一株微黄微杆菌及在堆肥中的应用

技术领域

本发明属于微生物堆肥领域，具体涉及一株微黄微杆菌及在堆肥中的应用。

背景技术

高温堆肥是实现有机废弃物无害化和资源化处理常用手段。然而，利用以低C/N为主或含氮量较高的有机原料进行堆肥时，通常会出现包括氨挥发氮损失(可达总量的30％～75％)在内的过程控制难题以及由此引发的环境污染。这种不利因素不仅会增加运行成本，同时也降低了堆肥品质，还会造成难以处理的环境污染。因此，避免和降低氨挥发一直是堆肥工艺的研究重点。

现有报道中，有研究人员采用接种氨氧化-亚硝酸氧化细菌同时添加天然物质(沸石、黏土和椰壳纤维等)的方法，调控堆肥氮素转化过程，以期达到减少氨挥发氮损失的目的。但这些方法普遍存在氨挥发抑制作用较弱和氮损失控制效果不佳等问题。这是因为大部分外源添加物发挥作用的机理均以物理吸附为主，且氨氮吸附能力有限。

如果采用氮素调控(NH

发明内容

本发明的目的是提供一株微黄微杆菌及在堆肥中的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株微黄微杆菌(Microbacterium luteolum)WSO-4，于2022年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.25939。

优选的，所述微黄微杆菌的16S rDNA如SEQ ID NO：1所示。

相应的，所述微黄微杆菌在堆肥中的应用。

相应的，利用所述微黄微杆菌制备的微生物菌剂。

相应的，一种微生物菌剂，包括所述微黄微杆菌。

优选的，所述微生物菌剂，还包括红细菌(Rhodobacter sp.)和别许旺氏菌(Alishewanella aestuarii)中的任意一种或两种。

优选的，所述红细菌于2016年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12631；

和/或；

所述别许旺氏菌于2016年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12882。

相应的，所述微生物菌剂，按活菌量，所述微生物菌剂中，微黄微杆菌、红细菌和别许旺氏菌的用量关系为：2：(0～2)：(0～2)。

相应的，一种堆肥方法，在堆肥原料中添加硫单质。

优选的，在堆肥原料中还接种所述的微生物菌剂。

本发明具有以下有益效果：本发明在好氧堆肥过程中添加单质硫，可有限降低堆肥中的氨挥发。同时，针对硫的转化率较低的问题，本发明还进一步提供了微生物菌制剂，利用微生物对硫单质进行氧化、转化。在微生物联合作用下，单质硫在堆肥中的氧化以生物学过程为主，氧化途径为：S

附图说明

图1为微黄微杆菌WSO-4在硫氧化培养基B中生长的菌落图；

图2为微黄微杆菌WSO-4的扫描电镜图；

图3为微黄微杆菌WSO-4 16S rDNA测序进化树示意图；

图4实施例四各组堆肥过程中氨挥发速率对比示意图。

具体实施方式

本发明提供了一株新的微黄微杆菌(Microbacterium luteolum)WSO-4，其16SrDNA如SEQ ID NO：1所示，于2022年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.25939。所述微黄微杆菌具有氧化/转化单质硫的作用。

本发明还提供了一种微生物菌剂，包括所述微黄微杆菌，还包括红细菌(Rhodobacter sp.)和别许旺氏菌(Alishewanella aestuarii)中的任意一种或两种。优选的方案为，所述红细菌为红细菌DS-17，于2016年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12631，其16S rDNA如SEQ ID NO：2所示；所述别许旺氏菌为别许旺氏菌DS-21，于2016年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12882，其16S rDNA如SEQ ID NO：3所示。

更优选的方案为：按活菌量，所述微生物菌剂中，微黄微杆菌、红细菌和别许旺氏菌的用量关系为：2：(0～2)：(0～2)，优选为2:1:0或2:0:1或2:1:1或2:1:2或2:2:1。

一种可选的实施方式中，所述微生物菌剂中还包括辅料/垫料，例如麸皮。可选的实施方式中，所述微生物菌剂的制备方法为：将相同活菌体浓度的微黄微杆菌、红细菌和别许旺氏菌发酵液按2：(1～2)：(1～2)体积比混匀后，加入与整体发酵液等质量的麸皮(粒径≤40目)进行吸附，随后常温环境晾至含水量≤30％，即得。

本发明还提供了一种利用所述微黄微杆菌或所述微生物菌剂抑制堆肥中氨挥发的方法，具体包括如下步骤：分析测定堆肥原料中的碱解氮含量，在堆肥前加入碱解氮总摩尔数0.4～0.6倍的单质硫粉，再按1‰或2‰的质量比接入所述微黄微杆菌或所述微生物菌剂，混合均匀后按照正常程序进行好氧堆肥即可。

通过测定原料中的碱解氮可判断堆肥过程中可能产生的游离氨总量。发明人发现：在堆肥前加入适量的单质硫，同时利用硫氧化细菌将其氧化成亚硫酸和硫酸，可实现吸收、固定游离氨的目的，有效降低堆肥中的氨挥发。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。

实施例一：堆肥中添加单质硫的效果展示

禽类消化道较短，饲料中营养物质不能被充分消化吸收，故禽类粪便中剩余的营养物质较多，其中的全氮含量可达1.63％。利用家禽粪便作原料堆肥时，氨挥发现象尤为严重，极易导致氮素损失，造成环境恶臭。故本发明实施例中均选取鸡粪作为堆肥原料。

将鸡粪与花生壳粉按照4：1的质量比均匀混合，取样测定原料中的含水率和碱解氮(AHN)含量(采用碱解蒸馏法测定，取样量为0.5g并精确至0.001g，氢氧化钠浓度为4.5mol/L)。碱解氮是堆肥原料所含铵态氮、氨基酸、酰胺和易降解的蛋白质氮的总和，能反应物料在堆肥过程中可以转化形成氨氮的量。

将原料分装为5组，每组做3个平行，每个平行为有效容积均为1m

堆肥结束后，再次称重并取样测定堆肥的含水率、pH、NH

表1不同比例单质硫添加对堆肥相关理化指标的影响

结果显示：在堆肥原料中添加单质硫粉可有效解决堆肥产物pH过高和氨挥发氮损失的问题，且该效果在一定范围内与单质硫粉添加量呈正比。此外，添加单质硫粉后，堆肥产品中的硫酸根含量也有了大幅提升，这对于解决目前中国土壤普遍缺硫的现状十分有利。

实施例二：堆肥单质硫氧化微生物的筛选

根据实施例一，虽然在堆肥中添加单质硫粉能够在一定程度上抑制氨挥发，但单质硫粉在堆肥中的氧化率却处于较低水平(11.50％～29.53％)，大部分单质硫并未氧化/转化。这些单质硫会随着堆肥产品的转移施用进入土壤，虽然这也能够补充土壤有效硫含量，但其在土壤中有效化的过程存在酸化效应，长期施用可能导致土壤酸化，破坏土壤结构和微生态平衡。

为了解决这一问题，发明人发现：在堆肥添加单质硫粉的同时，接种硫氧化微生物菌剂是可行的方案。这不仅可以提升堆肥中单质硫的氧化效率，减少单质硫粉的添加比例，还可以避免单质硫粉因未完全氧化进入土壤造成pH下降的不利影响，同时特定微生物还可能对堆肥起到一定的促进作用。

本实施例使用的培养基和溶液包括：

富集驯化培养基：MgSO

活化培养基：MgSO

硫氧化培养基A(自养)：MgSO

硫氧化培养基B(异养)：牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，MgSO

鸡粪模拟培养基：鸡粪原料50g、单质硫粉0.64g、去离子水0.5L，自然pH，不灭菌。

微量元素溶液I：EDTA-2Na 0.71g/L和FeSO

微量元素溶液Ⅱ：ZnSO

1、硫氧化细菌的分离和初步筛选。

样品：本实施例筛选微生物的样品包括：深海热液区沉积物、温泉底泥、生物脱硫氧化池、污水处理厂曝气池活性污泥。

筛选温度：虽然堆肥最高温度一般＞60℃，但该温区常处于堆体核心区域，是氧气含量较低的相对厌氧环境，并不适合对好氧条件要求较高的硫氧化细菌生存。接种硫氧化细菌后，其主要集中在堆体表面及浅层中低温好氧区域，28℃～42℃是该区域的主要温度区间，因此本实施例选择35℃作为筛选温度。

富集驯化：取5g样品置于500mL锥形瓶中，加入200mL液体富集驯化培养基，于35℃、210r/min下进行避光好氧富集驯化，当培养基颜色发生变化后，取2.5mL的培养液转至新的液体富集驯化培养基中，相同条件下重复富集3次。

分离纯化：根据培养基的颜色变化，将最终富集培养物做梯度稀释，稀释倍数为10

硫氧化能力验证：将分离纯化的各菌株，分别接种于盛有50mL活化培养基的150mL三角瓶中，放置于35℃、210r/min的振荡培养箱内，连续培养6～10天，获得种子液。将各种子液静置15min，取上清液，无菌条件，4℃离心5min，收集菌体。用0.9％的生理盐水洗涤3～4次后，重悬于活化培养基中(利用培养基本身作参比，调至OD

表2部分备选微生物名称来源及及其硫氧化能力

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根据表2，A

2、硫氧化细菌的再次筛选：在鸡粪培养条件下的硫氧化能力及对pH的影响。

将表2筛选出表现较好的菌株分别制成种子液并稀释至相同的菌体浓度，具体制备方法同步骤1的初步筛选。按5％(v/v)的接种比例分别接种于盛有500mL鸡粪模拟培养基的2L三角瓶中，于35℃、210r/min的振荡培养箱内连续培养10天，测定各培养基的pH和硫酸根浓度(铬酸钡光度法)，以其余条件相同、接种等量灭菌活化培养基替代接种菌种作对照，每个处理3个重复，结果如表3所示。表3中不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05，n＝3)，下同。

表3各优势菌株在鸡粪培养基发酵效果一览表

由表3可知，不同来源的硫氧化菌在鸡粪培养基中的硫氧化能力差异较大，废水、污泥来源的硫氧化细菌(WSO-4、DS-17、DS-21)硫氧化效果更优异。海洋沉积物与热泉底泥源的优势菌株在该条件的硫氧化能力相对较弱，可能因为此类微生物难以适应禽类底物堆肥环境，未能形成有效的功能种群。所以，复筛选择WSO-4、DS-17和DS-21。

3、硫氧化细菌的鉴定：DS-17鉴定为红细菌，于2016年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12631。该微生物已在专利CN106434486B中公开，其鉴定过程和生理生化特征在此不再赘述。DS-21鉴定为别许旺氏菌，于2016年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12882。该微生物已在专利CN106591175B中公开，其鉴定过程和生理生化特征在此不再赘述。

WSO-4在硫氧化培养基B中的菌落形态图如图1所示，电镜扫描图如图2所示，16SrDNA测序进化树如图3所示。根据其16S rDNA测序结果，鉴定为Microbacterium luteolum，微黄微杆菌。其生理生化特征包括：革兰氏染色阴性，菌落呈黄色圆形，表面光滑湿润、不透明，中央微凸，边缘整齐，易挑取有粘性；菌体短杆状(长0.8～2μm，宽0.6～0.8μm)；适宜生长条件为：20～45℃，pH 5～8。

4、同种其他微生物在鸡粪培养基条件下的硫氧化能力及对pH的影响。按步骤2的复筛方法，选择同种其他微生物，测试在鸡粪培养条件下的硫氧化能力及对pH的影响，结果如表4所示。

表4优势菌株在鸡粪培养基中的硫氧化能力及其与pH的关系

结果显示：同种其他微生物的硫氧化效果明显弱于WSO-4、DS-17、DS-21。

实施例三：堆肥单质硫氧化微生物菌剂的选择和制备

1、三种微生物的拮抗试验：吸取WSO-4、DS-17和DS-21的种子液0.2mL分别均匀涂布于固体硫氧化培养基B上，获得分别以WSO-4、DS-17和DS-21为底层菌面的单菌平板。随后在无菌条件下，将分别蘸有除涂布菌外的另两种菌株种子液的滤纸片，粘贴在各单菌平板上，每种菌株重复3次，处理完成后将平板倒置于35℃培养箱中10d，观察并记录菌株的拮抗情况。如果滤纸片周围出现生长真空圈，则说明滤纸片上的微生物与平板上的微生物间存在拮抗作用。

结果显示：WSO-4、DS-17和DS-21三菌株之间均不存在拮抗作用，这可能是因为三种微生物的来源相同或近似，且在同一环境下驯化的。

2、微生物菌剂中三种微生物比例的确定：将WSO-4、DS-17和DS-21的种子液制备成菌体浓度相同的备用种子液，将各备用种子液分别按0:1:1；0:1:2；1:0:1；1:0:2；1:1:0；1:1:1；1:1:2；1:2:0；1:2:1；1:2:2；2:0:1；2:1:0；2:1:1；2:1:2；2:2:1的体积比混合后制成各备用接种液，按5％(v/v)的接种比例分别接种于盛有500mL鸡粪模拟培养基的2L三角瓶中，置于35℃、210r/min的振荡培养箱内，连续培养10天后测定培养基的pH和硫酸根浓度，以接种等量灭菌活化培养基替代接种备用接种液作对照，每个处理3个重复，结果如表5所示。

表5不同比例混合接种液在鸡粪碳源条件下的硫氧化效果

结果显示：由不同比例的WSO-4、DS-17和DS-21三菌株组成的混合硫氧化菌剂对处理鸡粪模拟培养基后，溶液pH在6.13～7.15之间，SO

硫氧化菌剂的菌种以及比例选择：由于WSO-4、DS-17和DS-21按照1:0:1；1:1:0；2:0:1；2:1:0；2:1:1；2:1:2和2:2:1比例作混合接种液处理含硫鸡粪后的SO

3、硫氧化菌剂的制备：将WSO-4、DS-17和DS-21分别接种到硫氧化培养基B进行发酵扩培，扩培结束(菌体浓度≥10

实施例四：堆肥单质硫氧化微生物菌剂的效果展示

将新鲜的鸡粪与花生壳粉按照质量比为4:1的比例均匀混合，制垛，每个条垛宽3m×高1.5m×长50m。需要说明的是：为更贴近实际生产情况，本实施例在堆肥厂中进行，利用铲车配料，较为粗放，所以容重同实施例1中略有区别，约为0.52t/m

堆肥期间，每天于翻堆前利用静态箱-气相色谱法测定堆肥表面的氨挥发强度，静态箱中心应尽量靠近堆肥长侧面腰线。堆肥结束后，取样，每个条垛取6个样，测定pH、氨氮、全氮、硫酸根、单质硫含量，对结果取平均值。结果如表6所示。各组堆肥过程中氨挥发速率如图4所示。

表6各组堆肥效果展示

结果显示：与空白对照组(组1)相比，条件对照组(组2)和各试验组堆肥产物pH均存在明显下降，其中组4(接种量为1‰)和组5(接种量为2‰)堆肥产物pH相对最低且较为接近。因此，实践中选择1‰的比例接种更具经济性。

根据图4可以看出，仅添加单质硫粉的处理(组2)虽然能够在一定程度上抑制氨挥发，但与同时添加单质硫粉和硫氧化菌剂的处理相比，抑制效果仍存在较大差距。同时结果显示，与组1相比，组2的氨挥发速率明显降低，氨挥发氮损失累计总量(积分运算结果显示约为201.21kg N/条垛)下降56.83％。组2的氨挥发速率的峰值出现日期也有一定程度的延迟，证明在堆肥中添加单质硫粉后，游离氨在堆肥中的数量降低、累积变慢。

在堆肥过程中组3、组4、组5可有效降低氨挥速率，避免单质硫粉在堆肥中大量残留，保留堆肥终产物中的氮素。组3较组2，氨挥发氮损失累计总量进一步下降52.20％，约为96.17kg N/条垛；组4和组5氨挥发氮损失累计总量分别为41.60kg N/条垛和30.47kg N/条垛，较组2分别下降79.32％和84.86％，较组1分别下降91.07％和94.36％，两处理在保留堆肥氮元素和控制作业环境方面效果相当。

综上，在堆肥过程中适当添加单质硫粉，并按照1‰的比例接种硫氧化菌剂，可有效降低堆体pH、避免发酵过程氨挥发、保留堆肥氮元素、提高产品硫含量，性价比高。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。