一种核酸提取微流控芯片、核酸提取系统及方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是一种核酸提取微流控芯片、核酸提取系统及方法。

背景技术

核酸提取是分子生物学常用的技术，是从复杂样本得到高纯度核酸的过程。核酸提取的通常流程包括：1、细胞裂解，即将核酸从细胞或其他生物体(比如病毒)中释放出来；2、核酸分离和纯化。核酸分离和纯化的方法常用的包括：抽提与沉淀法、柱提取和磁珠法提取。抽提与沉淀法指的是采用有机溶剂(如酚氯仿，Tizol)反复抽提，离心后分层，核酸位于上层水相，而变性的蛋白大多在中间层，下层有机相含有脂类等杂质。小心吸取水相后，加入乙醇沉淀核酸，70％乙醇清洗后可得到较纯的核酸，加入无核酸酶水溶解即得到核酸。柱提取法利用的是硅胶膜在高盐低pH时选择性吸附核酸，而在低盐高pH时释放核酸的特征进行核酸分离，而杂质的清洗需要用到含乙醇的漂洗液。磁珠法提取是利用磁珠作为固相载体吸附核酸，通常结合过程会使用异丙醇或则聚乙二醇，而清洗磁珠杂质需要用到高比例的乙醇(常用70％-80％)。

核酸提取现有的技术，无论是上述哪种方法，都需要使用到有机溶剂，如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇等。然而，有机溶剂大多有毒性或者运输储存受限，这对日常实验人员带来风险和不便。并且，核酸清洗使用有机溶剂后需要时间挥发以免影响核酸纯度，这个等待挥发的时间通常需要5分钟，这个时间看起来不长，但在大量样本需要处理时(比如新冠检测每天需要提取大量样本)也会浪费时间。

因此，非常需要开发一种新的密闭性好，无需人工操作的提取核酸的方法，以避免使用有机溶剂、缩短提取时间并降低成本。

发明内容

本发明提供一种密闭性好、提取时间短的核酸提取微流控芯片、核酸提取系统及方法。

为实现上述目的，本发明提供一种核酸提取微流控芯片，包括顶层、中间层、底层，该中间层设有纵向排列且相互隔离的第一通道、第二通道、第一槽道；顶层底部在对应第二通道的位置内凹形成第一凹陷部，该第一凹陷部连通第一通道与第二通道；底层顶部在对应第二通道与第一槽道之间的位置内凹形成第一凹槽，该第一凹槽连通第二通道与第一槽道；中间层夹设于顶层与底层之间，使第一通道与顶层的下表面、底层的上表面围成样品腔，第二通道与顶层的下表面、底层的上表面围成吸附腔；顶层还设有连通第一通道的第一通孔作为进液口，连通第一槽道的第二通孔与第三通孔，分别作为废液口与出液口。

进一步地，第一通道前部为宽度渐增形状，第一通孔连通于第一通道的最前端，使从第一通孔进入的液体在第一通道内呈扇形运动。

进一步地，第一通道后部包括宽度小于第一通道中部的第二槽道，第一通道中部与第二槽道之间设有宽度渐减形状的过渡段。

进一步地，第二通道前部呈宽度渐增形状，后部呈宽度渐减形状，第一凹陷部包括与该第二通道形状相同的凹陷部主体以及位于凹陷部主体前部呈槽道状的连接槽部，第一凹陷部通过该连接槽部与第一通道相连通。

进一步地，第一槽道包括相连通的纵向槽道部与横向槽道部，纵向槽道部连通废液口，横向槽道部连通出液口。

进一步地，中间层为框架结构，通过定位孔与底层相固定。

进一步地，中间层在第一通道后部还设有连接第一通道的第三槽道与第四槽道，顶层还设有连通第三槽道与第四槽道的第四通孔与第五通孔作为进液口。

本发明还提供一种核酸提取系统，用于分别从裂解混合物容器、清洗液容器、洗脱液容器中抽取试剂注入后提取提取液和排除多余液体至提取液容器、废液容器中，核酸提取系统包括如上所述的核酸提取微流控芯片以及注射泵、切变阀、分配阀，注射泵连接分配阀，分配阀各阀口分别连接核酸提取微流控芯片废液口、提取液容器、废液容器，切变阀各阀口分别连接裂解混合物容器、清洗液容器、洗脱液容器与外界，出口连接核酸提取微流控芯片进液口，核酸提取微流控芯片出液口连接提取液容器，通过注射泵负压驱动液体从裂解混合物容器、清洗液容器或洗脱液容器流进核酸提取微流控芯片，或从核酸提取微流控芯片废液口流进注射泵，或从核酸提取微流控芯片出液口流进提取液容器，通过注射泵正压驱动液体从注射泵流进废液容器。

进一步地，还包括控制装置、处理装置，控制装置连接处理装置以及注射泵、切变阀、分配阀，通过处理装置的程序设定给控制装置发出指令，控制装置进而控制注射泵、切变阀、分配阀的动作，实现核酸提取的自动控制。

本发明还提供一种核酸提取方法，利用如上所述的核酸提取系统，所述方法包括：

步骤一，切变阀连通裂解混合液容器，分配阀连通核酸提取微流控芯片废液口；注射泵负压运行一定行程，使一定量的裂解混合液通过加液口进入样品腔；分配阀连通废液容器；注射泵复位，若注射泵中有多余液体，多余液体排出至废液容器；

步骤二，切变阀连通清洗液容器，分配阀连通核酸提取微流控芯片废液口；注射泵负压运行一定行程，使裂解混合液从样品腔移入吸附腔；分配阀连通废液容器；注射泵复位，若注射泵中有多余液体，多余液体排出至废液容器；

步骤三，切变阀连通清洗液容器，分配阀连通核酸提取微流控芯片废液口；注射泵负压运行一定行程，使一定量的清洗液体通过加液口进入吸附腔；分配阀连通废液容器；注射泵复位，多余液体排出至废液容器；

步骤四，切变阀连通外部，分配阀连通核酸提取微流控芯片废液口；注射泵负压运行一定行程，使空气从加液口进入样品腔，再从废液口排出至注射泵；分配阀连通废液容器；注射泵复位；

步骤五，切变阀连通洗脱液容器，分配阀连通提取液容器；注射泵负压运行一定行程，使一定量的洗脱液体通过加液口进入吸附腔，且从出液口流出一定量的提取液至提取液容器；分配阀连通废液容器；注射泵复位，多余液体排出至废液容器。

本发明的有益效果是：本发明核酸提取微流控芯片、核酸提取系统及方法通过设置相互叠置的顶层、中间层、底层及其特殊结构，形成样品腔、吸附腔、进液口、废液口、出液口，使裂解混合液在密闭空间中进行清洗、洗脱等操作，操作人员不用 接触有机溶剂；且结构紧凑，操作便捷，能明显缩短提取时间；结构简单，零件少，能降低成本。

附图说明

图1为本发明实施例核酸提取微流控芯片的分解示意图。

图2为图1所示核酸提取微流控芯片的分解示意图。

图3为图1所示核酸提取微流控芯片中间层与底层的分解示意图。

图4为图1所示核酸提取微流控芯片的剖视图。

图5为本发明实施例核酸提取系统的示意图。

图6为本发明实施例核酸提取方法的流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实例，对本发明做进一步说明。

如图1至图4所示，本实施例中，核酸提取微流控芯片包括顶层1、中间层2、底层3。顶层1、中间层2、底层3相互叠置，中间层2夹设于顶层1与底层3之间。顶层、中间层、底层优选采用亲水角为60°的PMMA材料。

本实施例中，中间层2为框架结构，在其各端部分别设置定位孔21与底层3相固定。该中间层2设有纵向排列且相互隔离的第一通道22、第二通道23、第一槽道24。第一通道22与第二通道23以及第二通道23与第一槽道24之间分别通过第一横向隔离部25、第二横向隔离部26进行隔离，使第一通道22、第二通道23、第一槽道24之间不互通。

第一通道22大致呈扁平状的六边形，前部为宽度渐增形状，中部呈矩形，后部包括宽度小于第一通道中部的第二槽道221，第一通道中部与第二槽道221之间设有宽度渐减形状的过渡段。前部、中部、过渡段形成六边形。

第二通道23大致呈六边形，前部呈宽度渐增形状，后部呈宽度渐减形状，中间部大致呈方形。

第一槽道24包括相连通的纵向槽道部241与横向槽道部242。

顶层1为板状结构，底部在对应第二通道23的位置内凹形成第一凹陷部11，第一凹陷部11包括位于前端的连接槽部111与位于后端的凹陷部主体112。凹陷部主体与第二通道形状尺寸基本相同，连接槽部设置于第一通道与第二通道之间的对应位置（即第一横向隔离部上方）。顶层1还设有上下贯穿的第一通孔12、第二通孔13、第三通孔14，其位置分别与第一通道22的最前端、纵向槽道部241末端、横向槽道部242末端相对应。第一通孔12、第二通孔13、第三通孔14可插设有对接头4，以方便连接管插入。

底层3为板状结构，其顶部在对应第二通道23与第一槽道24之间的位置（即第二横向隔离部下方）内凹形成第一凹槽31。底层3对应定位孔21设有多个定位柱32，四周与顶层通过螺钉固定连接。

核酸提取微流控芯片组装后，顶层的第一通孔连通于中间层第一通道的最前端作为进液口，第二通孔与第三通孔分别作为废液口与出液口，以排出多余液体与提取液。第一通道与顶层的下表面、底层的上表面围成样品腔，第二通道与顶层的下表面、底层的上表面围成吸附腔。因第一通道前部为宽度渐增形状，可使得从第一通孔进入的液体流动时呈现向四周扩散，呈扇形运动，从而流动速度较快，且展开面积大。第一凹陷部与第二通道的宽度渐增形状同样也具有上述效果。顶层底部的第一凹陷部连接槽部位于中间层第一通道与第二通道之间的横向隔离部上方，连通第一通道与第二通道，且形成类似连通器的结构，起到防止液体尚未充满样品腔就直接进入吸附腔的作用。底层顶部的第一凹槽位于第二横向隔离部下方，连通第二通道与第一槽道，可防止液体尚未充满吸附腔就被吸出芯片外。

本实施例中，中间层2在第一通道22后部还可设置连接第一通道22的第三槽道27与第四槽道28，顶层1还设有连通第三槽道27与第四槽道28的第四通孔15与第五通孔16作为进液口。可以使用第一通孔作为各种试剂统一的进液口（这时可以不设置第四通孔、第五通孔以及第三槽道与第四槽道），也可以使用第一通孔、第四通孔、第五通孔分别作为各种试剂的进液口。

如图5所示，本实施例中，包含上述核酸提取微流控芯片的核酸提取系统，用于分别从裂解混合物容器51、清洗液容器52、洗脱液容器53中抽取试剂注入后提取提取液至提取液容器54和排除多余液体至废液容器55中。裂解混合物容器内装有裂解混合物，裂解混合物是裂解液与待提取样品（如血液）的混合物。清洗液容器内装有清洗液（如乙醇），用于清洗杂质，得到较纯的核酸。洗脱液容器内装有洗脱液，使吸附腔中的硅胶膜上吸附的核酸在低盐高pH环境下得到释放。

核酸提取系统还包括注射泵71、切变阀6、分配阀7、控制装置8、处理装置9，注射泵71连接分配阀7，分配阀7各阀口（E、I、O）分别连接核酸提取微流控芯片第二通孔13、提取液容器54、废液容器55，切变阀6各阀口（A、B、C、D）分别连接裂解混合物容器51、清洗液容器52、洗脱液容器53与外界，出口连接核酸提取微流控芯片第一通孔12。切变阀6出口与第一通孔12可设置流量计10，以精确计量进行的液体量。核酸提取微流控芯片第三通孔14连接提取液容器54，通过注射泵71负压驱动液体从裂解混合物容器、清洗液容器或洗脱液容器流进核酸提取微流控芯片，或从核酸提取微流控芯片废液口流进注射泵，或从核酸提取微流控芯片出液口流进提取液容器；通过注射泵正压驱动液体从注射泵流进废液容器。核酸提取微流控芯片的吸附腔中装有硅胶膜（也称为“吸附膜”），用于（在高盐低pH环境下）吸附核酸。

控制装置8连接处理装置9以及注射泵71、切变阀6、分配阀7，通过处理装置的程序设定给控制装置发出指令，控制装置进而控制注射泵、切变阀、分配阀的动作，实现核酸提取的自动控制。处理装置可以为电脑与安装于电脑中的编程软件，通过编程软件编写程序，并在运行时发送指令给控制装置，以实现自动控制。当然，在其它实施例中，也可以不设置控制装置与处理装置，而由操作人员手动控制注射泵、切变阀、分配阀。

本实施例利用切变阀来切换连通裂解混合物容器、清洗液容器、洗脱液容器，使裂解混合物、清洗液、洗脱液通过第一通孔进入核酸提取微流控芯片，控制较集中，更方便实现自动控制。在其它实施例中，也可以利用第四通孔与第五通孔作为进液口，例如第一通孔连裂解混合物容器，第四通孔连清洗液容器，第五通孔连洗脱液容器，这样结构比较简单。

如图6所示，本实施例中，利用如上所述的核酸提取系统进行核酸提取，其方法包括如下步骤：

步骤一，使裂解混合液进入样品腔：切变阀连通裂解混合液容器（即图5中切变阀6的A口通），分配阀连通核酸提取微流控芯片废液口（即图5中分配阀7的E口通）；注射泵负压运行一定行程，使一定量（如60uL）的裂解混合液通过加液口进入样品腔；分配阀连通废液容器（即图5中分配阀7的O口通）；注射泵复位，若注射泵中有多余液体，多余液体排出至废液容器；

步骤二，使裂解混合液从样品腔移入吸附腔：切变阀连通清洗液容器（即图5中切变阀6的B口通），分配阀连通核酸提取微流控芯片废液口（即图5中分配阀7的E口通）；注射泵负压运行一定行程，使裂解混合液从样品腔移入吸附腔；分配阀连通废液容器（即图5中分配阀7的O口通）；注射泵复位，若注射泵中有多余液体，多余液体排出至废液容器；本步骤使裂解混合液从样品腔移入吸附腔，核酸附着在硅胶膜上；

步骤三，加入清洗液：切变阀连通清洗液容器（即图5中切变阀6的B口通），分配阀连通核酸提取微流控芯片废液口（即图5中分配阀7的E口通）；注射泵负压运行一定行程，使一定量（如200uL）的清洗液体通过加液口进入吸附腔；分配阀连通废液容器（即图5中分配阀7的O口通）；注射泵复位，多余液体排出至废液容器；本步骤用于清洗裂解混合液中的杂质；

步骤四，加入空气：切变阀连通外部（即图5中切变阀6的D口通），分配阀连通核酸提取微流控芯片废液口（即图5中分配阀7的E口通）；注射泵负压运行一定行程，使空气从加液口进入样品腔，再从废液口排出至注射泵；分配阀连通废液容器（即图5中分配阀7的O口通）；注射泵复位；这一步骤可反复2-3分钟；本步骤用于将清洗液（如乙醇）挥发掉；

步骤五，加入洗脱液并提取：切变阀连通洗脱液容器（即图5中切变阀6的C口通），分配阀连通提取液容器（即图5中分配阀7的I口通）；注射泵负压运行一定行程，使一定量（如60uL）的洗脱液体通过加液口进入吸附腔，且从出液口流出一定量（如20uL）的提取液至提取液容器；分配阀连通废液容器（即图5中分配阀7的O口通）；注射泵复位，多余液体排出至废液容器；本步骤用于使吸附腔中的硅胶膜上吸附的核酸释放，并提取出来。

以上步骤都是可以通过电脑中在编程软件编写出相应程序，在运行时这些程序转换成指令发送给控制装置，由控制装置进而控制注射泵、切变阀、分配阀的动作，来实现核酸提取的自动控制。