)和/或公共网络，例如因特网)通信。网络适配器通过总线与电子设备的其它模块通信。应当明白，尽管本文未示出，可以结合电子设备使用其它硬件和/或软件模块，包括但不限于：微代码、设备驱动器、冗余处理单元、外部磁盘驱动阵列、RAID系统、磁带驱动器以及数据备份存储系统等。

实施例

一、样本及治疗方案

为了寻找到能够预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的SNP位点，本发明采用了一个两阶段的全基因组关联分析研究(GWAS)。本发明属于病例对照研究，纳入了138名经聚乙二醇干扰素α(Peg-IFNα)治疗实现HBsAg转阴的患者，与181名经同样治疗方案，HBsAg持续存在的慢乙肝患者。在GWAS第一阶段，共纳入了95名慢乙肝患者(48名实现HBsAg转阴和47名HBsAg持续阳性)，样本来源于首都医科大学附属北京佑安医院，所有患者均接受了Peg-IFNα单药治疗或Peg-IFNα和ADV的联合治疗。对95名患者的全基因组进行了测序，并通过全基因组关联分析寻找与HBsAg转阴相关的SNP。

在验证阶段，共纳入了224名在中山大学附属第三医院和首都医科大学附属北京佑安医院接受Peg-IFNα治疗的慢乙肝患者(90名实现HBsAg转阴和134名HBsAg持续阳性)。使用时间分辨飞行质谱法(MALDI-TOF)确定了样本的rs7519753基因型，基因分型结果示意图见下图1。

二、结果

(1)队列特性和全基因组关联分析

先前的研究表明，包括年龄、性别以及CHB患者的基线血清ALT、AST、HBsAg和HBeAg水平等因素，都可能影响Peg-IFNα治疗效果。为了最大限度地减少这些因素可能引起的偏倚，本发明招募了48名在Peg-IFNα治疗后实现了HBsAg清除的慢乙肝患者。通过匹配年龄、性别以及基线血清ALT、AST、HBsAg和HBeAg水平选择了47名在Peg-IFNα治疗后HBsAg持续阳性的患者。分析显示，两组之间在性别、年龄以及基线ALT、AST、HBsAg或HBeAg水平的分布上没有观察到显著差异(P>0.05)，这能够避免上述因素所引发的假阳性结果。

主成分分析(PCA)显示，所招募个体的遗传特性与均符合亚洲人种的遗传特性(图2)。两组样本不存在显著的种群分离，符合全基因组关联分析的要求(图2)。

(2)全基因组关联分析显示SNP rs7519753是与HBsAg清除相关的全基因组显著位点

全基因组关联分析显示，位于染色体1q41的rs7519753与Peg-IFNα治疗后与HBsAg转阴显著相关(P＝4.85×10

(3)验证队列证实rs7519753C等位基因有利于HBsAg的转阴

为了验证rs7519753与HBsAg转阴之间的关联，本发明纳入了另外两个队列，总共224名接受Peg-IFNα治疗的慢乙肝患者。第一个队列来自中山大学附属第三医院，包括40例HBsAg转阴的样本和79个HBsAg持续阳性样本(验证队列1)。第二个队列来自首都医科大学附属北京佑安医院，包括50个HBsAg转阴的样本和55个HBsAg持续阳性的样本(验证队列2)。值得注意的是，验证队列1的样本来自中国南方，而GWAS阶段的样本来自中国北方，用以验证rs7519753对不同地域的慢乙肝患者是否具有同样的预测价值。

结果显示，在两个验证队列中，HBsAg转阴组中的rs7519753CC和CT基因型的比例均显著高于HBsAg持续阳性组。对于验证队列1，P值为0.036，OR为1.646。同样，对于验证队列2，P值为0.027，OR为1.861。进一步通过结合GWAS阶段的样本和验证队列的样本进行了荟萃分析。荟萃分析得到的OR为2.31，P值为6.71×10

虽然在实施例中以rs7519753进行了说明，但是本领域技术人员根据本发明的教导，除了通过直接测定rs7519753的基因型外，还可以测定与rs7519753高度连锁的SNP，用以预测干扰素治疗慢性乙型肝炎的治疗效果，这其中包括但不仅限于rs12021785、rs12030094、rs12026098和rs4653644。上述SNP位点都与rs7519753连锁不平衡(表1)，现有的遗传学知识能够推测其与rs7519753有着同等或相近的预测价值。

表1：rs7519753与SNP间的连锁不平衡

本发明填补了临床上目前还缺少能够预测干扰素治疗慢性乙型肝炎治疗效果的遗传学分析标记的空白，本发明通过大量样本以及两阶段的全基因组关联分析，得到了能够预测干扰素治疗慢乙肝效果的SNP位点。在检测本发明的SNP位点时，可以通过全基因组测序、SNP芯片、PCR或质谱等方法实现，检测较为方便。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。