植物来源的胞外囊泡(EV)组合物及其用途

技术领域

本发明涉及植物来源的胞外囊泡(EV)组合物以及它们的治疗应用。

背景技术

胞外囊泡(EV)是通过几乎所有活细胞释放的非均一的颗粒群体。已从几乎所有哺乳动物细胞类型和体液以及低等真核生物、原核生物和植物纯化了它们。它们主要包括通过质膜出芽释放的微泡和来源于内体区室的外来体。胞外囊泡被称为“颗粒”、“微颗粒”、“纳米颗粒”、“微囊”和“外来体”。[

EV含有胞质蛋白、表面受体、某些脂质相互作用蛋白、DNA和RNA分子的复合物和不同的内容物(cargo)。通过输送它们的内容物，EV作为细胞间通讯的介体起关键作用。

在本文中，将未加载外源分子的处于它们的天然形式的可食用的植物来源的EV称为“天然EV”。

已知通过口服给予，天然EV对于白血病[WO2016166716A1]和结肠炎[Ju S,etal.Grape exosome-like nanoparticles induce intestinal stem cells and protectmice from DSS-induced colitis.Mol Ther.2013 Jul；21(7):1345-57.doi:10.1038/mt.2013.64]的治疗是有效的。

来源于葡萄、葡萄柚、姜和胡萝卜的天然纳米囊泡在慢性炎症性肠病中显示出抗炎作用[Zhang M,et al.Edible ginger-derived nanoparticles:A novel therapeuticapproach for the prevention and treatment of inflammatory bowel disease andcolitis-associated cancer.Biomaterials.2016Sept.；101:321-40.doi:10.1016/j.biomaterials.2016.06.018；Ju S,et al.Grape exosome-like nanoparticles induceintestinal stem cells and protect mice from DSS-induced colitis.Mol Ther.2013Jul；21(7):1345-57.doi:10.1038/mt.2013.64]。

WO2017/052267公开了在皱纹形成、保湿、美白、上皮细胞增殖和胶原蛋白沉积方面，局部给予的可食用的天然植物来源的EV促进皮肤改善的使用。

据本发明人所知，现有技术未公开当局部给予于以缺血和血管生成受损或者对细菌感染暴露增加为特征的病灶和皮肤病变时，植物来源的EV对血管生成和细菌存活力的影响。

由于EV天然保护并将它们的内容物输送至靶细胞，它们代表了输送治疗剂的合成和外源颗粒，如脂质体、阳离子纳米颗粒、EV模拟纳米囊泡和基于多肽的囊泡的有用替代。EV可以利用它们的天然作用机制并克服组装颗粒的一些限制，包括免疫原性、毒性、外源颗粒的给予、有限的细胞吸收和颗粒的化学组装。

近年来，已研究了多种技术来将不同的分子(RNA、DNA、药物)输送至EV。EV结合的核酸受到保护以耐受微环境中存在的降解酶并可以被递送至靶细胞。旨在将分子引入EV的方法包括电穿孔、超声、转染、温育、细胞挤出、皂苷介导的透性化和冻融。

WO2017/004526A1公开了来源于葡萄、葡萄柚的微囊作为用作抗癌药或用于诊断的示踪剂的miR18a和miR17的载体的使用。

为了克服现有技术的限制和缺点，如所附的独立权利要求中所定义的，本发明提供了包含植物来源的胞外囊泡(EV)群体的组合物以及用于将一种或多种生物活性分子加载到植物来源的胞外囊泡(EV)群体中的方法。从属权利要求指定了要求保护的组合物和方法的其它有利特征。所附权利要求的主题形成了本发明的描述的组成部分。

具体实施方式

本发明涉及包含植物来源的胞外囊泡(EV)群体的组合物，其中通过脂质双层膜包围或限定所述群体中的植物来源的胞外囊泡(EV)，并且特征在于它们具有10至500nm的直径，1至55ng/10

如本文所使用的，术语“植物来源的胞外囊泡”或者“植物来源的EV”是指来源于植物细胞的纳米颗粒，其通过磷脂双分子层限定或包封并且其携带有源自它们所来源的细胞的脂质、蛋白、核酸及其它分子。通常，胞外囊泡的直径在10-1000nm的范围内。

本发明利用了选择的植物来源的胞外囊泡(EV)群体，其具有10至500nm的范围，优选地20至400nm的范围，更优选地25至350nm的范围内的直径。在本发明中使用的植物来源的胞外囊泡可以是天然EV或工程化EV，如以下实例中所说明的。

表述“蛋白含量”和“RNA含量”涵盖了在本发明中使用的EV的内部含量和膜含量两者。

在本发明中使用的EV中的脂质的实例包括(但不限于)24-亚丙基胆固醇、β谷甾醇、菜油甾醇、二棕榈酸甘油酯、二十烷醇和/或缩水甘油硬脂酸酯。

在本发明的其它优选实施方式中，EV群体来源于选自以下组成的组的植物：芸香科(Rutaceae)，如柑桔属(genus Citrus)；蔷薇科(Rosaceae)，如苹果(Malus pumila)；葡萄科(Vitaceae)，如葡萄(Vitis vinifera)；十字花科(Brassicaceae)，如含生草(Anastatica hierochuntica)；卷柏科(Selaginellaceae)，如鳞叶卷柏(Selaginellalepidophylla)；菊科(Asteraceae)，如金盏花(Calendula officinalis)；木犀科(Oleaceae)，如油橄榄(Olea europaea)；刺叶树科(Xanthorrhoeaceae)，如芦荟(Aloevera)；莲科(Nelumbonaceae)，如莲属(Nelumbo)；五甲科(Araliaceae)，如人参亚属(subgenus Panax)；唇形科(Lamiaceae)，如熏衣草属(Lavandula)；金丝桃科(Hypericaceae)，如贯叶金丝桃(Hypericum perforatum)；脂麻科(Pedaliaceae)，如南非钩麻(Harpagophytum procumbens)；银杏科(Ginkgoaceae)，如银杏(Ginkgo biloba)；胡椒科(Piperaceae)，如风藤(Piper kadsura)或风藤(Piper futokadsura)；茜草科(Rubiaceae)，如白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)。柑桔属(genus Citrus)的植物的非限制性实例是柠檬、橙子(orange)、橘子(tangerine)、小柑桔(clementine)、香柠檬、香橼(pompia)。

本发明的范围包括含有来源于单一植物物种的EV的组合物和含有来源于多种植物物种的EV的组合物两者。

在本发明中使用的EV的特征在于它们显示出促血管生成和抗细菌活性。

在本发明的描述内，表达“促血管生成作用”旨在作为内皮细胞增殖或通过内皮细胞的血管形成的促进和促血管生成介体的体外或体内释放的提高。血管生成是基本生物过程并且其损伤涉及一些疾病的病理发生，该疾病包括缺血性溃疡，如压力性溃疡、动脉性溃疡、静脉性溃疡、糖尿病性溃疡、缺血性溃疡、渗出性溃疡、代谢不良性溃疡、创伤性溃疡、灼伤、瘘、银屑病、角化病、角膜炎、灼伤、瘘、裂、粘膜病变(如由于假体等造成的创伤性病变、糖尿病性病变、口腔病变、褥疮性粘膜病变、生殖器粘膜病变)、角膜受损/眼部疾病(包括溃疡、创伤性损伤、退行性损伤、擦伤、化学损伤、隐形眼镜问题、紫外损伤、角膜炎)、干眼、结膜炎、皮炎(包括痤疮、湿疹、脂溢性皮炎、特应性皮炎、接触性皮炎、出汗障碍性湿疹、神经性皮炎、疱疹样皮炎)、雄激素性脱发、瘙痒、通过旨在治疗癌前病变(例如，光化性角化病)的促凋亡药物所引起的细胞损害。因此，在本发明中使用的EV在这些疾病的治疗中特别有用。在本发明中使用的具有促血管生成作用的天然植物来源的胞外囊泡优选地来源于柑桔植物：柠檬、橙子、橘子、小柑桔、香柠檬、香橼；芸香科(Rutaceae)，如柑桔(Citrus)；蔷薇科(Rosaceae)，如苹果(Malus pumila)；葡萄科(Vitaceae)，如葡萄(Vitis vinifera)；十字花科(Brassicaceae)，如含生草(Anastatica hierochuntica)；鳞叶卷柏(Selaginellalepidophylla)；菊科(Asteraceae)，如金盏花(Calendula officinalis)；木犀科(Oleaceae)，如油橄榄(Olea europaea)；刺叶树科(Xanthorrhoeaceae)，如芦荟(Aloevera)、莲科(Nelumbonaceae)，如莲属(Nelumbo)；五甲科(Araliaceae)，如人参亚属(subgenus Panax)；唇形科(Lamiaceae)，如熏衣草属(Lavandula)；金丝桃科(Hypericaceae)，如贯叶金丝桃(Hypericum perforatum)；脂麻科(Pedaliaceae)，如南非钩麻(Harpagophytum procumbens)；银杏科(Ginkgoaceae)，如银杏(Ginkgo biloba)；胡椒科(Piperaceae)，如风藤(Piper kadsura)或风藤(Piper futokadsura)；茜草科(Rubiaceae)，如白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)。

在本发明的描述内，表达“抗微生物作用”旨在表示能够杀死微生物、杀微生物的、或者能够抑制细菌生长、生物抑制的任何作用。细菌感染是常见的并且引起疾病和创伤并发症，其包括粘膜病变(如由于假体等所造成的创伤性病变、糖尿病性病变、口腔病变、褥疮性粘膜病变、生殖器粘膜病变)、感染性病变(如病毒感染、疱疹感染、细菌感染)、溃疡(包括糖尿病性、动脉性、静脉性、代谢不良性、渗出性、缺血性、压力)、灼伤、瘘、角膜损伤/眼部疾病(包括溃疡、创伤性损伤、退行性损伤、擦伤、化学损伤、隐形眼镜问题、紫外损伤、角膜炎)、干眼、结膜炎、皮炎(包括痤疮、湿疹、脂溢性皮炎、特应性皮炎、接触性皮炎、出汗障碍性湿疹、神经性皮炎、疱疹样皮炎)、创伤性溃疡、通过旨在治疗癌前病变(如光化性角化病)的促凋亡药物所引起的细胞损害。因此，在本发明中使用的EV在这些疾病的治疗中特别有用。

在本发明中使用的具有抗微生物作用的植物来源的胞外囊泡优选地来源于柑桔植物：柠檬、橙子、橘子、小柑桔、香柠檬、香橼；芸香科(Rutaceae)，如柑桔(Citrus)；蔷薇科(Rosaceae)，如苹果(Malus pumila)；葡萄科(Vitaceae)，如葡萄(Vitis vinifera)；十字花科(Brassicaceae)，如含生草(Anastatica hierochuntica)；鳞叶卷柏(Selaginellalepidophylla)；菊科(Asteraceae)，如金盏花(Calendula officinalis)；木犀科(Oleaceae)，如油橄榄(Olea europaea)；刺叶树科(Xanthorrhoeaceae)，如芦荟(Aloevera)、莲科(Nelumbonaceae)，如莲属(Nelumbo)；五甲科(Araliaceae)，如人参亚属(subgenus Panax)；唇形科(Lamiaceae)，如熏衣草属(Lavandula)；金丝桃科(Hypericaceae)，如贯叶金丝桃(Hypericum perforatum)；脂麻科(Pedaliaceae)，如南非钩麻(Harpagophytum procumbens)；银杏科(Ginkgoaceae)，如银杏(Ginkgo biloba)；胡椒科(Piperaceae)，如风藤(Piper kadsura)或风藤(Piper futokadsura)；茜草科(Rubiaceae)，如白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)。

如以上所提及的，本发明的范围还包括用于将一种或多种带负电荷的生物活性分子加载到如上定义的植物来源的胞外囊泡(EV)群体中的方法。与一种或多种带负电荷的生物活性分子一起加载的所产生的EV应在下文中称为“加载的EV”。

本发明的方法基于通过带负电荷的EV和带负电荷的生物活性分子之间的聚阳离子物质的桥连。表述“带负电荷的生物活性分子”包括(但不限于)药物、核酸分子和脂溶分子，如脂溶性维生素。核酸分子包括(但不限于)DNA和RNA分子，其包括例如miRNA、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、调控RNA、非编码和编码RNA、DNA片段、DNA质粒。从本发明的方法产生的加载的EV能够保护加载的生物活性分子不被降解并将它们输送至靶细胞。加载的生物活性分子优选地具有治疗潜能。

本发明的方法包括将如上定义的植物来源的胞外囊泡(EV)群体与聚阳离子物质和带负电荷的生物活性分子接触并共温育。在共温育后，从聚阳离子物质和剩余的游离的带负电荷的活性分子中纯化EV。

在第一实施方式中，将EV首先与聚阳离子物质接触并共温育以使得聚阳离子物质结合至EV表面，然后将EV和聚阳离子物质的混合物与带负电荷的活性分子接触并共温育。

在第二实施方式中，将聚阳离子物质和带负电荷的活性分子混合在一起，然后添加至EV。

根据优选的实施方式，聚阳离子物质选自由鱼精蛋白、聚赖氨酸(polylisine)、阳离子葡聚糖、其盐及其组合组成的组。优选的鱼精蛋白盐是鱼精蛋白盐酸盐。

如以上所提及的，在加载后纯化EV。适合的纯化技术包括但不限于梯度超速离心、超滤、透滤、切向流过滤、基于沉淀的方法、基于色谱的方法、浓缩、基于免疫亲和捕获的技术和基于微流体的分离技术。

如将在以下实验部分中说明的，本发明人将EV与合成miRNA分子加载，然后通过miRNA分子已引入EV的qRT-PCR分析验证。通过qRT-PCR分析和共聚焦显微镜检查，本发明人还验证miRNA加载的EV能够将它们的内容物有效输送至靶细胞。植物中不存在的哺乳动物miRNA的使用使得能够有效评价加载。此外，据显示输送至靶细胞的miRNA是生物学活性的，并且影响靶mRNA在细胞中的表达。

如以上所提及的，从本发明的方法产生的加载的EV可以用于通过EV运输一些带负电荷的生物活性分子。例如，miRNA参与生理学和病理学过程两者中不同的重要关键途径。例如，科学文献报道一些miRNA在本质上参与了癌症血管生成和再生过程。作为所述方法的效力的证实，EV有效加载了促再生miRNA，如miR-21和miR-126，以及抗血管生成和抗-肿瘤miRNA或miRNA抑制剂。与天然EV相比，加载的EV显示并提高了效力。

因此，本发明的方法可以用于产生具有提高的治疗效果(包括促血管生成和抗细菌性)的加载的EV，或者出于促再生目的为天然EV添加新的治疗活性，包括(但不限于)抗血管生成效果。

可替换地，本发明的方法可以用于产生具有特异性调节的生物效果的加载的EV，例如，消除的促血管生成效果，同时不影响抗细菌性质，反之亦然。

本发明的方法还可以用于调节EV的固有生物效果以获得具有选择的定制的且具体所需的生物活性的加载的EV。

本发明的方法可以用于产生含有一种或多种外源分子的加载的EV或者富含生物学活性的内源化合物的加载的EV。可选地，可以使用旨在将分子引入EV内部的任何规程，包括电穿孔、超声、转染、温育、细胞挤出、皂苷介导的透性化和冻融循环，将本发明的方法用于改善EV加载效力。举例来说，本发明人显示与电穿孔有关的基于鱼精蛋白的EV加载能够提高载量。

本发明的方法还可以与加载脂溶分子的植物来源的EV的加载组合使用。

因此，本发明涵盖了植物来源的EV的加载以增强它们对细胞再生的天然作用。可以通过加载脂溶分子，如抗氧化维生素来提高植物来源的EV的有益影响。将处于它们的天然或修饰形式的脂溶分子有效引入EV。因此，可以将植物来源的EV加载抗氧化分子，如维生素A和E，以提高它们的有益影响。

基于靶向位点，天然和加载的EV可以几种方式给予。对于皮肤和外部粘膜修复，可以局部给予EV，然而口服给予是优选的以达到消化系统。

因此，可以作为配制为例如用于局部施加、局部注射或口服给予的药物组合物提供，或者可以作为食品补充制剂提供包含如上定义的植物来源的EV的群体的本发明所述的组合物，其中EV是天然的或加载了外源或内源带负电荷的生物活性分子。

本发明的组合物还可以包含适合的基质以引起EV向受损伤或疾病组织的控制释放，以稳定EV和/或提高它们的治疗效果。

要在本发明中使用的适合的基质能够包封EV并在注射或皮肤应用的情况下以受控方式释放它们，或者能够起到生物活性分子的惰性载体的作用。适合的基质包括(但不限于)支架、薄膜、水凝胶、水胶体、膜、泡沫、纳米纤维、凝胶和海绵。为了帮助EV基质递送，可以将制剂与医疗装置，如贴片、外科用缝线、纱布组合。

通常，配制用于局部施加或局部注射的本发明的组合物对于促进其中组织受血管生成受损影响或暴露于细菌感染的组织修复是特别有用的。例如，当受损害的组织显示出血管生成受损或暴露于微生物感染时，本发明提供了植物来源的胞外囊泡作为促进对受损害的组织和细胞修复的治疗效果的治疗性表面处理的适用性。

包含天然或加载的植物来源的EV(其中EV具有促血管生成活性)的根据本发明的组合物对于溃疡，如压力性溃疡、动脉性溃疡、静脉性溃疡、缺血性溃疡、糖尿病性溃疡、渗出性溃疡、代谢不良性溃疡、灼伤、瘘、裂和皮肤疾病，包括银屑病、皮炎、痤疮、湿疹、脂溢性皮炎、特应性皮炎、接触性皮炎、出汗障碍性湿疹、神经性皮炎、疱疹样皮炎、角化病、角膜炎、角膜受损/眼部疾病(包括溃疡、创伤性损伤、退行性损伤(degeneration injuries)、擦伤、化学损伤、隐形眼镜问题、紫外损伤、角膜炎)、干眼、结膜炎、雄激素性脱发、瘙痒的治疗性处理是特别有用的。

包含天然或加载的植物来源的EV(其中EV具有抗细菌活性)的根据本发明的组合物对于粘膜病变(如由于假体等所造成的创伤性病变、糖尿病性病变、口腔病变、褥疮性粘膜病变、生殖器粘膜病变)、感染性病变(如病毒感染、疱疹感染、细菌感染)、溃疡(包括糖尿病性、动脉性、静脉性、代谢不良性、渗出性、缺血性、压力)、灼伤、瘘、裂、角膜损伤和眼部疾病(包括溃疡、创伤性损伤、退行性损伤、擦伤、化学损伤、紫外损伤、角膜炎)、干眼、结膜炎、皮炎(包括痤疮、湿疹、脂溢性皮炎、特应性皮炎、接触性皮炎、出汗障碍性湿疹、神经性皮炎、疱疹样皮炎)、通过旨在治疗癌前病变(例如，光化性角化病)的促凋亡药物所引起的细胞损害的治疗是特别有用的。

本发明的药物组合物的剂量可以基于多种因素改变，包括使用的具体化合物的活性、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给予时间、给予途径、排泄速率、药物组合和要预防或治疗的具体疾病的严重程度，并且可以基于患者状态、体重、疾病严重程度、药物形式、给予途径和给予时期，适当地通过本领域技术人员确定。

可以将根据本发明的药物组合物配制为丸剂、糖衣片剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆、浆液或悬浮液。

配制用于局部递送的根据本发明的药物组合物对于提高组织再生和细胞修复是有效的。这种递送系统确保了EV向病变位点的局部有效且时间受控的释放。此外，递送系统还可以确保EV制剂的稳定和储存。用于天然或加载的EV的局部递送的这些药物组合物可以含有适合于要治疗的位点和病变种类的水胶体/水凝胶基质。制剂旨在提高细胞和/或组织修复。可以调节含有基质的组合物以满足关心的病变(渗出液、灼伤、干燥病变、粘膜溃疡、缝合的存在)的要求。基质本身还可以支持EV的治疗效果并且包裹并提高EV的稳定性。基质在室温下可以是固体/明胶或液体，并且优选地包括水胶体/水凝胶基质。可以通过一些化合物(或它们的化学修饰)和/或它们的组合产生基质，并且基质包括(但不限于)壳聚糖、明胶、羟基磷灰石、胶原蛋白、纤维素、透明质酸、纤维蛋白、海藻酸盐、环糊精、淀粉、葡聚糖、琼脂糖、硫酸软骨素、普鲁兰糖、鱼精蛋白、果胶、甘油磷酸酯和肝素合成聚合物，如聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乙烯醇)[PVA]、聚己酸内酯[PCL]、聚(D,L-乳酸)(PDLLA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)[PNIPAAm]和共聚物，如聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PDLLGA)。这些分子可以以它们的天然或化学修饰形式使用。可以单独或组合使用这些组分。

另外，根据常规方法，配制用于天然或修饰的EV的局部递送的本发明的药物组合物可以含有适合的赋形剂、防腐剂、溶剂或稀释剂。赋形剂、防腐剂、溶剂或稀释剂包括(但不限于)乳糖、琼脂、葡萄糖、蔗糖、二醇、山梨糖醇、三氯生、苯甲醇、甘露糖醇、丙二醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、对羟苯甲酸、阿拉伯树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、水杨酸、微晶纤维素、山梨酸、克辽林(creolin)、聚乙烯吡咯烷酮、季铵阳离子、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、硼酸、海藻酸、甲羟基苯甲酸酯、甘油、丙羟基苯甲酸酯、吡啶硫酮锌、滑石、亚硫酸盐、硬脂酸镁、苯甲酸、矿物油、丙酸、氯代丁醇、填充剂、膨胀剂、粘结剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、丙二醇、聚乙二醇、植物油剂，如橄榄油、油酸乙酯、witepsol、Macrogol、吐温(Tween)、可可脂、月桂酸甘油酯(laurin fat)、甘油明胶、纯水、油剂、蜡、脂肪酸、脂肪酸醇、脂肪酸酯、表面活性剂、稀释剂、增稠剂、抗氧化剂、粘度稳定剂、螯合剂、缓冲剂、低级醇、维生素、UV阻挡剂、香料、染料、抗生素、抗菌剂或抗真菌剂等。这些分子可以以它们的天然形式或具有化学修饰使用。可以单独或组合使用这些组分。

与基质组合或未组合的天然或加载的植物来源的EV群体还可以在适合作为可食用的膳食补充剂的食品补充制剂中用作活性化合物。EV的治疗性质可以支持胃肠道中的细胞更新。

因此，本发明还涵盖了含有天然或加载的植物来源的EV的可食用制剂，EV优选地来源于十字花科(Brassicaceae)，如含生草(Anastatica hierochuntica)；鳞叶卷柏(Selaginella lepidophylla)；菊科(Asteraceae)，如金盏花(Calendula officinalis)；木犀科(Oleaceae)，如油橄榄(Olea europaea)；刺叶树科(Xanthorrhoeaceae)，如芦荟(Aloe vera)、莲科(Nelumbonaceae)，如莲属(Nelumbo)；五甲科(Araliaceae)，如人参亚属(subgenus Panax)；唇形科(Lamiaceae)，如熏衣草属(Lavandula)；金丝桃科(Hypericaceae)，如贯叶金丝桃(Hypericum perforatum)；脂麻科(Pedaliaceae)，如南非钩麻(Harpagophytum procumbens)；银杏科(Ginkgoaceae)，如银杏(Ginkgo biloba)；胡椒科(Piperaceae)，如风藤(Piper kadsura)或风藤(Piper futokadsura)；茜草科(Rubiaceae)，如白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)。

可以以几种口服可给予形式配制食品补充制剂，其包括粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气溶胶。另外，本发明的膳食补充剂可以含有多种营养物、维生素、矿物质(电解质)、调味剂，如合成调味剂和天然调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳化剂，如在碳酸饮料中所使用的等。可以单独或组合使用这些组分。

本发明的食品补充制剂还可以含有本领域技术人员已知的适合的赋形剂、防腐剂、溶剂或稀释剂。赋形剂、防腐剂、溶剂或稀释剂包括(但不限于)乳糖、琼脂、葡萄糖、蔗糖、二醇、山梨糖醇、三氯生、苯甲醇、甘露糖醇、丙二醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、对羟苯甲酸、阿拉伯树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、水杨酸、微晶纤维素、山梨酸、克辽林(creolin)、聚乙烯吡咯烷酮、季铵阳离子、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、硼酸、海藻酸、甲羟基苯甲酸酯、甘油、丙羟基苯甲酸酯、吡啶硫酮锌、滑石、亚硫酸盐、硬脂酸镁、苯甲酸、矿物油、丙酸、氯代丁醇、填充剂、膨胀剂、粘结剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、丙二醇、聚乙二醇、植物油剂，如橄榄油、油酸乙酯、witepsol、Macrogol、吐温(Tween)、可可脂、月桂酸甘油酯(laurin fat)、甘油明胶、纯水、油剂、蜡、脂肪酸、脂肪酸醇、脂肪酸酯、表面活性剂、稀释剂、增稠剂、抗氧化剂、粘度稳定剂、螯合剂、缓冲剂、低级醇、维生素、UV阻挡剂、香料、染料、抗生素、抗菌剂或抗真菌剂等。这些分子可以以天然形式或具有化学修饰使用。可以单独或组合使用这些组分。

仅通过说明提供了以下实验部分并且本实验部分不意欲限制如所附权利要求中所定义的本发明的范围。在以下实验部分中，参考了附图，其中：

图1显示了实验实施例1中对于来源于A)柠檬、B)橙子、C)葡萄、D)含生草(Anastatica hierochuntica)和E)鳞叶卷柏(Selaginella lepidophylla)的EV的天然植物来源的EV的表征。EV的Nanosight分析的代表性图像和透射电子显微照片(原始放大倍数：×40,000和×120,000)显示了EV的典型尺寸。

图2显示了实验实施例1中分离自苹果、柠檬、橙子、葡萄、含生草(Anastaticahierochuntica)和鳞叶卷柏(Selaginella lepidophylla)的天然植物来源的EV的蛋白质含量，其表示为10

图3显示了通过实验实施例2中的天然植物来源的EV介导的体外内皮细胞迁移的促进结果。图表显示了通过划伤测试测量的，与对照细胞(CTR)相比的伤口闭合百分比(平均值±SEM)。用3种不同剂量的天然橙子来源的EV处理细胞：10,000个EV/细胞(EV 10k)、50,000个EV/细胞(EV 50k)、100,000个EV/细胞(EV 100k)。对于每个数据组进行N＝4次实验，并且将10μM的内皮生长因子(EGF)用作阳性对照。将每个条件与CTR相比，计算统计显著性。p：*<0.05；**<0.01；***<0.005；****<0.001。

图4显示了实验实施例2中天然植物来源的EV促进血管生成的能力的结果。用来源于柠檬、橙子、葡萄、含生草(Anastatica hierochuntica)(AH)和鳞叶卷柏(Selaginellalepidophylla)(SL)的EV刺激内皮细胞(100,000个EV/细胞)，并进行血管形成测定。对于每个数据组进行N＝4次实验，并且将10μM的血管内皮生长因子(VEGF)用作阳性对照。将每个条件与CTR相比，计算统计显著性。p：*<0.05；**<0.01；***<0.005；****<0.001。

图5显示了实验实施例2中天然植物来源的EV对缺氧刺激的内皮细胞的细胞增殖的促进结果。将内皮细胞在缺氧条件下温育24h，然后用3种不同剂量的橙子来源的EV(10,000(10k)或30,000(30k)或50,000(50k)或100,000(100k)个EV/细胞)处理另外24h。通过BrdU掺入测试增殖，并通过比较相对于对照细胞(CTR)的变化倍数进行分析。将10μM EGF用作阳性对照(CTR+)。将每个条件与CTR相比，计算统计显著性。p：*<0.05；**<0.01；***<0.005；****<0.001。

图6显示了实验实施例4中天然植物来源的EV在人中的体内治疗效果的结果。将天然橙子来源的EV用于治疗通过用于癌前病变光化性角化病的局部治疗的巨大戟醇甲基丁烯酸酯(巨大戟醇-3-当归酸酯，Picato)所引起的皮肤损害。显示了组织病变的代表性图象：与3天之前(图6C)和之后(图6D)未治疗的病变相比，治疗3天之前(图6A)和之后(图6B)的病变。

图7显示了实验实施例5中EV电荷测量的结果。测量了来源于橙子的天然EV(EV)和用鱼精蛋白1.0μg/ml工程化的EV(EV+鱼精蛋白)中的Z电位(mV)，颗粒电荷指数。结果来源于3次实验重复。p：****<0.001。

图8显示了实验实施例5中的EV修饰方法。本发明在于使用带正电荷的分子(如鱼精蛋白)作为带负电荷的生物活性分子(例如miRNA)结合的桥以使分子集中在EV表面上。

图9显示了实验实施例5中加载的EV中miRNA存在的结果。通过天然橙子来源的EV(EV CTR)、用鱼精蛋白工程化的EV和合成人miRNA，miR-145、miR-221或miR-223(EV+PROT+miR-145/miR-221/miR-223)的qRT-PCR分析所获得的扩增图。将miRNA的表达表示为ΔRn，其是来源于miRNA扩增的信号幅度相对于循环次数。

图10显示了实验实施例5中在RNA酶处理后工程化分子(miRNA)的保护结果。用生理学浓度的RNA酶(0,2μg/ml)处理用miRNA miR-221工程化的橙子来源的EV并在对照天然EV(EV)、作为用鱼精蛋白和miRNA工程化的EV的加载的EV(EV+PROT+miR-221)和游离miRNA(miR-221)中通过qRT-PCR评价了miRNA表达。作为原始Ct(A)和相对于未处理的样品的抑制百分比(B)报告数据。p：****<0.001。

图11显示了实验实施例6中使用共聚焦显微镜检查的EV在靶细胞中的掺入。用荧光标记的加载的橙子来源的EV(30,000个EV/细胞)处理内皮细胞(TEC)不同时间(30min.6小时)并通过共聚焦显微镜检查分析以检测它们在靶细胞中的进入。显示了用染色的EV(EVCTR)或用标记的EV处理30分钟和6小时的细胞的代表性显微照片。分别用红色-PKH26、绿色-FITC、蓝色-DAPI对EV膜、miRNA、细胞核染色。(原始放大倍数：×630)

图12显示了实验实施例6中加载的miRNA在靶细胞中的直接输送及其功能性。用正常培养基(CTR)、天然橙子来源的EV(EV)、用鱼精蛋白和miRNA miR-221(EV+PROT+mimic-221)或混杂miRNA(scramble miRNA)(EV+PROT+混杂)或antimiR-29a(EV+PROT+antimir-29a)工程化的加载的橙子来源的EV(30,000个EV/细胞)培养内皮细胞(TEC)。A)使用RNU6B作为miRNA管家并将无刺激培养的细胞作为对照，通过qPT-PCR分析评价靶细胞中miRNA(miR-221)的输送。数据表示为RQ值并与CTR相比较。B)在用miRNA(antimir-29a)工程化的EV处理后，对Collagen4A3 mRNA靶标的影响。72小时后，评价miRNA对其靶mRNA Collagen4同工型A3的活性。将细胞与antimiR-29a(EV+PROT+antimir-29a)工程化的加载的EV(30,000个EV/细胞)或者正常培养基(CTR)共温育并通过qRT-PCR评价胶原4A3的表达。数据表示为RQ值。数据表示为RQ值并与CTR相比较。p：***<0.005。

图13显示了实验实施例7中对用逐渐降低的剂量的鱼精蛋白工程化的加载的EV的尺寸分析。对照天然橙子来源的EV(EV CTR)、用鱼精蛋白(初始剂量，1.0μg/ml)和较低剂量：1.0ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml工程化的加载的EV的Nanosight分析。在与miRNA(miR-221)共温育后，将EV分析评价为加载的EV的平均A)模式B)尺寸。将数据与EV CTR(天然EV)相比较。p：*<0.05。

图14显示了实验实施例7中在工程化后加载的EV中的miRNA表达以及使用低剂量的鱼精蛋白，EV在靶细胞中的掺入的结果。A)使用低剂量的鱼精蛋白(1.0ng/ml)和miRNAmiR-221工程化的加载的橙子来源的EV以及对于它们的外源miRNA的含量的分析。使用RNU6B作为管家基因并用天然EV(EV CTR)归一化，将通过qRT-PCR分析获得的数据显示为RQ值。p：**<0.01。B)用鱼精蛋白(1.0ng/ml)和miRNA miR-221或混杂miRNA工程化加载的橙子来源的EV，并将其与内皮细胞(TEC)共温育24小时。通过qRT-PCR在靶细胞中测量加载的miRNA的存在，并在与正常培养基(CTR)、正常天然EV(EV)或者使用鱼精蛋白和混杂miRNA(EV+PROT+混杂)或miR-221(EV+PROT+miR-221)工程化的加载的EV一起培养的细胞中表示为RQ。p：*<0.05。

图15显示了实验实施例8中在用促再生miRNA工程化后，天然植物来源的EV的治疗效果的改善。该图显示了角化细胞迁移的增强并且显示了与对照细胞(CTR)相比的伤口闭合百分比(平均值±SEM)。用3种不同剂量的天然橙子来源的EV：10,000个EV/细胞(EV10k)、50,000个EV/细胞(EV 50k)、100,000个EV/细胞(EV 100k)；以及5,000个EV/细胞的剂量的加载的EV加鱼精蛋白(1.0ng/ml)(EV+P)和加载的EV加鱼精蛋白和miR-21(EV+miR-21)处理细胞。将EGF(10μM)用作阳性对照。对每个数据组进行N＝4次实验。将每个条件与CTR相比，计算统计显著性。

图16显示了实验实施例9中在用miRNA工程化后，通过加载的EV的新的生物学功能的获得。使用血管生成测定，对用几种抗血管生成miRNA工程化的加载的橙子来源的EV测试了内皮细胞(TEC)的血管形成。将TEC与正常培养基(CTR)、天然EV(EV)、用鱼精蛋白工程化的加载的EV(EV+鱼精蛋白)或者用鱼精蛋白(1.0ng/ml)和合成抗血管生成miRNA(对于促血管生成miRNA，antimiR并且对于抗血管生成miRNA，miR)修饰的加载的EV一起培养。混杂miRNA是对照miRNA。在处理24小时后，测量血管总长并报告与正常细胞(CTR)相比的总长百分比。p：*<0.05，**<0.01，***<0.005，****<0.001。

图17显示了实验实施例10中用两个不同剂量的鱼精蛋白工程化的加载的EV的生物活性结果。用初始(1.0μg/ml)或较低(1.0ng/ml)的量的鱼精蛋白和不同的抗血管生成miRNA(antimiR-29a、miR-145、miR-221)工程化橙子来源的EV。将加载的EV用于处理内皮细胞(TEC)并与对照细胞(CTR)和与天然EV培养的细胞(EV)相比评价血管形成。将总长报告为相对于对照细胞的百分比。p：*<0.05，***<0.005，****<0.001。

图18显示了实验实施例11中使用本专利中描述的修饰方法并添加常见的转染方法的分子内化的增强。在转染规程如电穿孔之后，带负电荷的分子(如miRNA)与EV的结合提高了EV表面上的分子数目并且提高了它们的载量。事实上，EV表面上分子数目的增加使得在有利于EV内部miRNA翻转的膜重排之后提高EV内部的载量。

图19显示了实验实施例11中使用本专利中描述的修饰方法和常见转染方法的添加的组合的工程化增强结果。将内皮细胞(TEC)刺激24小时并使用血管生成测定测量血管形成。刺激为正常培养基(CTR)、天然橙子来源的EV(EV)、使用鱼精蛋白(1.0ng/ml)和miRNAmiR-221工程化的加载的EV(EV+PROT+miR-221)、用miR-221电穿孔的EV(EV+miR-221电穿孔)以及用鱼精蛋白(1.0ng/ml)和miRNA miR-221修饰后电穿孔的加载的EV(EV+PROT-miR-221电穿孔)。将血管形成评价为与正常细胞(CTR)相比的血管形成百分比。p：*<0.05，**<0.01。

材料和方法

胞外囊泡分离

从植物汁液分离胞外囊泡。压榨果实，并使用逐渐减小的孔径顺序过滤汁液以除去纤维。然后，通过超速离心纯化EV。对于差速超速离心，首先将汁液以1,500g离心30分钟以除去碎片及其它污染物。然后，通过先以10,000g离心，然后在4℃以100,000g超速离心1小时(Beckman Coulter Optima L-90K,Fullerton,CA,USA)来纯化EV。用添加了1％DMSO的磷酸盐缓冲盐水使最终粒料再悬浮，并通过0.22微米过滤器过滤灭菌。使用胞外囊泡或者在-80℃长期储存。通过纳米颗粒追踪分析和电子显微镜鉴定纯化的EV。

纳米颗粒追踪分析(NTA)

使用配备有405nm激光器和NTA 3.1分析软件的NanoSight LM10系统(NanoSightLtd.,Amesbury,UK)，将纳米颗粒追踪分析(NTA)用于限定EV尺寸和轮廓。通过照相机记录经受激光源的样品中存在的EV的布朗运动并通过斯托克斯-爱因斯坦方程(Stokes-Einstein equation)，通过NTA将其转化为尺寸和浓度参数。相机水平16用于所有采集，并且对于每个样品，记录5段30s持续时间的视频。简要地，将纯化的EV和工程化的EV在1ml无囊泡的盐溶液(Fresenius Kabi,Runcorn,UK)中稀释(分别1:1000和1:200)。优化NTA采集后设置并在所有样品中保持恒定，然后分析每个视频以测量EV平均值、模式和浓度。

透射电子显微术

通过将EV加载到200目镍弗姆瓦碳包覆的网格(Electron Microscopy Science,Hatfield,PA)上20min来实施EV的透射电子显微术。然后，用含有2.5％戊二醛和2％蔗糖的溶液固定EV并在蒸馏水中反复冲洗，用NanoVan(Nanoprobes,Yaphank,NK,USA)对样品负染色并通过Jeol JEM 1010电子显微镜检验。

细胞培养

通过用猿猴病毒40对原代人皮肤微血管内皮细胞的永生化获得了人微血管内皮细胞(HMEC)。在补充有bullet kit(EBM,Lonza,Basel,Switzerland)和1ml Mycozap CL(Lonza,Basel,Switzerland)的内皮细胞基础培养基中培养HMEC。

将永生化人角化细胞(HaCat)与补充有10％胎牛血清(FBS,Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)的DMEM(Lonza,Basel,Switzerland)在37℃，5％CO2下培养。使用1ml培养基/cm

使用MACS系统(Miltenyi Biotec,Auburn,CA,USA)，通过磁珠细胞分选，使用与磁珠结合的抗CD105 Ab，从透明细胞型肾细胞癌样品分离来源于人肾癌的内皮细胞(TEC)。建立TEC细胞系并在Endogro基础完全培养基(Merck Millipore,Billerica,MA,USA)中维持培养。通过形态、对于vWF抗原、CD105、CD146和血管内皮细胞-钙粘素的正染色以及对于细胞角蛋白和肌间线蛋白的负染色，先前将TEC鉴定为内皮细胞。

蛋白质分析

通过补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)的RIPA缓冲液(150nM NaCl、20nM Tris-HCl、0.1％十二烷基硫酸钠、1％脱氧胆酸盐、1％Triton X-100，pH 7.8)，从EV提取蛋白。按照生产商的规程，通过BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Massachusetts,USA)定量蛋白质含量。简要地，将10μl样品分配到96孔板的孔中并使用通过牛血清白蛋白(BSA)建立的线性标准曲线确定总蛋白浓度。

体外划伤测试试验

将角质细胞(HaCaT)和内皮细胞(HMEC)以～50×10

体外血管生成测定

在24孔板中的生长因子减少的Matrigel(BD Bioscience,Franklin Lakes,NJ,USA)上研究毛细管样结构的体外形成。将HMEC或TEC(25,000个细胞/孔)接种到Matrigel涂覆的孔中的分别含有EV(50,000或30,000个EV/靶细胞)的DMEM或EndoGRO MV-VEGF培养基中。处理重复三次。用Nikon Eclipse TE200对Matrigel上的细胞组织成像。在温育24h后，记录相衬图象(放大倍数，×10)并且使用ImageJ软件测量网状结构的总长。在5个随机视野中计算每个视野的总长并表示为相对于各个对照的百分比。

体外增殖试验

将HMEC以2,000个细胞/孔的密度在96孔板中铺板并保持贴壁。

用DMEM替换培养基以保持过夜。然后，将板封闭在填充了以下气体混合物的缺氧室内：5％CO

EV电荷的测量

通过Zeta-sizer纳米仪(Malvern Instruments,Malvern,UK)进行分析。所有样品在25℃下在过滤的(截止值＝200nm)盐溶液中进行分析。在距颗粒x距离产生了ζ电位(滑动面)，其表明了分散体中相邻的带类似电荷的颗粒之间的静电排斥程度。负ζ电位表示颗粒之间的高分散度。

用鱼精蛋白对EV工程化

将EV与鱼精蛋白(1.0μg/ml)(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo)混合并在37℃共温育5-30分钟以允许结合至EV表面。使用多种剂量的鱼精蛋白(1.0ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml)。然后，将带负电荷的合成miRNA分子(100pmol/ml)(miRNA模拟物或antimiR,Qiagen,Hilden,Germany)加入至混合物并在37℃共温育3小时。用盐溶液稀释混合物并在4℃储存过夜。在4℃，以100,000g超速离心2小时(Beckman Coulter Optima L-90K,Fullerton,CA,USA)使得能够除去游离的miRNA和鱼精蛋白分子，并用添加有1％DMSO的磷酸盐缓冲盐水使粒料再悬浮并通过0.22微米过滤器过滤灭菌。

RNA酶处理

在37℃下使用0,2μg/ml的浓度，用RNA酶A(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA USA)处理EV 30分钟。如通过生产商的规程描述的，将RNA酶抑制剂(Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)用于终止反应，并通过在4℃以100,000g超速离心1小时清洗EV(Beckman Coulter Optima L-90K,Fullerton,CA,USA)。

共聚焦显微术

对于EV掺入，通过用于膜的红色膜荧光染料PKH26(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)标记EV并用绿色荧光(FITC)标记的siRNA(Qiagen,Hilden,Germany)工程化。使用标记的EV处理在24孔板中铺板的TEC(30,000个细胞/孔)不同时间(30min、1h、3h、6h、18h、24h)。使用共聚焦显微镜检查(Zeiss LSM 5Pascal,Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)分析EV吸收。

RNA提取

根据生产商的规程，使用miRNeasy微型试剂盒(Qiagen Hilden,Germany)从EV和细胞分离总RNA。使用分光光度计(mySPEC,VWR,Radnor,PA,USA)定量样品的RNA浓度。

通过qRT-PCR的miRNA和mRNA分析

对于miRNA分析，使用miScript SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)。简要地，使用miScript反转录试剂盒反转录RNA样品，然后将cDNA用于检测和定量感兴趣的miRNA。如通过生产商的规程(Qiagen)所描述的，对于每个反应，使用3ng cDNA重复实验三次。对于mRNA分析，使用High-Capacity cDNA反转录试剂盒(AppliedBiosystems)获得cDNA。将5纳克cDNA加入至SYBR GREEN PCR Master Mix(AppliedBiosystems)并在96孔QuantStudio 12K Flex实时PCR(qRT-PCR)系统(Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)上运行。将GAPDH用作管家基因。将所有样品中的miRNA表达的变化倍数(Rq)计算为与对照样品相比的2

胞外囊泡的电穿孔

按照生产商的规程，在Neon转染系统(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)上进行电穿孔。对于每次电穿孔，将样品体积固定在200μL。

体内实验

将巨大戟醇甲基丁烯酸酯(巨大戟醇-3-当归酸酯，Picato)用于光化性角化病引起的癌前病变的表面治疗。将药物在光化性角化病的病变上应用3天，从而除去癌前病变，但是引起了组织凋亡病变的形成。在治疗后，将天然橙子来源的EV表面给予于一个组织病变，而将相同患者上的一个未治疗的病变用作对照。在治疗3-7天后评价植物来源的EV的影响。

统计分析

使用软件包Graph Pad 6.01 Demo版进行数据分析。结果表示为平均值±标准误差(SEM)。将单因素方差分析(ANOVA)用于证实组间的统计学差异，同时使用学生t检验在两个样品之间进行比较。我们使用p<0.05作为最小显著性水平。p：*<0.05，**<0,01，***<0,005，****<0,001。

结果/实施例

为了研究本发明的方法的可行性，本发明人使用了从不同植物，包括柠檬、橙子、葡萄、含生草(Anastatica hierochuntica)和鳞叶卷柏(Selaginella lepidophylla)纯化的天然EV。通过微滤和差速超速离心或切向流过滤分离EV，并且通过Nanosight分析，它们显示出25-350nm的范围内的尺寸(图1)。此外，所有天然植物来源的EV显示出通过电子致密的膜限定的圆形形态，如通过电子显微镜分析所显示的(图1)。

为了检验植物来源的EV的含量，使用BCA测定测量了分离自苹果、橙子、柠檬、葡萄、含生草(Anastatica hierochuntica)和鳞叶卷柏(Selaginella lepidophylla)的天然EV的蛋白质含量。图2显示了结果，并且表明对于表1中所示的EV，蛋白质含量不均一。

表1.EV的蛋白质含量

此外，更深入的分析表明天然植物来源的EV含有以囊泡为特征的蛋白，如HSP70、HSP80、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PD)和果糖-二磷酸醛缩酶6(FBA6)；和植物蛋白质，如Patellin-3-样蛋白和内涵素重链。

另外，天然植物来源的EV的脂质含量显示取决于植物，量变化的脂质内含物，包括24-亚丙基胆固醇、β谷甾醇、缩水甘油硬脂酸酯、二棕榈酸甘油酯、菜油甾醇、二十烷醇、二十碳烷、十六烷、十六醇、十八碳烷、十八醇、十四烷、十四烯、巴伦西亚橘烯和硬脂酸酯。

测试了天然植物来源的EV促进内皮细胞迁移和血管生成的能力。通过对内皮细胞单层进行划伤，本发明人观察到与阴性对照(CTR)相比，使用不同剂量的天然植物来源的EV，内皮细胞的迁移速率显著更高(图3)，从而表明植物来源的EV可以促进内皮细胞迁移并支持血管生成。

另外，通过血管生成测定评价了天然植物来源的EV促进血管形成的能力以验证它们对体外血管形成的影响。图4中所示的结果表明测试的所有天然植物来源的EV通过刺激内皮细胞显著促进新血管形成，因此促进血管生成。

此外，测试了在体外缺氧损害后，天然植物来源的EV促进内皮细胞上细胞增殖的能力。与阴性对照(CTR)相比，不同剂量的天然橙子来源的EV显著促进细胞增殖速率，从而证明了EV对内皮细胞的有益作用(图5)。

分析了天然植物来源的EV的抗微生物活性。与人中的感染病变有关的大部分病原菌需要>6的pH值，并且它们的生长受低pH值抑制。天然植物来源的EV显示出4至5的范围内的低pH。将天然植物来源的EV应用于病变表面产生了对于细菌性病原体，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌属的种(Klebsiella spp.)、变形菌属的种(Proteusspp.)、柠檬酸细菌属的种(Citrobacter spp.)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、链球菌肠(streptococci)和道球菌(enterococci)的生长和增殖不利的酸性环境。植物来源的EV的应用在通过降低pH，从污染或感染的病变中清除细菌性病原体中是有效的。事实上，用天然植物来源的EV处理恢复了皮肤表面的平均pH(通常在4.2至5.6的范围内)，从而控制了表面感染，提高了皮肤的天然抗微生物活性。此外，pH的降低已显示提高了其它药物对革兰氏阳性的和革兰氏阴性细菌两者的抗细菌活性。

分析了天然植物来源的EV的体内治疗效果。将天然植物来源的EV用于治疗人志愿者中通过巨大戟醇甲基丁烯酸酯(巨大戟醇-3-当归酸酯，Picato)引起的皮肤损害。这种物质是细胞死亡的诱导剂并且用于癌前病变(光化性角化病)的表面治疗。图6中所示的结果显示了与3天之前(图6C)和之后(图6D)类似的未治疗的病变相比，在用天然植物来源的EV治疗3天之前(图6A)和之后(图6B)的病变。与未治疗的病变相比，3天后天然植物来源的EV在通过巨大戟醇甲基丁烯酸酯诱导的促凋亡病变中显示出治疗效果，其促进了组织再生。

为了用基于电荷相互作用的方法修饰植物来源的EV，分析了天然植物来源的EV的表面电荷。对不同制剂进行ζ电位分析，其显示来源于橙子的天然EV显示出-13,59±1,83mV的负电荷(图7)。其它天然植物来源的EV显示出类似的负电荷。感兴趣地，与正电荷接头鱼精蛋白共温育并通过超速离心清洗的橙子来源的EV显示它们的电荷显著增加，从而表明了它们表面的修饰(图7)。

为了研究使用带正电的接头将带负电荷的分子加载到EV表面上的方法，将使用鱼精蛋白修饰的加载的植物来源的EV与miRNA分子混合，如图8所示。举例来说，将使用鱼精蛋白的加载的橙子来源的EV与不同的miRNA模拟物(miR-145、miR-221、miR-223)混合并通过qRT-PCR分析，其显示相对于对照天然EV，miRNA明显在加载的EV中富集(图9)，从而表明了与EV的有效分子结合。感兴趣的是，与EV结合的miRNA受到保护以避免通过生物流体中存在的生理浓度的RNA酶的降解，因此赋予了生物稳定性。图10A显示通过RNA酶处理游离的miRNA完全失活，然而与不表达miRNA的天然EV相比，结合至EV的miRNA受到保护以避免失活。图10B中显示了所有样品中的miRNA抑制百分比。

为了理解加载的分子是否可以有效输送至靶细胞，分析了通过加载的植物来源的EV介导的加载的分子向靶细胞的输送。首先，用PKH26(红色荧光染料)标记橙子来源的EV并用FITC荧光标记的合成siRNA工程化。将加载的EV与来源于肾癌(TEC)的人内皮细胞在不同的时间点(30min、1h、3h、6h、18h、24h)共温育。通过共聚焦显微镜检查分析显示EV表面上存在的小核酸不改变它们被靶细胞的吸收。图11显示对照细胞(CTR)标记了核并且用加载的EV处理在共温育30分钟后已提高了靶细胞中的荧光信号，最大吸收在6小时处(图11)。另外，还通过靶细胞的吸收的检测证实了加载的EV的有效输送。出于此目的，用miRNA模拟物221修饰的加载的橙子来源的EV处理TEC，并在24h之后通过qRT-PCR分析(剂量30,000个EV/细胞)。如图12A所示，将miRNA通过EV有效输送至靶细胞。还测试了靶细胞中加载的分子的功能性。出于此目的，用抗-miR-29a工程化的加载的橙子来源的EV刺激TEC细胞，并且通过qRT-PCR实验测量靶细胞中mRNA靶基因的表达。结果表明通过EV输送至靶细胞的miRNA也是功能性的并且引起其靶基因Collagen4A3的显著升高(图12B)。

为了更深度地研究带正电荷的接头的使用，评价了不同剂量的鱼精蛋白对植物来源的EV的加载。带正电荷的分子，如鱼精蛋白可以围绕带负电荷的分子，如miRNA形成胶束。然后，将橙子来源的EV与逐渐降低的剂量的鱼精蛋白和代表性的带负电荷的分子miRNAmiR-221-3p共温育。通过Nanosight所实施的EV的尺寸分析测量了加载的EV的平均和模式尺寸。结果显示鱼精蛋白(1.0μg/ml)的初始的量引起平均和模式尺寸两者增加，其中平均尺寸差异显著(图13)。然而，当EV与低剂量的鱼精蛋白(1.0ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml)共温育时，EV尺寸的这种变化不存在。结果表明鱼精蛋白剂量对于初始的量过量，从而导致形成了尺寸大于EV制剂中存在的正常天然EV的胶束。为了验证低剂量的带正电荷的接头足以允许与带负电荷的分子相互作用，在加载的植物来源的EV中测量了加载的miRNA分子的表达并在靶细胞中评价了它们的输送。使用低剂量的鱼精蛋白(1.0ng/ml)，用代表性的miRNA(miR-221-3p)工程化的加载的橙子来源的EV的qRT-PCR分析证明miRNA有效结合至EV(图14a)。此外，用低剂量的鱼精蛋白(1.0ng/ml)修饰的加载的橙子来源的EV能够将miRNA有效输送至靶细胞，如通过用加载的EV处理的靶细胞的qRT-PCR分析证实(图14b)。

作为进一步改善植物来源的EV的天然活性的修饰方法的代表性实施例，将植物来源的EV的修饰用于改善它们在促进角化细胞的伤口闭合中的天然活性。在这些实验中，使用鱼精蛋白作为带正电荷的接头，通过miRNA miR-21使加载的橙子来源的EV工程化。用3种不同剂量的天然EV、作为对照与单独的鱼精蛋白温育的加载的EV(EV+P)和具有鱼精蛋白和miR-21的加载的EV(EV+miR-21)处理人角化细胞。以中间剂量(50k)使用EV+P和EV+miR-21。将每个条件下的伤口闭合的测量用作EV活性的参数。图15中的图显示EV+P对伤口闭合的促进与相同剂量的天然EV相当，而EV+miR-21对伤口闭合的促进统计学显著增加，与双倍剂量的天然EV(EV 100k)相当。结果表明修饰方法可以用于提高天然植物来源的EV的治疗效果。

修饰方法还可以用于改变天然植物来源的EV的生物活性。可以用提供不同或新的生物作用的带负电荷的分子工程化植物来源的EV。作为代表性实施例，用不同的抗血管生成miRNA修饰橙子来源的EV，并且通过对TEC细胞的体外血管生成测定评价它们抑制血管生成的能力。具体地，用抗血管生成miRNA(miR-221、miR-223、miR-145)的模拟物和促血管生成miRNA(miR-29、miR-126、miR-31)的抗-miRNA工程化加载的EV，并在处理24小时之后评价它们对内皮细胞血管形成的影响(图16)。结果证明用抗血管生成分子工程化的加载的橙子来源的EV能够显著体外抑制内皮细胞的血管生成。

使用不同剂量的带正电荷的接头评价加载的植物来源的EV的治疗效果。作为代表性实施例，用两种不同剂量的鱼精蛋白(1μg/ml、1ng/ml)和3种不同的抗血管生成miRNA(antimir-29、miR-145和miR-221-3p)工程化加载的橙子来源的EV。将加载的EV用于刺激内皮细胞(TEC)24小时，并通过血管生成测定评价它们的活性。图17中所示的结果表明用低剂量的鱼精蛋白工程化的加载的EV的活性同样或更有效，从而表明不同剂量的带正电荷的接头有效修饰天然植物来源的EV的可行性。

可以通过转染规程进一步改善具有带负电荷的分子的植物来源的EV的修饰方法。事实上，带负电荷的分子(例如，miRNA)通过带正电荷的接头(例如，鱼精蛋白)向EV表面的结合可以帮助它们进入EV内部。带负电荷的分子与EV的接近可以在转染规程，如电穿孔之后提高它们的载量，如图18所示。通过在带负电荷的EV和带负电荷的分子之间形成桥，EV表面上集中的带正电荷的接头面向分子并且有利于内部翻转(图18)。还显示通过除电穿孔以外的策略，如超声、机械细胞挤出、皂苷-介导的透性化和冻融循环所获得的膜重排实施了EV加载。

为了测试这种假设，使用鱼精蛋白和miR-221-3p修饰橙子来源的EV并评价了它们抑制血管形成的能力。图19显示转染规程，如电穿孔对加载的EV的使用能够提高它们的影响并改善它们对内皮细胞上的血管形成的抑制活性。