SARS-CoV-2中和性单克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体领域，具体涉及SARS-CoV-2中和性单克隆抗体及应用。

背景技术

人感染新冠病毒后呈现多种临床表现，主要常见症状有发热、呼吸道症状、咳嗽、气促等，感染的持续迁延可发展为重症肺炎，引起呼吸衰竭、休克和器官衰竭等严重并发症，部分轻症或出院患者在恢复后会出现病情反复。疫苗能有效预防传染病，且目前已有部分新冠疫苗被批准使用，但其主要是针对健康人群。针对SARS-CoV-2的中和性抗体能有效阻断病毒与细胞的结合，且在临床试验上显示出积极效果。

目前，有部分SARS-CoV-2的单克隆抗体已被批准紧急使用，且有大量处于不同的开发阶段。然而，现有的大部分抗体主要是针对未突变的SARS-CoV-2野生型。新出现的突变株如B.1.617.2株和B.1.1.529株，在刺突蛋白氨基酸序列上的多个点突变不仅会影响突变株的传播速度、致病性，还会对单克隆抗体的中和活性产生较大的影响，可能导致病毒免疫逃逸的发生。因此亟需开发针对SARS-CoV-2野生型和流行突变株具有广谱中和能力的单克隆抗体，这在针对包括SARS-CoV-2野生型和流行突变株的检测及治疗方面具有较大的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供SARS-CoV-2中和性单克隆抗体，其能够特异性地与SARS-CoV-2刺突蛋白结合，并能中和SARS-CoV-2野生株和流行突变株具有广谱中和能力。

本发明的第二个目的是提供编码上述SARS-CoV-2中和性单克隆抗体的核酸分子。

本发明的第三个目的是提供上述SARS-CoV-2中和性单克隆抗体的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

SARS-CoV-2中和性单克隆抗体，其为单克隆抗体8H9或单克隆抗体9D4；所述单克隆抗体8H9包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示的VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3；所述单克隆抗体9D4包含氨基酸序列如SEQ ID NO：11-13所示的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO：14-16所示的VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3。

本发明的SARS-CoV-2中和性单克隆抗体，对SARS-CoV-2野生株和突变株如B.1.617.2株和B.1.1.529株假病毒具有较强的中和活性，在应对SARS-CoV-2野生株及其突变株引起的疾病的特异性预防、治疗和诊断中具有重要的研究和应用价值。

优选地，所述单克隆抗体8H9重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述单克隆抗体8H9轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。进一步优选地，所述单克隆抗体8H9的轻链型为Kappa，亚型为IgG 2a。

优选地，所述单克隆抗体9D4重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述单克隆抗体9D4轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。进一步优选地，所述单克隆抗体9D4的轻链型为Kappa，亚型为IgG 2a。

在本发明提供的单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列基础上，可通过常规蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守型变异体或其片段，仍能够中和SARS-CoV-2野生株和两种流行突变株的假病毒，包括B.1.617.2株和B.1.1.529株。

编码上述SARS-CoV-2中和性单克隆抗体的核酸分子。

以上述核酸分子编码得到的单克隆抗体能够中和SARS-CoV-2野生株和两种流行突变株的假病毒，包括B.1.617.2株和B.1.1.529株。

抗体核酸分子可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。在本发明提供的上述核酸分子经一个或多个核苷酸添加、删除、替换、修饰等突变后得到的重链可变区核苷酸序列和/或轻链可变区核苷酸序列的变异序列，其所编码的氨基酸序列组成的单链抗体或嵌合单克隆抗体或改型单克隆抗体或其他形式的单克隆抗体或抗体片段，仍能够中和SARS-CoV-2野生株和两种流行突变株的假病毒，包括B.1.617.2株和B.1.1.529株。

优选地，编码所述单克隆抗体8H9重链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，编码所述单克隆抗体8H9轻链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

优选地，编码所述单克隆抗体9D4重链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，编码所述单克隆抗体9D4轻链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

上述SARS-CoV-2中和性单克隆抗体及其人源化改造抗体在制备检测SARS-CoV-2的试剂、抑制SARS-CoV-2的试剂、预防和/或治疗因SARS-CoV-2感染导致的疾病的药物中的应用。

优选地，所述SARS-CoV-2包括野生株、B.1.617.2株和B.1.1.529株。

目前已开发的疫苗和部分被批准紧急使用的抗体主要是针对未突变的SARS-CoV-2野生株。SARS-CoV-2突变株如B.1.617.2株和B.1.1.529株显示出对部分在不同开发阶段的抗体、康复者血浆和疫苗免疫后血浆具有不同程度的耐受性。本发明所涉及的8H9和9D4单克隆抗体的实验结果表明，该抗体8H9和9D4对SARS-CoV-2野生株和突变株如B.1.617.2株和B.1.1.529株假病毒具有较强的中和活性。

附图说明

图1为本发明中稳定分泌表达重组RBD蛋白的CHO细胞株的鉴定；其中(A)为亚克隆后细胞荧光/白光图；(B)细胞表达上清的Western blot鉴定：M：Marker；1：CHO/RBD细胞培养上清；2：CHO细胞培养上清；

图2为本发明中RBD蛋白纯化的鉴定M:Marker；1:细胞培养上清；2:孵育后流穿液；3:杂蛋白洗脱；4:目的蛋白洗脱；

图3为本发明中免疫后的小鼠血清效价检测结果图；

图4为本发明中单克隆抗体8H9和9D4纯化后的SDS-PAGE鉴定结果图；

图5为本发明中纯化后的单克隆抗体8H9和9D4与RBD结合活性检测结果图；

图6为本发明中单克隆抗体8H9和9D4对SARS-CoV-2野生株假病毒、SARS-CoV-2突变株B.1.617.2株和B.1.1.529株的假病毒的中和活性检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的具体实施过程进行详细说明。若未特别说明，以下实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段，所有试剂耗材均为市售商品。

实施例1SARS-CoV-2中和性单克隆抗体

本实施例的SARS-CoV-2中和性单克隆抗体，为单克隆抗体8H9或单克隆抗体9D4。

单克隆抗体8H9包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示的VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3；8H9抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。8H9抗体的轻链型为Kappa，亚型为IgG 2a。

单克隆抗体9D4包含氨基酸序列如SEQ ID NO：11-13所示的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO：14-16所示的VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3；9D4抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。9D4抗体的轻链型为Kappa，亚型为IgG 2a。

本实施例的SARS-CoV-2中和性单克隆抗体的制备过程如下：

(1)重组RBD蛋白的制备、鉴定与纯化

利用慢病毒系统将RBD基因构建至慢病毒表达载体中pLVX-RBD-IRES-ZsGreen1，选用HEK293T细胞包装慢病毒。RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。

具体过程如下：

a)HEK293T细胞在T25细胞培养瓶中生长到70～90％汇合度时，小心地弃掉培养基。然后，在细胞培养瓶中加入3mL 37℃预热的PBS洗涤液。之后，弃去洗涤液，在细胞培养瓶中加入1mL 0.25％胰蛋白酶以覆盖细胞。室温静置1min后除去胰蛋白酶，将细胞转移到细胞培养箱中继续消化5min。之后，加入3mL DMEM完全培养基并反复吹吸6～8次，确保细胞分散成单个细胞悬液。细胞计数，用DMEM完全培养基将细胞密度调整为8×10

b)将2mL/孔细胞悬液转移到多聚赖氨酸处理过的6孔细胞培养板，放回细胞培养箱中过夜培养。转染前检查细胞密度，细胞应达到70％汇合度。小心弃掉6孔板上清培养基，每孔加入2mL Opti-MEM完全培养基，放回细胞培养箱中。开始制备转染复合物，将200μL

c)用流式细胞仪将转导后的细胞以1个细胞/孔将荧光强度高的单细胞克隆分选到96孔细胞培养板中。分选的细胞在分裂时有时会出现荧光消失的情况，所以待细胞在96孔板中汇合度达到60％左右，挑选细胞状态好，荧光强度高的细胞进行亚克隆，直至筛选得到荧光强度高且稳定的单克隆细胞(图1)。将能稳定分泌表达重组RBD蛋白的CHO细胞株，命名为CHO/RBD。将CHO/RBD细胞大量培养并收集表达的上清液，用Ni-NTA亲和纯化，经SDS-PAGE验证后获得大小为26kDa的高纯度RBD蛋白(图2)。

(2)分泌SARS-CoV-2RBD蛋白抗体的杂交瘤细胞株的制备

2.1、小鼠免疫

经过纯化的重组RBD蛋白以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下多点注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠(购自郑州大学实验动物中心，2只)，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行加强免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。第二次加强免疫后尾部采血，以间接ELISA法测定血清效价(图3)，两只小鼠效价达到1:1.28×10

2.2、杂交瘤细胞融合和筛选

采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量为8：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养基进行筛选。10天后，开始使用下文所述的ELISA检测方法来检测针对RBD蛋白的抗体的存在情况。

ELISA检测方法:

间接ELISA用于评估上清液中抗体对于RBD蛋白的结合能力。ELISA板用4μg/mL的重组RBD蛋白在4℃下包被过夜。用PBST(0.05％吐温)洗涤板，并将其用150μL/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭1h。随后弃去封闭液，向每个板加100μL杂交瘤细胞培养上清液，然后在37℃孵育1h。将板用PBST洗涤三次，并用100μL/孔的1：10000稀释的羊抗鼠IgG-HRP二抗37℃孵育1h。将板用PBST洗涤五次然后加入TMB显色液并在室温下在避光显色10min。用2M浓硫酸终止液终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。

2.3、杂交瘤细胞亚克隆

对阳性孔细胞进行有限稀释法亚克隆，每次亚克隆后7-8天测定间接ELISA值，挑取OD

(3)单克隆抗体8H9和9D4的制备及纯化

3.1、制备：在提前7天注射弗氏不完全佐剂后，将中和性单克隆抗体8H9和9D4的单克隆杂交瘤细胞株(0.5mL，1×10

3.2、纯化：收获腹水，37℃静置2h后，5000rpm离心30min，收集中层上清液并过滤，随后用Protein A亲和层析柱进行纯化。纯化步骤如下：

用pH为7.4的0.01M PBS缓冲液平衡柱子；

上样后，用pH为7.4的0.01M PBS缓冲液淋洗；

用pH为3.0的0.1M Gly缓冲液进行洗脱，并用pH为8.0的Tris中和洗脱液。

收集洗脱液于0.01M PBS缓冲液中透析。取纯化后的抗体进行SDS-PAGE分析。

3.3、结果分析：SDS-PAGE结果见图4，在还原条件下呈现分子量约为50kDa和25kDa的两条带，分别对应抗体的重链和轻链。纯化后的单克隆抗体纯度达到95％以上。

(4)中和性单克隆抗体8H9和9D4与抗原的结合活性检测

采用间接ELISA法测定8H9和9D4抗体与SARS-CoV-2RBD蛋白结合能力。步骤如下：

ELISA板用4μg/mL的重组RBD蛋白在4℃下包被过夜。用PBST(0.05％吐温)洗涤板，并将其用150μL/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭1h。随后弃去封闭液，向每个板加100μL系列稀释的抗体，然后在37℃孵育1h。将板用PBST洗涤三次，并用100μL/孔的1：10000稀释的羊抗鼠IgG-HRP二抗37℃孵育1h。将板用PBST洗涤五次然后加入TMB显色液并在室温下在避光显色10min。用2M浓硫酸终止液终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。

8H9和9D4抗体与抗原结合活性检测结果见图5，结果表明：

单克隆抗体8H9针对RBD蛋白的结合活性为：EC

单克隆抗体9D4针对RBD蛋白的结合活性为：EC

实施例2核酸分子

编码上述SARS-CoV-2中和性单克隆抗体的核酸分子，其中，8H9抗体的重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示。9D4抗体的重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

实施例3单克隆抗体的应用

本实施例进行上述单克隆抗体8H9和9D4对野生株和(突变型)假病毒的中和试验。

采用假病毒检测体系检测8H9和9D4对SARS-CoV-2野生株及其突变株的中和活性，假病毒由本实验室保存。步骤说明如下：将系列稀释的抗体8H9和9D4与假病毒混合后37℃孵育1h，细胞对照组为不加抗体和病毒，病毒对照组不加抗体。然后以2×10

抗体8H9和9D4对假病毒中和实验检测结果见图6。

结果表明，抗体8H9和9D4对SARS-CoV-2野生株和突变株B.1.6.7.2株和B.1.1.529株假病毒中和活性IC

因此，单克隆抗体8H9和9D4对SARS-CoV-2野生株和突变株都具有中和活性。

实施例4单克隆抗体可变区基因扩增与序列测定

将前期筛选出的8H9和9D4单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，Trizol法提取总RNA；利用RT-PCR获得鼠源抗体可变区编码片段并进行测序。

测序结果如下：

本发明的单克隆抗体8H9重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10所示。进一步分析得到单克隆抗体8H9重链可变区氨基酸序列如SEQID NO：7所示；单克隆抗体8H9的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

本发明的单克隆抗体9D4重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20所示。进一步分析得到单克隆抗体9D4重链可变区氨基酸序列如SEQID NO：17所示；单克隆抗体9D4的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。

具体的，8H9抗体的六个CDR区的序列结构为：

重链CDR1(VHCDR1)，SEQ ID NO.1：GYTFTTYG

重链CDR2(VHCDR2)，SEQ ID NO.2：INTYSGVP

重链CDR3(VHCDR3)，SEQ ID NO.3：ARYDPTAPDYAMDY

轻链CDR1(VLCDR1)，SEQ ID NO.4：ENVGTY

轻链CDR2(VLCDR2)，SEQ ID NO.5：GAS

轻链CDR3(VLCDR3)，SEQ ID NO.6：GQSYIYPLT

8H9抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8；

SEQ ID NO.7:

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGMSWVKQTPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTASLQINNLKNEDTATYFCARYDPTAPDYAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO.8:

NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYIYPLTFGAGTNLELK

8H9抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10；

SEQ ID NO.9:

CAGATCCAGTTGGTACAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAACCTATGGAATGAGCTGGGTGAAACAGACTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACTCTGGAGTGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTCTTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGATATGATCCTACGGCTCCAGACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO.10:

AACATTGTAATGACCCAATCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGAGAGAGGGTCACCTTGAGCTGCAAGGCCAGTGAGAATGTGGGTACTTATGTATCCTGGTATCAACAGAAACCAGAGCAGTCTCCTAAACTGCTGATATACGGGGCATCCAACCGGTACACTGGGGTCCCCGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGCAACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTTGCAGATTATCACTGTGGACAGAGCTACATCTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAACCTGGAGCTGAAA

9D4抗体的六个CDR区的序列结构为：

重链CDR1(VHCDR1)，SEQ ID NO.11：GYALTDYY

重链CDR2(VHCDR2)，SEQ ID NO.12：IFPGNDYT

重链CDR3(VHCDR3)，SEQ ID NO.13：ARYGDGNYVYFDY

轻链CDR1(VLCDR1)，SEQ ID NO.14：SSISSSN

轻链CDR2(VLCDR2)，SEQ ID NO.15：GTS

轻链CDR3(VLCDR3)，SEQ ID NO.16：QQWSSYPLT

9D4抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.17和SEQID NO.18；

SEQ ID NO.17:

QVHLQQSGPELVKPGASVKISCKSSGYALTDYYINWVKQRPGQGLEWIGWIFPGNDYTYFNEKFKDKATLTLDKSSRTAYMLLSSLTTEDSAVYFCARYGDGNYVYFDYWGQGTSLTVSS

SEQ ID NO.18:

ETVLIQSPALMAASPGEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKSGNSPKPWIYGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGAGTKLELK

9D4抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.19和SEQID NO.20；

SEQ ID NO.19:

CAGGTCCACCTACAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGTCTTCTGGCTACGCCCTCACTGACTACTATATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAAATGATTATACTTACTTCAATGAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTTACTTTAGACAAATCCTCCAGGACAGCCTACATGTTGCTCAGCAGCCTGACCACTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATACGGGGATGGTAATTACGTCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCTCTCTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO.20:

GAAACTGTGCTCATTCAGTCTCCAGCACTCATGGCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATCACCTGCAGTGTCAGCTCAAGTATAAGTTCCAGCAACTTACACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGAAACTCCCCCAAACCCTGGATTTATGGCACATCCAATCTTGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGTCAACAGTGGAGTAGTTACCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

<110> 郑州大学 河南农业大学

<120> SARS-CoV-2中和性单克隆抗体及应用

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 8H9-VHCDR1

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 8H9-VHCDR2

<400> 2

Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 8H9-VHCDR3

<400> 3

Ala Arg Tyr Asp Pro Thr Ala Pro Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 8H9-VLCDR1

<400> 4

Glu Asn Val Gly Thr Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 8H9-VLCDR2

<400> 5

Gly Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 8H9-VLCDR3

<400> 6

Gly Gln Ser Tyr Ile Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 8H9-重链可变区

<400> 7

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Ser

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Asp Pro Thr Ala Pro Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 8H9-轻链可变区

<400> 8

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ile Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 9

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 8H9-重链可变区编码基因

<400> 9

cagatccagt tggtacagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca acctatggaa tgagctgggt gaaacagact 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct actctggagt gccaacatat 180

gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctct 240

ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagatatgat 300

cctacggctc cagactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 8H9-轻链可变区编码基因

<400> 10

aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 60

ttgagctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca 120

gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagaccttg cagattatca ctgtggacag agctacatct acccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaacc tggagctgaa a 321

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 9D4-VHCDR1

<400> 11

Gly Tyr Ala Leu Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 9D4-VHCDR2

<400> 12

Ile Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Thr

1 5

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 9D4-VHCDR3

<400> 13

Ala Arg Tyr Gly Asp Gly Asn Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 9D4-VLCDR1

<400> 14

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn

1 5

<210> 15

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 9D4-VLCDR2

<400> 15

Gly Thr Ser

1

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 9D4-VLCDR3

<400> 16

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 17

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 9D4-重链可变区

<400> 17

Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Ala Leu Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Thr Tyr Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Asp Gly Asn Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 9D4-轻链可变区

<400> 18

Glu Thr Val Leu Ile Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Asn Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 19

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 9D4-重链可变区编码基因

<400> 19

caggtccacc tacagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagt cttctggcta cgccctcact gactactata taaactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gaaatgatta tacttacttc 180

aatgagaagt tcaaggacaa ggccacactt actttagaca aatcctccag gacagcctac 240

atgttgctca gcagcctgac cactgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatacggg 300

gatggtaatt acgtctactt tgactactgg ggccaaggca cctctctcac agtctcctca 360

<210> 20

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 9D4-轻链可变区编码基因

<400> 20

gaaactgtgc tcattcagtc tccagcactc atggctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atcacctgca gtgtcagctc aagtataagt tccagcaact tacactggta ccagcagaag 120

tcaggaaact cccccaaacc ctggatttat ggcacatcca atcttgcttc tggagtccct 180

gttcgcttca gtggcagtgg atctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgtcaa cagtggagta gttacccact cacgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaa 324

<210> 21

<211> 606

<212> DNA

<221> RBD基因

<400> 21

atgaacatca ccaacctgtg ccccttcggc gaggtgttca acgccacccg cttcgccagc 60

gtgtacgcct ggaaccgcaa gcgcatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac 120

aacagcgcca gcttcagcac cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac 180

ctgtgcttca ccaacgtgta cgccgacagc ttcgtgatcc gcggcgacga ggtgcgccag 240

atcgcccccg gccagaccgg caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc 300

accggctgcg tgatcgcctg gaacagcaac aacctggaca gcaaggtggg cggcaactac 360

aactacctgt accgcctgtt ccgcaagagc aacctgaagc ccttcgagcg cgacatcagc 420

accgagatct accaggccgg cagcaccccc tgcaacggcg tggagggctt caactgctac 480

ttccccctgc agagctacgg cttccagccc accaacggcg tgggctacca gccctaccgc 540

gtggtggtgc tgagcttcga gctgctgcac gcccccgcca ccgtgcacca ccaccaccac 600

cactaa 606

<210> 22

<211> 200

<212> PRT

<221> RBD

<400> 22

Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg

1 5 10 15

Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val

20 25 30

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

35 40 45

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

50 55 60

Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile

65 70 75 80

Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro

85 90 95

Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp

100 105 110

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

115 120 125

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

130 135 140

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

165 170 175

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

180 185 190

Thr Val His His His His His His

195 200