基于eATRP信号放大策略的CEA电化学检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于eATRP信号放大策略的CEA电化学检测试剂盒及检测方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

随着社会经济的快速发展，人们的生活水平获得了显著的提高，但与此同时，全球癌症患者数量在逐渐增加，严重威胁着人类健康和生命安全。因此，建立一种快速、准确、灵敏检测肿瘤的方法具有重要意义。

肿瘤标志物(Tumor markers,TM)是细胞癌变过程中刺激机体产生的物质，表现为含量异常。检测肿瘤标志物，可以帮助早期诊断，并延长患者生存期。癌胚抗原(CEA)是一种广谱肿瘤标志物，存在于内胚层细胞分化而来的癌症细胞表面，经细胞膜传递后分泌到细胞外，在周围血清、胃液等体液中均能检出CEA成分。该成分在肺癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌等恶性肿瘤中都呈现出较高水平，临床应用广泛。在多种类型癌症的早期诊断、治疗评价、发展、监测及预后等方面有着重要作用。但是疾病早期标志物在体液中含量较低，而且人体环境复杂，直接检测的难度较大，对检测方法的检测限要求高。

目前已经有多种方法被报道用于检测CEA，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、化学发光免疫测定(CLIA)、化学发光酶免疫测定(CLEIA)等。生物传感器作为一种典型的多学科交叉和发展的产物。作为一种新兴的检测方法，由于其灵敏度高、操作简单、特异性强等优点受到了广泛关注。其主要由分子识别元件、信号转换元件和信号放大装置三部分组成，分子识别元件通常使用具有特异性结合目标物能力的抗体、酶、DNA等分子，增加传感器的特异性。信号转换元件可以将产生的生物信号转化为可测量的电信号或者荧光信号。传统传感器的目标分子上只能连接一个信号分子，导致传感器的灵敏度难以达到检测需求，为了增加传感器的灵敏度，信号放大装置将产生的信号进一步放大，从而实现对微量标志物的高灵敏检测。

常用的信号放大策略主要包括纳米材料、天然酶以及聚合物链等手段。然而，金属纳米材料昂贵、制备过程复杂，酶的性质不稳定，容易受到外界环境如pH、温度等的影响。聚合物链法能够有效地将单个信号分子接枝到聚合物骨架上，从而显著增加电极上信号分子的负载量，是一种高效、简单而经济的新型信号放大策略。目前已经有多种聚合方法有：原子转移自由基聚合(ATRP)、开环聚合(ROP)、可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)、点击(Click)聚合等。本发明旨在构建一种基于eATRP信号放大策略的电化学检测试剂盒用于高灵敏检测CEA。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于eATRP信号放大策略的CEA电化学检测试剂盒及检测方法，克服了传统ATRP反应中催化剂对空气敏感的缺点，且灵敏度高、特异性好、操作简单，在人血清检测中具有良好的适用性。

为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：

基于eATRP信号放大策略的CEA电化学检测试剂盒，包括以下原料：Apt1、Apt2、MCH、PEI、BMP、Me

Apt1序列：5’-SH-(CH

Apt2序列：5’-AGGGGGTGAAGGGATACCC-3’。

进一步，使用时，将部分原料配制为溶液，Apt1溶液浓度为1μM，Apt2溶液浓度为100μM，EDC溶液浓度为100μM，NHS溶液浓度为100μM，MCH溶液浓度为2mM，PEI溶液浓度为2mg/mL，BMP溶液浓度为2mM，KPF

本发明的技术方案之一是：一种检测CEA的方法，包括以下步骤：

(1)电极修饰

①将Apt1溶液滴加到金电极上，反应，洗涤，吹干；

②将步骤①的电极浸泡在MCH溶液中，反应，洗涤，吹干；

③将待检测样品滴加至步骤②的电极表面，反应，洗涤，吹干；

④将Apt2-PEI溶液滴加到步骤③的电极上，反应，洗涤，吹干；

⑤将BMP溶液滴加到步骤④的电极表面，反应，洗涤，吹干；

⑥将步骤⑤的电极浸泡在eATRP反应溶液中，在恒定电位下，用i-t曲线电化学聚合，随后用LSV方法处理电极，除去表面杂质；

(2)电化学测定

将修饰后的电极浸入LiClO

进一步，金电极先进行预处理，预处理方法为：用0.3μm和0.05μm氧化铝粉分别对金电极表面进行抛光，然后，依次用超纯水、无水乙醇和超纯水超声清洗电极，将清洗过的电极在新配制的水虎鱼酸溶液中浸泡15min，并重复上述清洗步骤，清洗结束后取出，在0.5M H

进一步，步骤①的反应温度为37℃，时间为2h；步骤②的反应温度为37℃，时间为0.5h；步骤③的反应温度为37℃，时间为1h；步骤④的反应温度为37℃，时间为1h；步骤⑤的反应温度为37℃，时间为25min；步骤⑥的聚合温度为室温，时间为40min；步骤(2)的SWV的扫描范围：0～0.8V，扫描速率：1.0V/s，电位增量：4mV。

进一步，Apt2-PEI溶液的制备方法为：

将Apt2溶液、EDC溶液和NHS溶液等体积混合，然后加入到PBS缓冲液中，振荡活化，得到已活化的Apt2溶液；然后加入等体积的PEI溶液混合，振荡反应，得到Apt2-PEI溶液。

进一步，eATRP反应溶液的制备方法为：

①将CuBr

②将1.8mL DMSO、0.1mL CuBr

本发明的技术方案之一是：一种上述试剂盒在检测CEA中的应用。

本发明修饰电极的制备方法和检测方法原理如图1所示。

首先将一端修饰有巯基的CEA适配体1(Apt1)通过“Au-S”共价键自组装到金电极表面，用6-巯基己醇(MCH)封闭金电极未结合的位点。然后，通过适配体与抗原的特异性识别，依次将CEA、Apt2-PEI连接到金电极上。PEI上大量的氨基通过酰胺键与引发剂2-溴-2-甲基丙酸(BMP)连接，从而引入大量eATRP引发位点。接着将电极浸入eATRP反应溶液中，在电化学方法i-t下进行电催化聚合，信号单元二茂铁甲醇异丁烯酸脂(FMMA)被聚合到电极上；将聚合后的电极立即用线性扫描伏安法(LSV)处理，除去电极表面吸附的杂质。最后将制备完成的电极置于高氯酸锂电解液中，应用方波伏安法(SWV)测试检测的性能。

电化学介导的ATRP过程以BMP为引发剂、CuBr

本发明的有益效果：

1、本发明利用大分子聚合物PEI对信号进行放大，避免了使用纳米材料所需的复杂合成过程和使用生物酶时易受外界环境、温度等因素的影响，使得在放大信号的同时，不影响检测的效率和稳定性。

2、本发明采用电介导的原子转移自由基聚合(eATRP)策略，在传统ATRP可用单体范围广、聚合物结构有序等优势的基础上，可以通过调节电位来调控聚合反应的进程，并且减少金属催化剂的使用，更加有效、环保。

3、本发明以二茂铁甲醇异丁烯酸脂(FMMA)为电化学信号单元，采用eATRP作为信号放大策略，与大分子聚合物PEI实现级联信号放大。Apt1以金-硫键自组装到金电极表面，通过适配体-抗原的特异性识别逐步形成Apt1-CEA-Apt2的三明治夹心结构。PEI预先通过酰胺键与Apt2连接，PEI上的氨基为eATRP引发剂BMP的连接提供大量活性位点。在eATRP反应溶液中，引发剂BMP上的溴基在电极表面诱导eATRP反应发生，大量的电化学活性物质FMMA被接枝到电极上。最后，利用方波伏安法(SWV)检测电流响应值，从而实现对CEA的高灵敏检测。实验结果表明，在10

附图说明

图1A为本发明修饰电极的制备方法图，图1B为eATRP原理示意图。

图2A为不同修饰条件下电极的SWV信号图；图2B为不同扫描速率的CV曲线；图2C为每个步骤修饰后的电极的EIS阻抗曲线；图2D为每个步骤修饰后的电极的CV曲线。

图3为电极表面修饰eATRP前后的原子力显微镜照片。

图4为不同修饰状态电极表面的接触角照片。

图5A为BMP反应时间优化；B为eATRP反应时间优化。

图6A为不同浓度CEA的SWV响应信号；B为CEA浓度与电流强度之间的线性关系图。

图7A为试剂盒对10ng·mL

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

癌胚抗原(CEA)和所有合成的寡核苷酸，包括CEA1(Apt1：5’-SH-(CH

实施例1：试剂盒

基于eATRP信号放大策略的CEA电化学检测试剂盒，包括以下原料：Apt1、Apt2、6-巯基-1-己醇(MCH)、聚乙烯亚胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2-溴-2-甲基丙酸(BMP)、三(2-二甲氨基乙基)胺(Me

将部分原料配制为溶液，Apt1溶液浓度为1μM，Apt2溶液浓度为100μM，EDC溶液浓度为100μM，NHS溶液浓度为100μM，MCH溶液浓度为2mM，PEI溶液浓度为2mg/mL，BMP溶液浓度为2mM，KPF

实施例2：试剂盒的构建

(1)电极预处理

用0.3μm和0.05μm氧化铝粉分别对金电极表面进行抛光。然后，依次用超纯水、无水乙醇和超纯水超声清洗电极。将清洗过的电极在新配制的水虎鱼酸溶液中浸泡15min，并重复上述清洗步骤。清洗结束后立即取出，在0.5M H

(2)修饰电极

①将10μL Apt1溶液(1μM)滴加到电极上，在37℃条件下反应2h，洗涤，吹干。

②将步骤①的电极浸泡在300μL MCH溶液(2mM)中，在37℃条件下反应0.5h，洗涤，吹干。

③将10μL待检测溶液(含CEA)滴加至步骤②的电极上，在37℃条件下反应1h，洗涤，吹干。

④将10μL配制好的Apt2-PEI溶液(1μM)滴加到步骤③的电极上，在37℃条件下反应1h，洗涤，吹干。

⑤将10μL BMP溶液(2mM)滴加到步骤④的电极上，在37℃条件下反应25min，洗涤，吹干。

⑥将步骤⑤的电极浸泡在新配制的eATRP反应溶液(10mL)中，在恒定电位下，用i-t曲线(恒定电位：-0.5V；静置时间：3s；采样间隔：0.1s)电化学聚合40min(常温)。随后立即用线性扫描伏安法(LSV)(起始电位：0V；终止电位：0.2V；扫描速率：1V/s)处理电极，除去表面杂质。

(3)电化学测定

将修饰后的电极浸入1.0M LiClO

Apt2-PEI溶液的制备方法为：

取10μL Apt2溶液(100μM)与等体积的EDC溶液(100μM)和NHS溶液(100μM)混合，然后加入到470μL PBS缓冲液中，放置于37℃恒温摇床中活化2h，得0.5mL已活化的Apt2溶液(2μM)；然后加入等体积的PEI溶液(2mg/mL)混合，放置于37℃恒温摇床中反应1h，得到Apt2-PEI溶液(1μM)。

eATRP反应溶液的制备方法为：

①将CuBr

②将1.8mL DMSO、0.1mL CuBr

实施例3：可行性验证

为了评价本发明检测CEA的可行性，采用SWV(1.0M LiClO

实施例4：表征

在1.0M KNO

EIS能够对电极构建过程中电极表面的改性情况进行表征，在含有0.1M KNO

用CV评价了不同修饰步骤时电极表面的特性。如图2D所示，随着Apt1、MCH、CEA逐步被修饰到电极上，电极表面的峰值电流逐渐减小(55.4～34.7μA，曲线a～d)。当Apt2-PEI附着在电极表面后，峰值电流显著提高(57.7μA，曲线e)。然后，将引发剂修饰到电极上，峰值电流进一步下降(56.2μA，曲线f)。最后，聚合反应将大量FMMA接枝到电极上，峰值电流显著降低(32.3μA，曲线g)，CV结果与EIS趋势一致，表明该电极构建成功。

通过原子力显微镜(AFM)和水接触角(WCA)对电极表面进行了表征。由图3A可知，Apt1/MCH/CEA/Apt2-PEI/BMP修饰金电极的高度为17.9nm。发生eATRP后，由于聚合物在金电极上形成，金电极高度增长为34.0nm(图3B)。这一结果说明聚合物能够在电极上形成，FMMA被成功接枝到电极表面。

由于在电极表面修饰材料后的亲水性会发生改变，WCA可以用来研究修饰后金电极的亲水性，图4中显示了不同步骤修饰步骤WCA的变化。从图4A中可以看出，由于金电极是疏水的，裸电极的WCA是95.3°。当Apt1被固定在金电极上时，WCA下降到92.3°(图4B)，这是由Apt1上的亲水性基团引起的。用MCH封闭表面未结合位点后，WCA变化不大，仅下降到91.2°(图4C)，这是因为MCH上既有疏水性基团又有亲水性基团导致的。由于蛋白质中存在亲水的氨基和羧基，当CEA与Apt1特异性识别后，WCA降低到86.8°(图4D)。同样的，由于PEI上存在大量氨基，Apt2-PEI连接到电极上后，WCA显著减小到76.5°(图4E)。BMP通过酰胺键连接到电极上后，由于酰胺键和卤素的作用，WCA减小到72.6°(图4F)。最后，带有FMMA的聚合物链接枝到电极上，由于聚合物中含有亲水性的甲基丙烯酸酯，电极的接触角下降到71.8°(图4G)。以上结果证明本发明用于检测CEA是可行的。

实施例5：检测条件优化

为了使试剂盒的性能达到最佳，对电极构建过程中的重要条件进行优化，包括BMP反应时间、eATRP时间等，以提高试剂盒的分析性能。

(1)BMP反应时间

BMP作为eATRP的引发剂，连接到电极上的量直接影响聚合反应的发生。随着反应时间的延长，越来越多的引发剂附着到电极上，为聚合提供更多的反应位点，电流强度逐渐增大。图5A为BMP时间与电流强度的关系图，在前25min内，电流随反应时间增长，25min后电流强度几乎保持不变，这是因为反应达到了平衡。因此，选择25min作为最佳反应时长。

(2)eATRP反应时间

同样的，在聚合反应中，FMMA的聚合量也受到eATRP反应时间的影响。由图5B可知，随着聚合时间的延长，电流强度逐渐增大，在40min左右达到最大值。这是因为大量的FMMA被接枝到电极上，电极表面的位阻逐渐增大，从而限制了聚合反应的进行。因此，eATRP的最佳反应时间为40min。

实施例6：分析性能

在最佳条件下，用构建的电极在1M LiClO

与其它几种方法相比，本发明所提出的方法检测CEA，检测范围更大、检测限更低，这表明本发明试剂盒在癌症的早期检测中具有潜在的应用价值(下表)。

实施例7：试剂盒的特异性、抗干扰能力、稳定性和重现性

为了验证本发明对于不同蛋白质的特异性，以确保其检测性能，在最佳条件下，比较了该试剂盒对10ng·mL

为了研究本发明在人血清中的抗干扰能力，分别检测不同浓度CEA在10％人血清中的信号强度，并将人血清样品中CEA的信号与PBS缓冲液中的信号进行对比。从图7B中可以看出：10ng·mL

为了评价本发明的稳定性，比较了新构建的电极和储存一段时间后的电极的信号强度。在相同条件下制备了两组修饰电极，一组构建完成后立即检测信号强度，另一组将制备好的电极在4℃中保存14天后进行检测。结果显示，存储两周后测得的信号强度是新制备电极的93.8％，说明该电极稳定性良好。

除此之外，还在相同实验条件下探讨了本发明重现性。实验结果表明，组内和组间相对标准偏差分别为：1.78％和3.09％。说明本发明具有良好的重现性。

实施例8：实际应用价值

最后，为了验证该试剂盒的实际应用价值，对获得的5个不同的临床血清样品进行检测。实验结果如下表所示，测得的结果与临床测得的数据相对误差都小于5％，表明该试剂盒可以对实际临床样品进行检测，具有一定的临床应用价值。

序列表

<110> 河南中医药大学

<120> 基于eATRP信号放大策略的CEA电化学检测试剂盒及检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

shchatacca gcttattcaa tt 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

agggggtgaa gggataccc 19