昆虫细胞内细胞穿透肽介导的RNA转导

序列表的引用

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技术领域

本公开总体上涉及分子生物学领域，并且在特定实施例中，涉及在昆虫和昆虫细胞内递送RNA分子的领域。在某些方面，RNA分子由细胞穿透肽(CPP)递送。进一步的方面包括开发具有RNA分子和细胞穿透肽的复合物。其他方面包括开发具有信使RNA(mRNA)和细胞穿透肽的复合物。一些方面包括开发具有RNAi介导分子和细胞穿透肽的复合物。一些方面包括开发具有双链RNA(dsRNA)分子和细胞穿透肽的复合物。因此，本公开提供了用于鉴定、检测和利用在昆虫和昆虫细胞内递送分子的组合物和方法。

背景技术

控制作物田地中的昆虫群体在经济上对于现代农业实践是必要的。例如，美国农业部估计玉米根虫(例如西方玉米根虫)导致每年10亿美元的收益损失。用于昆虫控制的转基因植物的部署提供了化学杀昆虫剂的替代方案。化学杀昆虫剂使用是不完美的昆虫控制策略。大量昆虫幼虫群体、暴雨、和一种或多种杀昆虫剂的不适当应用都可能导致昆虫控制不足。此外，一种或多种杀昆虫剂的连续使用可能选择昆虫的杀昆虫剂抗性品系，并且由于对非靶物种的毒性，可能造成重大的环境问题。

RNA抑制/干扰(RNAi介导)分子的转基因表达可以用于通过抑制从活生物体内的表达靶基因转录RNA来调节一个或多个靶基因的表达。这些非蛋白编码的RNAi介导分子指导靶mRNA转录物的切割，由此负调节基因的表达(Ambros(2001)Cell[细胞]107(7)：823-6；Bartel(2004)Cell[细胞]116(2)：281-97)。在植物细胞中转基因表达RNAi介导分子以控制昆虫有害生物的应用正在开发中，以用作作物保护剂。RNAi允许通过阻遏靶基因mRNA的表达来抑制昆虫内的靶基因，并且先前已在转基因植物应用中举例说明。基于RNAi的技术有望用于作物田地的抗昆虫管理系统。然而，对基于RNAi的昆虫控制机制的进一步研究使人们认识到，一旦昆虫对特定的RNAi介导分子产生抗性，这种抗性也适用于靶向其他基因的RNAi介导分子(Khajuria C等人(2018)Development and characterization of thefirst dsRNA-resistant insect population from western corn rootworm，Diabroticavirgifera virgifera LeConte.[来自西部玉米根虫-玉米根萤叶甲的第一个dsRNA抗性昆虫种群的发展和表征]PLoS ONE[公共科学图书馆-综合]13(5)：e0197059，和Yoon JS等人Double stranded RNA binding protein，Staufen，is required for the initiation ofRNAi in coleopteran insects.[双链RNA结合蛋白Staufen是鞘翅目昆虫中的RNAi启动所必需的]Proc Natl Acad Sci USA.[美国国家科学院院刊]2018年8月14日；115(33)：8334-8339.doi：10.1073/pnas.1809381115.电子公开于2018年7月30日.PMID：30061410；PMCID：PMC6099913.)。迫切需要改进的组合物和方法来克服昆虫对基于RNAi的技术产生抗性的潜在发展。因此，需要具有针对可能对现有RNAi技术产生抗性的各种昆虫有害生物的活性的新颖作用模式。

发明内容

本文公开了用于包含细胞穿透肽和RNA分子的RNA复合物的序列、构建体和方法，其中该细胞穿透肽选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：66，并且其中该一种或多种RNA分子选自：RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；以及mRNA分子。在一些方面，RNA分子通过共价键与细胞穿透肽连接。在其他方面，RNA分子通过非共价键与细胞穿透肽连接。在进一步的方面，RNA分子通过衔接子或接头与细胞穿透肽连接。在另外的方面，细胞穿透肽与RNA分子的N末端连接。在其他方面，细胞穿透肽与RNA分子的C末端连接。在进一步的方面，细胞穿透肽在内部通过肽主链或侧链与RNA分子连接。在另外的方面，RNA分子与细胞穿透肽以约1∶1至约1∶1000之间的摩尔比连接。在进一步的方面，细胞穿透肽与RNA分子以约1∶1000至1∶1之间的摩尔比连接。

本公开提供了一种将目的分子引入昆虫细胞的方法，该方法包括：提供该昆虫细胞；使该细胞穿透肽与RNA分子相互作用以形成RNA复合物；将该昆虫细胞和该RNA复合物相互接触；并使该RNA复合物摄取到该昆虫细胞中。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。在一些方面，使RNA分子和细胞穿透肽相互作用包括融合RNA分子和细胞穿透肽。在进一步的方面，昆虫细胞选自下组：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、和毛翅目(Trichoptera)。在其他方面，mRNA分子包含编码序列。在另外的方面，编码序列被翻译成蛋白质。在其他方面，编码序列编码农艺性状。在一些方面，农艺性状是杀昆虫抗性性状。在进一步的方面，农艺性状包含转基因性状。在其他方面，离体、体内或体外进行接触。

本公开提供了双链RNA(dsRNA)和细胞穿透肽(CPP)，它们可操作地连接以形成能够下调昆虫有害生物的靶mRNA表达的RNA复合物。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。在一些方面，靶mRNA编码靶基因。在进一步的方面，昆虫有害生物的靶mRNA选自由以下组成的组：Caf1-180、RPA70、V-ATP酶H、Rho1、V-ATP酶C、Reptin、PPI-87B、RPS6、COPIγ、COPIα、COPIβ、COPIδ、Brahma、ROP、Hunchback、RNA聚合酶II 140、Sec23、Dre4、Gho、thread、ncm、RNA聚合酶II-215、RNA聚合酶I1、RNA聚合酶II33、Kruppel、Spt5、Spt6、Snap25、SSJ1、CoatG和Prp8。在进一步的方面，将RNA复合物应用于昆虫有害生物。在其他方面，RNA复合物导致转录后基因阻抑或昆虫有害生物的靶mRNA抑制。在另外的方面，昆虫有害生物对未与CPP复合的dsRNA的摄取具有抗性。在一些方面，dsRNA由两个分开的互补RNA序列形成。在其他方面，dsRNA由具有内部互补序列的单个RNA序列形成。

本公开提供一种杀有害生物组合物，其能够抑制或下调昆虫有害生物的靶mRNA的表达，其中该杀有害生物组合物包含RNA复合物。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。在其他方面，杀有害生物组合物被施用于植物。本公开提供了一种通过以下方式培养作物植物或植物细胞：种植该作物植物的种子；从种植的种子生长该作物植物；用杀有害生物组合物处理该作物植物或植物细胞。在一些方面，作物植物产生商品。在其他方面，商品产品选自由以下组成的组：蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、谷物、粗粉、面粉、油、或纤维。在进一步的方面，作物植物选自由双子叶植物或单子叶植物组成的组。例如，单子叶植物是玉蜀黍植物。类似地，双子叶植物是大豆植物。

本公开涉及一种编码RNA复合物的核酸。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。在其他方面，包含核酸的载体。在进一步的方面，包含载体的昆虫细胞。

本公开涉及一种抑制昆虫生长的方法，该方法包括：施用有效量的RNA复合物，其有效抑制昆虫有害生物的靶mRNA的表达。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。在某些方面，昆虫有害生物的靶mRNA选自由以下组成的组：Caf1-180、RPA70、V-ATP酶H、Rho1、V-ATP酶C、Reptin、PPI-87B、RPS6、COPIγ、COPIα、COPIβ、COPIδ、Brahma、ROP、Hunchback、RNA聚合酶II 140、Sec23、Dre4、Gho、thread、ncm、RNA聚合酶II-215、RNA聚合酶I1、RNA聚合酶II 33、Kruppel、Spt5、Spt6、Snap25、SSJ1基因、CoatG基因和Prp8。

本公开涉及一种表现出昆虫病害抗性改善的植物，其中该植物用包含RNA复合物的组合物进行局部处理，并且该植物表现出由于阻遏昆虫有害生物的靶mRNA的表达而导致的昆虫病害抗性改善。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。

本公开涉及一种表现出昆虫病害抗性改善的转基因植物，其中该转基因植物表达包含RNA复合物的组合物，并且该转基因植物表现出由于阻遏昆虫有害生物的靶mRNA的表达而导致的昆虫病害抗性改善。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。

本公开涉及一种用于抗昆虫管理的方法，该包括表达RNA复合物。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。在某些方面，RNA复合物与对转基因植物中的昆虫有害生物具有毒性的一种或多种杀昆虫分子共表达。在其他方面，RNA复合物和其他杀昆虫分子表现出对昆虫有害生物的杀昆虫活性的不同作用模式。在进一步的方面，杀昆虫活性是昆虫死亡或昆虫生长抑制。在另外的方面，所述昆虫有害生物来自：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、或毛翅目。在进一步的方面，其他杀昆虫分子是Cry蛋白。在一些方面，其他杀有害生物分子是VIP蛋白。在另外的方面，转基因植物种植在作物田地内。在进一步的方面，RNA复合物通过阻遏昆虫有害生物的靶mRNA的表达来抑制昆虫有害生物的靶基因。

本公开涉及一种降低对转基因植物有抗性的昆虫有害生物出现的可能性的方法，该方法包括在植物中表达RNA复合物。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。在某些方面，RNA复合物与和RNA复合物相比具有不同作用模式的杀昆虫蛋白组合表达。在进一步的方面，所述昆虫有害生物来自：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、或毛翅目。在其他方面，植物种植在作物田地中。在另外的方面，RNA复合物通过阻遏昆虫有害生物的靶mRNA的表达来抑制昆虫有害生物的靶基因。

本公开涉及一种用于控制昆虫有害生物群体的方法，该方法包括使昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的RNA复合物接触。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。

本公开涉及一种用于控制对RNAi介导分子有抗性的昆虫有害生物群体的方法，该方法包括使昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的RNA复合物接触。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。

本公开涉及一种抑制昆虫有害生物生长或杀伤昆虫有害生物的方法，该方法包括使昆虫有害生物与杀昆虫有效量的RNA复合物接触。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。

本公开涉及一种抑制昆虫有害生物生长或杀伤对RNAi介导分子有抗性的昆虫有害生物的方法，该方法包括使昆虫有害生物与杀昆虫有效量的RNA复合物接触。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。

本公开涉及一种包含RNA复合物的试剂盒。在一些方面，RNA复合物包含可操作地连接至RNA分子的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的细胞穿透肽。在进一步的方面，RNA分子是RNAi介导分子；双链RNA分子；siRNA分子；微小RNA分子；或者，mRNA分子。

根据权利要求书和具体实施方式中提供的以下实施例，前述和其他特征将变得更加显而易见，其参考序列表进行。

序列表

如37C.F.R.§1.822中定义，使用肽残基或核苷酸碱基的标准字母缩写，显示了在所附序列表中列出的氨基酸或核酸序列。仅示出每个核酸序列的一个链，但是通过对展示的链的任何提及，应理解为包括互补链和反向互补链。因为一级核酸序列的互补序列和反向互补序列必然由一级序列公开，所以通过对核酸序列的任何提及，都包括互补序列和反向互补序列，除非另外明确指明(或从其中出现序列的上下文中另外清楚可见)。

附图说明

图1未标记的(A)和经Cy3标记的(B)dvssj1片段1dsRNA的特征。图1A，当21ng、42ng或63ng(泳道1-3)在6％Tris-硼酸-EDTA聚丙烯酰胺凝胶上电泳并用

图2通过凝胶迁移测定评估的CPP·dsRNA复合物的形成。图2A如实例3所述组装反应，添加的MPG-YFP量增加至2.2×10

具体实施方式

在整个申请中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求的清晰一致的理解，包括为给出此类术语的范围，提供了以下定义。

如本文所使用的，冠词“一种/一个(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确且不含糊地指明。

如本文所用的术语“分离的”意指已经从其自然环境中除去，或从首次形成化合物时存在的其他化合物中除去。术语“分离的”涵盖从自然来源分离的材料以及通过在宿主细胞中重组表达制备后回收的材料(例如，核酸和蛋白质)、或化学合成的化合物，如核酸分子、蛋白质和肽。

如本文所使用的，术语“纯化的”涉及分子或化合物的分离，该分子或化合物以基本上不含通常与在天然或自然环境中的分子或化合物关联的污染物，或者基本上在相对于化合物初次形成时存在的其他化合物的浓缩中富集的，并且意指由于与原始组合物中的其他组分分离而纯度提高了。本文使用的术语“纯化的核酸”来描述已经与其他生物化合物分离的、分离产生的或纯化的核酸序列，这些其他生物化合物包括但不限于多肽、脂质和碳水化合物，同时影响组分中的化学或功能改变组分(例如，可以通过去除蛋白质污染物并断开将核酸与染色体中其余DNA连接的化学键，从染色体上纯化核酸)。

如本文所使用的，术语“合成的”是指经由化学合成作为体外过程产生的多核苷酸(即，DNA或RNA)分子。例如，可以在Eppendorf

如本文所使用的术语“约”意指大于或小于所陈述的值或值的范围的百分之十，但并非旨在仅针对此更宽泛的定义来指定任何值或值的范围。术语“约”之后的每个值或值的范围也旨在涵盖所陈述绝对值或值的范围的实施例。

出于本公开的目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区域(参见下文)，以及调节该基因产物的产生的所有DNA区域，无论此类调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不限于启动子序列、终止子、翻译调节序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点、内含子和基因座控制区。

如本文所使用的，术语“天然的”或“自然的”定义了天然存在的状况。“天然DNA序列”是自然界中存在的DNA序列，其是通过自然手段或传统育种技术产生的，但不是通过基因工程(例如，使用分子生物学/转化技术)产生的。

如本文所使用的，“转基因”被定义为编码基因产物的核酸序列，该基因产物包括例如但不限于mRNA。在一个实施例中，转基因/异源编码序列是外源核酸，其中通过基因工程将转基因/异源编码序列引入宿主细胞(或其后代)，其中通常找不到转基因/异源编码序列。在一个实例中，转基因/异源编码序列编码工业上或药学上有用的化合物，或编码希望的农艺性状的基因(例如，除草剂抗性基因)。在又另一个实例中，转基因/异源编码序列是反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。在一个实施例中，转基因/异源编码序列是内源核酸，其中希望的是内源核酸的另外的基因组拷贝，或相对于宿主生物体中靶核酸的序列处于反义方向的核酸。

如本文所定义的“基因产物”是由基因产生的任何产物。例如，基因产物可以是基因(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、干扰RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质的直接转录产物。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑等方法修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻化和糖基化修饰的蛋白质。基因表达可能受到外部信号(例如，将细胞、组织或生物体暴露于增加或减少基因表达的试剂)的影响。基因的表达也可以在从DNA到RNA到蛋白质的途径中的任何地方受到调控。基因表达的调控例如通过对转录、翻译、RNA转运和加工，中间分子(如mRNA)的降解起作用的控制或通过在制造特定蛋白质分子后将其活化、失活、区室化或降解或者通过其组合而发生。可以通过本领域已知的任何方法(包括但不限于RNA印迹、RT-PCR、蛋白质印迹或一种或多种体外、原位或体内蛋白活性测定)在RNA水平或蛋白质水平上测量基因表达。

如本文所使用的，术语“基因表达”涉及这样的过程，通过该过程，核酸转录单位(包括例如基因组DNA)的编码信息通常被转化为细胞的可操作的、不可操作的、或结构的部分，经常包括蛋白质的合成。基因表达会受到外部信号的影响；例如，细胞、组织或生物体暴露于增加或减少基因表达的药剂。基因的表达也可以在从DNA到RNA到蛋白质的途径中的任何地方受到调控。基因表达的调控例如通过对转录、翻译、RNA转运和加工，中间分子(如mRNA)的降解起作用的控制或通过在制造特定蛋白质分子后将其活化、失活、区室化或降解或者通过其组合而发生。可以通过本领域已知的任何方法(包括但不限于RNA印迹、RT-PCR、蛋白质印迹或一种或多种体外、原位或体内蛋白活性测定)在RNA水平或蛋白质水平上测量基因表达。

如本文所使用的，术语“核酸分子”(或“核酸”或“多核苷酸”)可以指核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、互补DNA(cDNA)、基因组DNA以及上述的合成形式和混合聚合物的有义链和反义链二者。核苷酸可以指核糖核苷酸(RNA)、脱氧核糖核苷酸(DNA)或任何一种核苷酸的修饰形式。如本文所使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。除非另有说明，否则核酸分子的长度通常至少为10个碱基。所述术语可以指长度不确定的RNA或DNA分子。该术语包括DNA和RNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括通过自然存在的和/或非自然存在的核苷酸键连接在一起的自然存在的核苷酸和修饰的核苷酸之一或二者。

如本领域技术人员将容易理解的，核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或可以含有非自然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个自然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，不带电荷的键：例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯等；带电荷的键：例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等；下垂部分：例如，肽；嵌入剂：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷基化剂；和修饰的键：例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体、三链体、发夹、环状和挂锁构象。

转录沿着DNA链以5′到3′的方式进行。这意味着RNA是通过在生长链的3′末端顺序添加核糖核苷酸5′-三磷酸(必需消除焦磷酸盐)而制备的。在线性或环状核酸分子中，如果离散元件(例如特定的核苷酸序列)在另一元件的5′方向上结合同一核酸或将要结合同一核酸，则离散元件可以称为位于相对于那个元件的“上游”或“5′”端。同样地，如果离散元件在另一元件的3′方向上结合同一核酸或将结合同一核酸，则这些离散元件可以位于相对于那个元件的“下游”或“3′”端。

如本文所使用的，碱基“位置”是指给定碱基或核苷酸残基在指定核酸内的位置。可以通过与参考核酸比对(参见下文)来定义指定的核酸。

杂交涉及经由氢键结合两个多核苷酸链。寡核苷酸及其类似物通过互补碱基之间的氢键合杂交，包括沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦(Hoogsteen)氢键合。通常，核酸分子由含氮碱基组成，这些含氮碱基是嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合称为“碱基配对”。更特别地，A将与T或U形成氢键，并且G将与C形成氢键。“互补”是指两个不同的核酸序列或同一核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基配对。

“特异性可杂交”和“特异性互补”是表示足够程度的互补性的术语，使得在寡核苷酸与DNA或RNA靶标之间发生稳定且特异性的结合。寡核苷酸不必与其靶序列100％互补即可特异性杂交。当寡核苷酸与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能时，寡核苷酸可特异性杂交，并且具有足够程度的互补性以避免寡核苷酸与非靶序列在希望特异性结合的条件下(例如在体内测定或系统的情况中在生理条件下)的非特异性结合。这种结合称为特异性杂交。

导致特定严格性程度的杂交条件将根据所选择的杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na

如本文所使用的，“严格条件”涵盖仅在杂交分子与DNA靶之间的错配小于50％时才发生杂交的条件。“严格条件”包括进一步的特定严格性水平。因此，如本文所使用的，“中严格性”条件是序列错配率超过50％的分子不会杂交的条件；“高严格性”条件是错配率超过20％的序列不会杂交的条件；并且“非常高严格性”条件是错配率超过10％的序列不会杂交的条件。

在特定的实施例中，严格条件可以包括在65℃下杂交，然后在65℃下用0.1x SSC/0.1％SDS洗涤40分钟。以下是代表性的非限制性的杂交条件：非常高严格性：在65℃下，在5x SSC缓冲液中杂交16小时；在室温下在2x SSC缓冲液中洗涤两次，每次持续15分钟；并且在65℃下在0.5x SSC缓冲液中洗涤两次，每次持续20分钟。高严格性：在65℃-70℃下，在5x-6x SSC缓冲液中杂交16-20小时；在室温下，在2x SSC缓冲液中洗涤两次，每次5-20分钟；并且在55℃-70℃下在1x SSC缓冲液中洗涤两次，每次持续30分钟。中严格性：在室温至55℃下在6x SSC缓冲液中杂交16-20小时；在室温至55℃下在2x-3x SSC缓冲液中洗涤至少两次，每次持续20-30分钟。

在特定的实施例中，特异性杂交的核酸分子可以在非常高严格性杂交条件下保持结合。在这些和进一步的实施例中，特异性杂交的核酸分子可以在高严格性杂交条件下保持结合。在这些和进一步的实施例中，特异性杂交的核酸分子可以在中严格性杂交条件下保持结合。

如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指短核酸聚合物。寡核苷酸可以通过切割更长的核酸区段或通过聚合单个核苷酸前体来形成。自动化合成仪允许合成长度长达数百个碱基对的寡核苷酸。因为寡核苷酸可以与互补的核苷酸序列结合，所以它们可以用作检测DNA或RNA的探针。由DNA组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可以用于PCR(扩增DNA序列的技术)。在PCR中，寡核苷酸典型地称为“引物”，它允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。

术语“百分比序列同一性”或“百分比同一性”或“同一性”可互换使用，是指基于在两个或更多个氨基酸或核苷酸序列之间进行比较的序列中相应同一位置之间的同一匹配的序列比较。百分比同一性是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分例如核苷酸或氨基酸的比对窗口中不变的程度。本领域已知的杂交实验和数学算法可用于确定百分比同一性。存在许多数学算法作为本领域已知的计算序列百分比同一性的序列比对计算机程序。这些程序可以分为全局序列比对程序或局部序列比对程序。

全局序列比对程序通过端对端比较比对以找到精确匹配，将精确匹配的数目除以较短序列的长度，然后乘以100，计算出两个序列的百分比同一性。基本上，当两个序列最佳比对(具有适当的核苷酸插入、缺失或缺口)时，参考(“查询”)多核苷酸分子的线性多核苷酸序列与测试(“受试者”)多核苷酸分子相比，同一的核苷酸的百分比。

本地序列比对程序在计算上相似，但是仅比较序列的比对片段，而不是利用端到端分析。例如基本局部比对搜索工具(BLAST)的局部序列比对程序可用于比较两个序列的特定区域。两个序列的BLAST比较会产生E值或期望值，该值表示具有得分等于或优于原始比对得分(S)的不同比对的数量，可能偶然在数据库搜索中发生。E值越低，匹配越显著。因为数据库大小是E值计算中的一个元素，所以对于任何给定的查询/条目匹配，通过BLASTing针对公共数据库(如GENBANK)获得的E值通常随着时间的推移而增加。在设定多肽功能预测的置信度标准时，“高”BLAST匹配在本文中被认为具有对于最高BLAST命中而言的E值小于1e

术语“相似性”是指氨基酸序列之间的比较，并且不仅考虑对应位置的同一的氨基酸，而且考虑对应位置的功能上相似的氨基酸。因此，除了序列相似性之外，多肽序列之间的相似性还指示功能相似性。

术语“同源性”有时用于指两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的相似性水平，以位置同一性(即序列相似性或同一性)的百分比表示。同源性也指进化相关性的概念，通常通过共享相似序列的不同核酸或蛋白质之间的相似功能特性来证明。

如本文所使用的，术语“变体”是指基本相似的序列。就核苷酸序列来说，可使用本领域熟知的分子生物学技术来鉴定自然存在的变体，诸如像用本文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。

对于核苷酸序列，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所使用的，“天然”核苷酸序列包括自然存在的核苷酸序列。就核苷酸序列来说，可使用本领域熟知的分子生物学技术来鉴定自然存在的变体，例如，用以下概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。核苷酸序列变体还包括人工合成的核苷酸序列，比如那些采用定点诱变技术产生的核苷酸序列。通常，如通过本文别处所描述的序列比对程序和参数确定的，本公开的特定核苷酸序列的变体将与该特定的核苷酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。本公开的核苷酸序列的生物活性变体可能与该序列相差只有1至15个核酸残基，只有1至10个，如6至10个，只有5个，只有4、3、2个，或甚至只有1个核酸残基。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”涉及当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，当启动子影响编码序列的转录或表达时，该启动子可操作地连接到编码序列。当重组产生时，可操作地连接的核酸序列通常是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们在同一阅读框中。然而，元件不必连续地可操作地连接。

如本文所使用的，术语“口服活性的”是指当被昆虫有害生物口服摄食时，抑制昆虫有害生物的增殖的分子。

如本文所使用的，术语“杀昆虫活性”是指生物体或物质(例如，像蛋白质)的活性，所述活性可以通过但不限于昆虫死亡、昆虫重量损失、繁殖减少、昆虫抵抗性、以及取食和暴露适当时长后昆虫的其他行为和物理变化来度量。因此，具有杀昆虫活性的生物体或物质不利地影响昆虫适应度的至少一个可测量的参数。

“可读框”是以起始密码子(例如甲硫氨酸(ATG))开始并以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束并编码蛋白质或肽的连续DNA区段。

“聚A尾”是mRNA的区域，它位于包含多个连续腺苷一磷酸的3’UTR的下游，例如直接下游(即3′)。聚A尾可包含10到300个腺苷一磷酸。例如，聚A尾可包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个腺苷一磷酸。在一些实施例中，聚A尾包含50至250个腺苷一磷酸。在相关的生物环境中(例如，在细胞中，体内等)，聚(A)尾的功能是保护mRNA免受酶促降解，例如在细胞质中，并有助于转录终止、mRNA从细胞核输出和翻译。

如本文所使用的，术语“有害生物”是指不希望的并且对农作物的生长和发育具有破坏性或有害性的任何昆虫。术语“昆虫有害生物”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫有害生物包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等，特别是鳞翅目和半翅目。

如本文所使用的，术语“稳定转化”或“稳定地转化”旨在意指被引入植物中的核苷酸构建体整合到所述植物的基因组中并且能够由其后代继承。“瞬时转化”旨在表示将多核苷酸引入植物中并且不整合到所述植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。“植物”旨在表示整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。

如本文所使用的，术语“再生”意指从植物细胞(例如，植物原生质体或外植体)生长植物的过程。

如本文所使用的，术语“培养”是指细胞或生物体在各种培养基上或各种培养基中体外繁殖，使得在一组物理条件下，控制液体培养基内的细胞的维持或生长。应当理解，在培养中生长的细胞的后代可能与亲本细胞不完全同一(即，在形态、基因、或表型上)。

如本文所使用的，术语“控制”(例如，如在“控制昆虫有害生物群体”中)是指监测、处理、最小化、消灭、或预防昆虫有害生物，例如椿象。在特定情况下，控制昆虫种类以减少引起有益植物产量降低的昆虫数量。

如本文所使用的，术语“杀昆虫有效量”是指当存在于昆虫有害生物环境中时具有杀昆虫活性的物质或生物体的量。对于每种物质或生物体，针对在特定环境中受影响的每种有害生物，根据经验确定杀昆虫有效量。类似地，“杀有害生物有效量”可以用来指杀昆虫有效量。

如本文所使用的，术语“杀有害生物蛋白”或“杀昆虫蛋白”旨在是指多肽或与这种蛋白质具有同源性的蛋白质，所述多肽针对以下一种或多种有害生物具有毒性活性，所述有害生物包括但不限于：鳞翅目、双翅目、半翅目以及鞘翅目或线虫门的成员。已经从生物体中分离出杀有害生物蛋白，所述生物体包括例如，芽孢杆菌属(Bacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、发光杆菌属物种、致病杆菌属物种、双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)、和鲍比氏类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。杀有害生物蛋白包括但不限于：来自假单胞菌属物种的杀昆虫蛋白，诸如PSEEN3174(Monalysin，(2011)PLoSPathogens[公共科学图书馆：病原体]，7：1-13)，来自假单胞菌蛋白菌(Pseudomonasprotegens)菌株CHA0和Pf-5(之前为荧光假单胞菌(fluorescens))(Pechy-Tarr，(2008)Environmental Microbiology[环境微生物学]10：2368-2386：GenBank保藏号EU400157)：来自台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)(Liu等人，(2010)J.Agric.Food Chem.[农业食品化学杂志]58：12343-12349)和来自假产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcligenes)(Zhang等人，(2009)Annals of Microbiology[微生物学年报]59：45--50和Li等人，(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.[植物细胞组织和器官培养]89：159-168)的杀昆虫蛋白；来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种的杀昆虫蛋白(Hinchliffe等人，(2010)The Open Toxinology Journal[开放的毒理学杂志]3：101-118和Morgan等人，(2001)Applied and Envir.Micro.[应用与环境微生物学]67：2062-2069)，美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946；以及δ-内毒素，包括但不限于：Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry 28、Cry 29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry 51和Cry55类的δ-内毒素基因以及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)细胞溶解性Cyt1和Cyt2基因。这些苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员包括但不限于Cry1Aa1(登录号M11250)、Cry1Aa2(登录号M10917)、Cry1Aa3(登录号D00348)、Cry1Aa4(登录号X13535)、Cry1Aa5(登录号D17518)、Cry1Aa6(登录号U43605)、Cry1Aa7(登录号AF081790)、Cry1Aa8(登录号I26149)、Cry1Aa9(登录号AB026261)、Cry1Aa10(登录号AF154676)、Cry1Aa11(登录号Y09663)、Cry1Aa12(登录号AF384211)、Cry1Aa13(登录号AF510713)、Cry1Aa14(登录号AY197341)、Cry1Aa15(登录号DQ062690)、Cry1Ab1(登录号M13898)、Cry1Ab2(登录号M12661)、Cry1Ab3(登录号M15271)、Cry1Ab4(登录号D00117)、Cry1Ab5(登录号X04698)、Cry1Ab6(登录号M37263)、Cry1Ab7(登录号X13233)、Cry1Ab8(登录号M16463)、Cry1Ab9(登录号X54939)、Cry1Ab10(登录号A29125)、Cry1Ab11(登录号I12419)、Cry1Ab12(登录号AF059670)、Cry1Ab13(登录号AF254640)、Cry1Ab14(登录号U94191)、Cry1Ab15(登录号AF358861)、Cry1Ab16(登录号AF375608)、Cry1Ab17(登录号AAT46415)、Cry1Ab18(登录号AAQ88259)、Cry1Ab19(登录号AY847289)、Cry1Ab20(登录号DQ241675)、Cry1Ab21(登录号EF683163)、Cry1Ab22(登录号ABW87320)、Cry1Ab样(登录号AF327924)、Cry1Ab样(登录号AF327925)、Cry1Ab样(登录号AF327926)、Cry1Ab样(登录号DQ781309)、Cry1Ac1(登录号M11068)、Cry1Ac2(登录号M35524)、Cry1Ac3(登录号X54159)、Cry1Ac4(登录号M73249)、Cry1Ac5(登录号M73248)、Cry1Ac6(登录号U43606)、Cry1Ac7(登录号U87793)、Cry1Ac8(登录号U87397)、Cry1Ac9(登录号U89872)、Cry1Ac10(登录号AJ002514)、Cry1Ac11(登录号AJ130970)、Cry1Ac12(登录号112418)、Cry1Ac13(登录号AF148644)、Cry1Ac14(登录号AF492767)、Cry1Ac15(登录号AY122057)、Cry1Ac16(登录号AY730621)、Cry1Ac17(登录号AY925090)、Cry1Ae18(登录号DQ023296)、Cry1Ac19(登录号DQ195217)、Cry1Ac20(登录号DQ285666)、Cry1Ac21(登录号DQ062689)、Cry1Ac22(登录号EU282379)、Cry1Ac23(登录号AM949588)、Cry1Ac24(登录号ABL01535)、Cry1Ad1(登录号M73250)、Cry1Ad2(登录号A27531)、Cry1Ae1(登录号M65252)、Cry1Af1(登录号U82003)、Cry1Ag1(登录号AF081248)、Cry1Ah1(登录号AF281866)、Cry1Ah2(登录号DQ269474)、Cry1Ai1(登录号AY174873)、Cry1A样(登录号AF327927)、Cry1Ba1(登录号X06711)、Cry1Ba2(登录号X95704)、Cry1Ba3(登录号AF368257)、Cry1Ba4(登录号AF363025)、Cry1Ba5(登录号AB020894)、Cry1Ba6(登录号ABL60921)、Cry1Bb1(登录号L32020)、Cry1Bc1(登录号Z46442)、Cry1Bd1(登录号U70726)、Cry1Bd2(登录号AY138457)、Cry1Be1(登录号AF077326)、Cry1Be2(登录号AAQ52387)、Cry1Bf1(登录号AX189649)、Cry1Bf2(登录号AAQ52380)、Cry1Bg1(登录号AY176063)、Cry1Ca1(登录号X07518)、Cry1Ca2(登录号X13620)、Cry1Ca3(登录号M73251)、Cry1Ca4(登录号A27642)、Cry1Ca5(登录号X96682)、Cry1Ca6[1](登录号AF215647)、Cry1Ca7(登录号AY015492)、Cry1 Cab(登录号AF362020)、Cry1Ca9(登录号AY078160)、Cry1Ca10(登录号AF540014)、Cry1Ca11(登录号AY955268)、Cry1Cb1(登录号M97880)、Cry1Cb2(登录号AY007686)、Cry1Cb3(登录号EU679502)、Cry1 Cb样(登录号AAX63901)、Cry1Da1(登录号X54160)、Cry1Da2(登录号I76415)、Cry1Db1(登录号Z22511)、Cry1Db2(登录号AF358862)、Cry1Dc1(登录号EF059913)、Cry1 Eat(登录号X53985)、Cry1Ea2(登录号X56144)、Cry1Ea3(登录号M73252)、Cry1Ea4(登录号U94323)、Cry1Ea5(登录号A15535)、Cry1Ea6(登录号AF202531)、Cry1Ea7(登录号AAW72936)、Cry1Ea8(登录号ABX11258)、Cry1Eb1(登录号M73253)、Cry1Fa1(登录号M63897)、Cry1Fa2(登录号M73254)、Cry1Fb1(登录号Z22512)、Cry1Fb2(登录号AB012288)、Cry1Fb3(登录号AF062350)、Cry1Fb4(登录号I73895)、Cry1Fb5(登录号AF336114)、Cry1Fb6(登录号EU679500)、Cry1Fb7(登录号EU679501)、Cry1Ga1(登录号Z22510)、Cry1Ga2(登录号Y09326)、Cry1Gb1(登录号U70725)、Cry1Gb2(登录号AF288683)、Cry1Gc(登录号AAQ52381)、Cry1Ha1(登录号Z22513)、Cry1Hb1(登录号U35780)、Cry1H样(登录号AF182196)、Cry1Ta1(登录号X62821)、Cry1Ia2(登录号M98544)、Cry1Ia3(登录号L36338)、Cry1Ia4(登录号L49391)、Cry1Ia5(登录号Y08920)、Cry1Ia6(登录号AF076953)、Cry1Ia7(登录号AF278797)、Cry1Ia8(登录号AF373207)、Cry1Ia9(登录号AF521013)、Cry1Ia10(登录号AY262167)、Cry1Ia11(登录号AJ315121)、Cry1Ia12(登录号AAV53390)、Cry1Ia13(登录号ABF83202)、Cry1Ia14(登录号EU887515)、Cry1Ib1(登录号U07642)、Cry1Ib2(登录号ABW88019)、Cry1Ib3(登录号EU677422)、Cry1Ic1(登录号AF056933)、Cry1Ic2(登录号AAE71691)、Cry1Id1(登录号AF047579)、Cry1Ie1(登录号AF211190)、Cry1If1(登录号AAQ52382)、Cry1I样(登录号I90732)、Cry1I样(登录号DQ781310)、Cry1Ja1(登录号L32019)、Cry1Jb1(登录号U31527)、Cry1Jc1(登录号I90730)、Cry1Jc2(登录号AAQ52372)、Cry1Jd1(登录号AX189651)、Cry1 Kat(登录号U28801)、Cry1La1(登录号AAS60191)、Cry1样(登录号190729)、Cry2Aa1(登录号M31738)、Cry2Aa2(登录号M23723)、Cry2Aa3(登录号D86064)、Cry2Aa4(登录号AF047038)、Cry2Aa5(登录号AJ132464)、Cry2Aa6(登录号AJ132465)、Cry2Aa7(登录号AJ132463)、Cry2Aa8(登录号AF252262)、Cry2Aa9(登录号AF273218)、Cry2Aa10(登录号AF433645)、Cry2Aa11(登录号AAQ52384)、Cry2Aa12(登录号DQ977646)、Cry2Aa13(登录号ABL01536)、Cry2Aa14(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δ-内毒素的实例还包括但不限于：美国专利号5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利号8,304,604和8.304,605的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白(如Cry1A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N末端缺失)，美国专利申请序列号10/525,318的Cry1B；美国专利号6,033,874的Cry1C；美国专利号5,188,960、6,218,188的Cry1F；美国专利号7,070,982；6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体；Cry2蛋白，例如美国专利号7,064,249的Cry2Ab蛋白；Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白，如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E、和Cry9F家族的成员；Cry15蛋白，描述于以下文献中：Naimov等人(2008)Appliedand Environmental Microbiology[应用与环境微生物学]74：7145-7151；美国专利号6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和CryET34蛋白；美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954，和PCT公开号WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物：美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；US 2008/0295207的TIC807；PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利号8,236,757的AXMI-027、AXMI-036、和AXMI-038；美国专利号7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；US 2004/0250311的AXMI-008；US 2004/0216186的AXMI-006；US 2004/0210965的AXMI-007；US 2004/0210964的AXMI-009；US 2004/0197917的AXMI-014；US2004/0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080r12、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利号8,084,416的AXMI-150；US 20110023184的AXMI-205；US 201I/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063、和AXMI-064；US 2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO 2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO11/103，247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230、和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；US 2010/0298211的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035、和AXMI-045；US 20090144852的AXMI-066和AXMI-076；美国专利号8,318,900的AXMI128、AXMIl30、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMIl67、AXMIl68、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；US 2010/0005543的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；美国专利号8,319,019的具有修饰的蛋白水解位点的Cry蛋白，如Cry1A和Cry3A；以及美国专利申请公开号2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。其他Cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见，Crickmore等人，“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员所熟知的(综述参见vanFrannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101：1-16)。使用Cry蛋白作为转基因植物性状是本领域技术人员所熟知的，并且Cry转基因植物(包括但不限于Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt)已获得监管部门的批准(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech dournal[植物生物技术杂志]9：283-300和CERA(2010)转基因作物数据库环境风险评估中心(CERA)(GM Crop Database Centerfor Environmental Risk Assessment)，ILSI研究基金会，华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。本领域技术人员熟知的多于一种杀有害生物蛋白也可以在植物中表达，这些杀有害生物蛋白如Vip3Ab和Cry1Fa(US 2012/0317682)、Cry1BE和Cry1F(US 2012/0311746)、Cry1CA和Cry1AB(US 2012/0311745)、Cry1F和CryCa(US 2012/0317681)、Cry1DA和Cry1BE(US 2012/0331590)、Cry1DA和Cry1Fa(US 2012/0331589)、Cry1AB和Cry1BE(US 2012/0324606)、以及Cry1Fa和Cry2Aa、Cry1I或Cry1E(US 2012/0324605)。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，这些杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Streptomyces)(Purcell等人(1993)Biochem Biophys Res Commun[生物化学与生物物理学研究通讯]15：1406-1413)。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020中的VIP(营养性杀昆虫蛋白)毒素等。其他VIP蛋白质是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白，所述毒素复合物蛋白可从生物体如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属获得(参见，美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)提高了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的实例包括但不限于莱科毒素(lycotoxin)-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。进一步的实例包括IPD072(PCT/US14/55128)和IPD079(PCT/US2016/041452)。

如本文所使用的，术语“抑制生长”或“生长抑制”意指在一些实施例中，昆虫生物体的生长减少或抑制至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。可以通过测量昆虫的体重或大小来确定昆虫生长的抑制。

如本文所使用的，术语“死亡”是指昆虫的死亡。

如本文所使用的，术语“抗性的”、“抗性”和“宿主植物抗性”是指宿主植物防止或减少被来自下组的有害生物侵染和损害的能力，该组包含：昆虫、线虫、病原体、真菌、病毒、和疾病。

如本文所使用的，术语“抗昆虫转基因产物”可以指“杀有害生物剂”、“Bt”或“Bt多肽”(其中植物保护剂是衍生自苏云金芽孢杆菌的蛋白或其变体)、“非Bt”或“非Bt多肽”(其中植物保护剂是衍生自除苏云金芽孢杆菌以外的细菌或植物(特别是衍生自蕨类植物或其他原始植物)的蛋白或其变体)、或“RNA”(其中植物保护剂是RNA分子，特别是发夹或dsRNA)。转基因杀昆虫产物可以由包含转基因(编码转基因抗昆虫性状)的转基因事件表达。

如本文所使用的，术语“保护”是指避免植物被有害生物侵袭，或将侵袭的量最小化至以下程度：其中侵袭不再对植物活力构成威胁、造成选择性植物死亡、质量损失和/或产量降低。

如本文所使用的，术语“作物田地”是指农民用来种植作物物种的宽阔耕地。作物田地范围的大小取决于作物物种和目的。在一个实例中，作物田地可以包括多个行并且可以按不同长度来种植。在另一个实例中，作物田地可以通过在整个作物田地播撒种子来种植。在一个另外的实例中，作物田地可以通过在整个作物田地为种子钻孔来种植。

如本文所使用的，术语“作用模式”意指生物的或生物化学的方式，有害生物控制策略或化合物借此抑制有害生物取食和/或增加有害生物死亡。

如本文所使用的，术语“共表达”是指在同一宿主生物体内，同时产生两种或更多种基因产物。

如本文所使用的，术语“简并的”是指其中某些位置并不由单个特定核苷酸定义的引物或探针核酸。因此，在这样一个简并位置，引物或探针序列可以是至少两种不同核苷酸中的任一个。此类位置通常表示靶核酸的基因型方面的差异。出于本公开的目的，简并序列还可以表示为在至少两个位置处不同的多个非简并单个序列的混合物。

如本文所使用的，术语“酶促活性片段”、“片段”或“生物活性部分”包括包含与多肽充分同一并且表现出杀昆虫活性的氨基酸序列的多肽片段。“片段”或“生物活性部分”包括：包含与表现出杀昆虫活性的氨基酸序列充分同一的氨基酸序列的多肽片段。例如，多肽的生物活性部分可以是长度为8、10、25、50、100、150、200、250或更多个氨基酸的多肽。此类生物活性部分可以通过重组技术制备并评价杀昆虫活性。如本文所使用的，片段包含多肽的至少8个连续氨基酸。实施例涵盖其他片段，然而，例如大于约10、20、30、50、100、150、200、250或更多个氨基酸的蛋白中的任何片段。

如本文所使用的，术语“肽区段”是指已经分离、不含其他蛋白序列和氨基酸残基的蛋白分子。

如本文所使用的，术语“DNA区段”是指已经分离、不含特定物种的总基因组DNA的DNA分子。因此，编码蛋白质或肽的DNA区段是指含有蛋白编码序列的DNA区段，该DNA区段还与获得该DNA区段的物种的总基因组DNA分离、或被纯化为不含获得该DNA区段的物种的总基因组DNA，在本情况下，总基因组DNA是革兰氏阳性细菌属(芽孢杆菌属，并且特别地，是称为苏云金芽孢杆菌的物种)的基因组。包括在术语“DNA区段”内的是DNA区段和此类区段的更小片段，并且还有重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、病毒等。

如本文所使用的，术语“配制的杀昆虫蛋白”是指已经表达或放入适合农业应用的合成组合物中的纯化或分离的杀昆虫蛋白，其包括但不限于转基因植物、可喷雾液体制剂、粉末状固体制剂、或颗粒状制剂。

如本文所使用的，术语“表达”是指细胞内过程，包括编码DNA分子(例如用来产生多肽的结构基因)所经历的转录和翻译。

如本文所使用的，术语“转基因细胞”是指从转化细胞衍生或再生的或从转基因细胞衍生的任何细胞。示例性的转基因细胞包括衍生自转化的植物细胞的植物愈伤组织和特定细胞，例如叶、根、茎，例如从转基因植物获得的体细胞或生殖(种系)细胞。

如本文所使用的，术语“转基因植物”意指源自经转化的植物细胞或原生质体的植物或其后代，其中植物DNA含有在同一株系的天然非转基因植物中最初并不存在的引入的外源DNA分子。在本领域，有时术语“转基因植物”和“经转化的植物”作为同义术语使用，用于定义其DNA含有外源DNA分子的植物。然而，科学上认为更正确的是，它是指获得自经转化的植物细胞或原生质体的再生植物(就是转基因植物)，并且本文将遵循这样使用。

如本文所使用的，术语“启动子”是指通常位于基因上游(朝向基因的5′区域)的DNA区域，并且是启动和驱动基因转录所需要的。启动子可以允许其控制的基因的适当激活或抑制。启动子可以含有被转录因子识别的特定序列。这些因子可能与启动子DNA序列结合，导致募集RNA聚合酶，RNA聚合酶是一种从基因编码区合成RNA的酶。启动子通常是指位于基因上游的所有基因调控元件，包括上游启动子、5′UTR、内含子和前导序列。

如本文所使用的，术语“上游启动子”是指足以指导转录起始的连续多核苷酸序列。如本文所使用的，上游-启动子涵盖具有几个序列基序的转录起始位点，这些序列基序包括TATA Box、启动子序列、TFIIB识别元件和其他启动子基序(Jennifer，E.F.等人，(2002)Genes&Dev.[基因与发育]，16：2583-2592)。上游启动子为RNA聚合酶II提供了作用位点，RNA聚合酶II是具有基础或一般的转录因子(例如TFIIA、B、D、E、F和H)的多亚基酶。这些因子组装成转录前起始复合物，该转录前起始复合物催化从DNA模板合成RNA。

上游启动子激活是通过各种蛋白质结合并随后与转录起始复合物相互作用以激活基因表达的调控DNA序列元件的附加序列完成的。这些基因调控元件序列与特定DNA结合因子相互作用。这些序列基序有时可以称为顺式元件。此类顺式元件，结合至其组织特异性或发育特异性的转录因子，单独地或组合，可以在转录水平决定启动子的时空表达模式。这些顺式元件对可操作地连接的基因施加的控制类型差异很大。一些元件的作用是增加可操作连接的基因的转录对环境响应(例如，温度、湿度和伤害)的应答。其他顺式元件可能对发育线索(例如，发芽、种子成熟和开花)或空间信息(例如，组织特异性)有应答。参见，例如，Langridge等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86：3219-23。这些顺式元件位于距转录起点不同距离的位置，一些顺式元件(称为近端元件)与最小核心启动子区域相邻，而其他元件可位于启动子(增强子)上游或下游几千碱基处。

如本文所使用的，术语“5′非翻译区”或“5′UTR”定义为前mRNA或成熟mRNA的5′末端中的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，5′UTR通常在其5′端带有7-甲基鸟苷帽，并且参与许多过程，如剪接、聚腺苷酸化、mRNA向细胞质的输出、通过翻译机器鉴定mRNA的5′端以及保护mRNA免受降解。

如本文所使用的，术语“内含子”是指转录但未翻译的基因(或表达的目的多核苷酸序列)中包含的任何核酸序列。内含子包括在表达的DNA序列内的未翻译的核酸序列，以及从其转录的RNA分子中的相应序列。本文所述的构建体还可含有增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，如内含子。一个这种内含子的实例是拟南芥(Arabidopsis thaliana)组蛋白H3变体的基因II的第一内含子或任何其他通常已知的内含子序列。内含子可以与启动子序列组合使用以增强翻译和/或mRNA稳定性。

如本文所使用的，术语“转录终止子”或“终止子”定义为前mRNA或成熟mRNA的3′末端中的转录区段。例如，超过“聚腺苷酸化信号”位点的更长的一段DNA被转录为前mRNA。该DNA序列通常含有转录终止信号，用于将前mRNA正确加工成成熟的mRNA。

如本文所使用的，术语“3′非翻译区”或“3′UTR”定义为前mRNA或成熟mRNA的3′末端中的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，该区域带有聚-(A)尾，并且已知在mRNA稳定性、翻译起始和mRNA输出中具有许多作用。另外，认为3′UTR包括聚腺苷酸化信号和转录终止子。

如本文所使用的，术语“聚腺苷酸化信号”表示存在于mRNA转录物中的核酸序列，当存在聚-(A)聚合酶时，其允许转录物在聚腺苷酸化位点上被聚腺苷酸化，例如位于聚-(A)信号下游的10至30个碱基。许多聚腺苷酸化信号是本领域已知的，并且可用于本公开。示例性序列包括AAUAAA及其变体，如Loke J.等人，(2005)Plant Physiology[植物生理学]138(3)；1457-1468中所述。

如本文所使用的，术语“转化”涵盖可以将核酸分子引入这种细胞的所有技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔；脂质转染；显微注射(Mueller等人，(1978)Cell[细胞]15：579-85)；农杆菌属(Agrobacterium)介导的转移；直接DNA摄取；whiskers

外源核酸序列。在一个实例中，转基因/异源编码序列是基因序列(例如，除草剂抗性基因)、编码工业上或药学上有用的化合物的基因、或编码希望的农艺性状的基因。在又另一个实例中，转基因/异源编码序列是反义核酸序列，其中该反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。转基因/异源编码序列可以含有可操作地连接到该转基因/异源编码序列(例如，启动子)的调节序列。在一些实施例中，目的多核苷酸序列是转基因。然而，在其他实施例中，目的多核苷酸序列是内源核酸序列，其中希望的是内源核酸序列的另外的基因组拷贝，或相对于宿主生物体中靶核酸分子的序列处于反义方向的核酸序列。

如本文所使用的，通过以下来产生术语转基因“事件”：用异源DNA转化植物细胞，该异源DNA为包括目的转基因/异源编码序列的核酸构建体；再生由该转基因/异源编码序列插入该植物的基因组中所产生的植物群体；并且选择表征为插入特定基因组位置的特定植物。术语“事件”是指包括异源DNA的原始转化体和该转化体的后代。术语“事件”还指由转化体与包括基因组/转基因DNA的另一种变体之间的有性杂交产生的后代。即使在与轮回亲本反复回交后，插入的转基因/异源编码序列DNA和来自经转化的亲本的侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)也存在于杂交的后代中相同的染色体位置。术语“事件”也指来自原始转化体和其后代的DNA，该后代包含插入的DNA和与插入的DNA直接相邻的侧翼基因组序列，插入的DNA预期将被转移到接受包括目的转基因/异源编码序列的插入的DNA的后代中，得到包括插入的DNA(例如，自交所产生的原始转化子和后代)的亲本系和不含有插入的DNA的亲本系发生性杂交的结果。

如本文所使用的，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”定义了一种程序或技术，其中如1987年7月28日授权的美国专利号4,683，195中所述扩增了微量的核酸、RNA和/或DNA。通常，需要从目的区域的末端或以外的区域获得序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上与待扩增模板的相反链相同或相似。两个引物的5′末端核苷酸可以与扩增的材料的末端一致。PCR可用于从总的基因组DNA扩增特定的RNA序列、特定的DNA序列，以及从总的细胞RNA、噬菌体或质粒序列转录的cDNA等。通常参见Mullis等人，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.[冷泉港定量生物学研讨会]，51：263(1987)；Erlich编辑，PCRTechnology[PCR技术]，(Stockton Press[斯托克顿出版社]，纽约州，1989)。

如本文所使用的，术语“引物”是指当条件适合于引物延伸产物的合成时能够充当沿着互补链的合成起始点的寡核苷酸。合成条件包括存在四种不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸和至少一种聚合诱导剂，如逆转录酶或DNA聚合酶。它们存在于合适的缓冲液中，其可以包括作为辅因子的成分或在各种合适的温度下影响如pH等条件的成分。引物典型地是单链序列，使得扩增效率得到优化，但是可以利用双链序列。

如本文所使用的，术语“探针”是指与靶序列杂交的寡核苷酸。在

如本文所使用的，术语“限制性核酸内切酶”和“限制酶”是指细菌酶，每种这样的酶在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA。2型限制酶在同一位点识别并切割DNA，并且包括但不限于XbaI、BamHI、HindIII、EcoRI、XhoI、SalI、KpnI、AvaI、PstI和SmaI。

如本文所使用的，术语“载体”与术语“构建体”、“克隆载体”和“表达载体”可互换使用，并且意指可将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞，以转化宿主并促进所引入的序列的表达(例如转录和翻译)的载体。“非病毒载体”旨在意指不包含病毒或逆转录病毒的任何载体。在一些实施例中，“载体”是包含至少一个DNA复制起点和至少一个可选择标记基因的DNA序列。实例包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)或携带外源DNA进入细胞的病毒。载体还可以包括一个或多个基因、反义分子和/或可选择标记基因和本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达由载体编码的核酸分子和/或蛋白质。

术语“质粒”定义了能够在原核或真核宿主细胞中进行常染色体复制的环状核酸链。该术语包括可以是DNA或RNA并且可以是单链或双链的核酸。所述定义的质粒还可以包括对应于细菌复制起点的序列。

如本文所使用的，如本文所使用的术语“可选择标记基因”定义了编码蛋白质的基因或其他表达盒，该蛋白质有助于鉴定插入了可选择标记基因的细胞。例如，“可选择标记基因”涵盖报告基因以及用于植物转化以例如保护植物细胞免受选择剂影响或提供对选择剂的抗性/耐受性的基因。在一个实施例中，仅接受功能可选择标记的那些细胞或植物能够在具有选择剂的条件下分裂或生长。短语“标记阳性”是指植物已经被转化为包括可选择标记基因。

如本文所使用的，术语“可检测标记”是指能够检测的标记，例如像放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。可检测标记的实例包括但不限于以下：荧光标记(例如，FITC、若丹明、镧系元素荧光粉)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基、由二级报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在实施例中，可检测标记可以通过各种长度的间隔臂附接以减少潜在的空间位阻。

如本文所使用的，术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”是指可在特定限制位点处或通过同源重组插入核酸或多核苷酸中的DNA区段。如本文所使用的，DNA的区段包含编码目的多肽的多核苷酸，并且盒和限制位点被设计为确保将盒插入适当的阅读框中以进行转录和翻译。在实施例中，表达盒可包括编码目的多肽的多核苷酸并除该多核苷酸之外还具有促进特定宿主细胞转化的元件。在实施例中，基因表达盒还可以包括允许编码目的多肽的多核苷酸在宿主细胞中增强表达的元件。这些元件可以包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、响应元件、终止子序列、聚腺苷酸化序列等。

如本文所使用的，“接头”或“间隔子”是将两个分开的实体彼此结合的键、分子或分子的组。接头和间隔子可以提供两个实体的最佳间隔，或者可以进一步提供允许两个实体彼此分离的不稳定的连接。不稳定的连接包括光可切割基团、酸不稳定部分、碱基不稳定部分和酶可切割基团。如本文所使用的，术语“多接头”或“多克隆位点”定义了位于核酸序列上彼此10个核苷酸内的三个或更多个2型限制酶位点的簇。在其他情况下，如本文所使用的术语“多接头”是指经由任何已知的无缝克隆方法(即Gibson

如本文所使用的，术语“对照”是指在分析程序中用于比较目的的样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如，在分析程序的目的是检测细胞或组织中差异表达的转录物或多肽的情况下，通常优选包括阳性对照(如来自已知植物的表现出所需表达的样品)和阴性对照(如来自已知植物的缺少所需表达的样品)。

如本文所使用的，术语“植物”包括整株植物以及任何后代，细胞、组织或植物的一部分。可以在本公开中使用的植物类别通常与易于诱变的高等和低等植物类别一样广泛，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨美植物和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶植物和单子叶植物。术语“植物部分”包括植物的一个或多个任何部分，包括例如且不限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物切段；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如花粉、胚、花朵、果实、枝、叶、根、茎和外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织或组织成结构或功能单元的任何其他组的植物细胞。植物细胞或组织培养物可能能够再生具有从其获得细胞或组织的植物的生理和形态特征的植物，并且能够再生具有与所述植物基本上相同的基因型的植物。相反，一些植物细胞不能再生以产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚胎、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花丝、花、籽粒、穗、穗轴、苞叶或茎秆。

植物部分包括可收获部分和可用于后代植物繁殖的部分。可用于繁殖的植物部分包括例如但不限于：种子；果实；插条；秧苗；块茎；和根茎。植物的可收获部分可以是植物的任何有用的部分，包括例如但不限于：花；花粉；秧苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。

植物细胞是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单个细胞或细胞聚集物(例如，易碎的愈伤组织和培养的细胞)的形式，并且可以是更高组织的单元(例如，植物组织、植物器官和植物)的部分。因此，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞或可以再生为整株植物的细胞或细胞集合。这样，包含多个植物细胞并且能够再生为整株植物的种子在本文的实施例中被认为是“植物细胞”。

如本文所使用的，术语“小RNA”或“RNAi介导分子”是指几类非蛋白编码核糖核酸(ncRNA)。术语小RNA或“RNAi介导分子”描述在细菌细胞、动物、植物和真菌中产生的ncRNA的短链。这些ncRNA的短链可以在细胞内自然产生，也可以通过引入表达该短链或ncRNA的外源序列来产生。小RNA或“RNAi介导分子”序列不直接编码蛋白质，并且在功能上不同于其他RNA，因为小RNA序列或“RNAi介导分子”仅被转录而不被翻译。小RNA或“RNAi介导分子”序列参与其他细胞功能，包括基因表达和修饰。小RNA或“RNAi介导”分子通常由约20至30个核苷酸组成。小RNA序列或“RNAi介导分子”可以衍生自更长的前体。前体形成自我互补区域中彼此折叠的结构；然后它们被动物中的核酸酶DICER或植物中的DCL1加工。

许多类型的小RNA或“RNAi介导分子”自然存在或人工产生，包括但不限于微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反义RNA、短/小发夹RNA(shRNA)和核仁小RNA(snoRNA)。某些类型的小RNA或“RNAi介导分子”，如微小RNA和siRNA，在基因沉默和RNA干扰(RNAi)中很重要。基因沉默是遗传调节的过程，其中通常会表达的基因被细胞内元件(在这种情况下为小RNA或“RNAi介导分子”)“关闭”。由于干扰而不能形成通常由该遗传信息形成的蛋白质，并且该基因中编码的信息被阻止表达。

如本文所使用的，术语“小RNA”或“RNAi介导分子”涵盖文献中描述为“微小RNA(tiny RNA)”的RNA分子(Storz，(2002)Science[科学]296：1260-3；Illangasekare等人，(1999)RNA 5：1482-1489)；原核“小RNA”(sRNA)(Wassarman等人，(1999)TrendsMicrobiol.[微生物学趋势]7：37-45)；真核“非编码RNA(ncRNA)”；“微RNA(miRNA)”；“小非mRNA(snmRNA)”；“功能性RNA(fRNA)”；“转移RNA(tRNA)”；“催化RNA”[例如，核酶，包括自我酰化核酶(Illangaskare等人，(1999)RNA 5：1482-1489)；“核仁小RNA(snoRNA)”、“tmRNA”(又名“10SRNA，”Muto等人，(1998)Trends Biochem Sci.[生物化学科学趋势]23：25-29；和Gillet等人，(2001)Mol Microbiol.[分子微生物学]42：879-885)；内siRNA(Ghildiyal，M.，等人，Endogenous siRNAs derived from transposons and mRNAs in Drosophikasomatic cells.[果蝇体细胞中衍生自转座子和mRNA的内源性siRNA]Science[科学]，2008.320(5879)：第1077-81页.)；piRNA(Aravin，A.，等人，A novel class of small RNAsbind to MILI protein in mouse testes.[一类新颖的小RNA与小鼠睾丸中的MILI蛋白结合]Nature[自然]，2006.442(7099)：第203-7页.)；RNAi介导分子包括但不限于“小干扰RNA(siRNA)”，“内切核糖核酸酶制备的siRNA(e-siRNA)”，“短/小发夹RNA(shRNA)”，和“小时序调节型RNA(stRNA)”，“切粒的siRNA(d-siRNA)”，以及包含至少一个尿嘧啶碱基的适配子、寡核苷酸和其他合成核酸。

如本文所使用的，术语DICER识别序列是被DICER酶识别并且结合的任何段的多核苷酸，用于随后切割。通过针对shRNA分子的DICER活性产生的双链分子可以被分离成两个单链shRNA；“STAR/过客链”和“引导链”。STAR/过客链可以被降解，并且引导链可以被掺入RISC复合物。通过引导链与mRNA分子的特异性互补多核苷酸的特异性杂交，并且随后由Argonaute酶(例如，RISC复合物的催化组分)切割，发生转录后抑制。

如本文所使用的，术语DROSHA识别序列是被DROSHA酶识别并且结合的任何段的多核苷酸，用于随后切割。

除非另外特别解释，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。分子生物学中常用术语的定义可以在例如以下中找到：Lewin，Genes V[基因V]，Oxford University Press[牛津大学出版社]，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology[分子生物学百科全书]，Blackwell Science Ltd.[布莱克威尔科学有限公司]，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Meyers(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology：A ComprehensiveDesk Reference，[分子生物学和生物技术：综合办公桌参考]VCH Publishers，Inc.，[VCH出版公司]1995(ISBN 1-56081-569-8)。

实施例

在实施例中，本公开涉及产生RNA复合物的方法和组合物。该复合物包含细胞穿透肽和RNA分子。

在一些实施例中，细胞穿透肽是与缺乏细胞穿透肽的多肽相比增强含有该肽的多肽穿透进入细胞的肽。可以使用本领域已知的或本文描述的任何方法检测多肽穿透进入细胞，例如蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫荧光和例如在固定细胞或细胞裂解物上进行的其他类似测定。在一些实施例中，细胞穿透肽包含以下序列或由以下序列组成：与SEQ ID NO：66(BAPCI)复合的SEQ ID NO：1(BAPC1)、SEQ ID NO：2(多节-1)、SEQ ID NO：3(γ-玉米醇溶蛋白)、SEQ ID NO：4(CyLoP-1)或SEQ ID NO：5(MPG)或其片段或变体，所述片段或变体能够增强多肽的穿透(例如，与不含细胞穿透肽的多肽相比)。在一些实施例中，细胞穿透肽包含以下的序列或由以下的序列组成：SEQ ID NO：6(TAT)、SEQ ID NO：7(TAT2)和SEQ ID NO：8(M-TAT)，如以下文献中所述：Pooga等人，(2001)“Cellular translocation of proteinsby transportan[转运体对蛋白质的细胞易位]”FASEB J[美国实验生物学联合会会刊]15，1451-1453；SEQ ID NO：9(PepR)和SEQ ID NO：10(PepM)，如以下文献中所述：Freire等人，(2014)，Nucleic acid delivery by cell-penetrating peptides derived from denguevirus capsid protein：design and mechanism of action.[来自登革热病毒外壳蛋白的细胞穿透肽的核酸传递：设计和作用机制]第281卷，第1期，第191-215页(通过引用并入本文)。在一些实施例中，细胞穿透肽包含SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的序列。在其他实施例中，细胞穿透肽由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的序列组成。在进一步的实施例中，细胞穿透肽基本上由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：66的序列组成。在一些实施例中，片段从本文提供的氨基酸序列的N-和/或C末端具有一个、两个或三个氨基酸缺失。在一些实施例中，变体在本文提供的氨基酸序列中具有一个、两个或三个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)。

在一些实施例中，细胞穿透肽与RNA分子复合。在多个方面，RNA分子可以是mRNA分子。如本文所使用的，术语“信使RNA”(mRNA)是指编码至少一个目的肽或多肽并且能够被翻译以在体外、体内、原位或离体产生编码后的目的肽多肽的任何多核苷酸。mRNA已由RNA聚合酶从DNA序列转录，并与核糖体相互作用，合成由DNA编码的遗传信息。通常，mRNA分为两个子类：前体mRNA和成熟mRNA。前体mRNA(pre-mRNA)是由RNA聚合酶转录但未经过任何转录后加工(例如，5′加帽、剪接、编辑和聚腺苷酸化)的mRNA。成熟mRNA已通过转录后加工进行了修饰(例如，剪接以去除内含子和聚腺苷酸化)，并且能够与核糖体相互作用以进行蛋白质合成。可以通过多种方法从组织或细胞中分离出mRNA。例如，可以对细胞或细胞裂解物进行总RNA提取，并且可以纯化所得提取的总RNA(例如，在包含寡聚dT珠的柱上)以获得提取的mRNA。

可替代地，可以在无细胞环境中合成mRNA，例如通过体外转录(IVT)。如本文所使用的，“体外转录模板”指适用于在产生信使RNA(mRNA)的IVT反应中使用的脱氧核糖核酸(DNA)。在一些实施例中，IVT模板编码5′非翻译区，含有可读框，并编码3′非翻译区和聚A尾。IVT模板的特定核苷酸序列组成和长度将取决于模板编码的目的mRNA。

mRNA可以具有天然或天然存在的mRNA的核苷酸序列或编码天然或天然存在的肽的核苷酸序列。可替代地，mRNA可以具有与原生或天然存在的mRNA的核苷酸序列具有百分比同一性的核苷酸序列，或者mRNA可以具有与原生或天然存在的肽的核苷酸序列具有百分比同一性的编码肽的核苷酸序列。在一些实施例中，mRNA具有或大于约0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb或5kb的长度。

在一些实施例中，由mRNA编码的农艺性状是胞质蛋白。在一些实施例中，由mRNA编码的农艺性状是分泌蛋白。在一些实施例中，由mRNA编码的农艺性状是酶。在一些实施例中，酶是溶酶体酶。

在其他方面，RNA分子可以是RNAi介导(例如，小RNA)分子。RNA干扰(RNAi)是序列特异性RNA降解过程，它提供了一种相对简单和直接的方法来敲低或沉默理论上任何包含互补序列的基因。在自然发生的RNAi中，双链RNA(dsRNA)被RNA酶III/解旋酶蛋白Dicer切割成小干扰RNA(siRNA)分子，具有19-27个核苷酸(nt)的dsRNA，在3′末端具有2-nt突出端。之后，siRNA被整合到称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的多组分核糖核酸酶中。一条siRNA仍然与RISC相关联，以将复合物指导至同源RNA，该同源RNA的序列与RISC中的指导ss-siRNA互补。这种siRNA引导的核酸内切酶消化RNA，导致靶向的RNA截短和失活。最近的研究揭示了在哺乳动物细胞中表现出RNAi效应的化学合成的21-27-nt siRNA的效用，并证明了siRNA杂交(在末端或中间)的热力学稳定性在决定分子功能方面起着核心作用。科学文献中描述了RISC、siRNA分子和RNAi的更详细特征。

通过利用化学合成的siRNA或内源表达的siRNA，RNAi在下调昆虫细胞基因表达方面的效用已在实验室中得到成功证明。内源性siRNA首先通过表达载体(质粒或病毒载体)表达为发夹RNA(hRNA)，然后经Dicer加工成为功能性siRNA。

重要的是，目前无法以任何置信度预测可能靶向转录组序列的许多可能的候选siRNA序列(例如，约16-30个碱基对的寡核苷酸)中的哪些序列实际上会表现出有效的siRNA活性。取而代之的是，自然生成单个特定的候选siRNA多核苷酸或寡核苷酸序列并且测试。

在一些方面，RNAi是指抑制、降低或下调细胞中基因表达的生物学过程，其由RNAi介导或小RNA分子(例如，siRNA、miRNA、shRNA和dsRNA)介导，参见例如，Zamore和Haley，2005，Science[科学]309：1519-1524；Vaughn和Martienssen，2005，Science[科学]309：1525-1526；Zamore等人，2000，Cell[细胞]101：25-33；Bass，2001，Nature[自然]411：428-429；Elbashir等人，2001，Nature[自然]411：494-498；和Kreutzer等人，国际PCT公开号WO00/44895；Zernicka-Goetz等人，国际PCT公开号WO 01/36646；Fire，国际PCT公开号WO 99/32619；Plaetinck等人，国际PCT公开号WO 00/01846；Mello和Fire，国际PCT公开号WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公开号WO 99/07409；和Li等人，国际PCT公开号WO00/44914；Allshire，2002，Science[科学]297：1818-1819；Volpe等人，2002，Science[科学]297∶1833-1837；Jenuwein，2002，Science[科学]297：2215-2218；和Hall等人，2002，Science[科学]297：2232-2237；Hutvagner和Zamore，2002，Science[科学]297：2056-60；McManus等人，2002，RNA 8：842-850；Reinhart等人，2002，Gene&Dev.[基因与发育]16：1616-1626；以及Reinhart和Bartel，2002，Science[科学]297：1831。此外，术语“RNA干扰”(或“RNAi”)意在等同于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，例如转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传学。例如，本发明的单链RNA分子可用于在转录后水平或转录前水平进行表观遗传沉默基因。在非限制性实例中，本发明的单链RNA分子对基因表达的表观遗传调节可通过修饰染色质结构或甲基化模式以改变基因表达引起(参见例如，Verdel等人，2004，Science[科学]303：672-676；Pal-Bhadra等人，2004，Science[科学]303：669-672；Allshire，2002，Science[科学]297：1818-1819；Volpe等人，2002，Science[科学]297：1833-1837；Jenuwein，2002，Science[科学]297：2215-2218；和Hall等人，2002，Science[科学]297：2232-2237)。在另一个非限制性实例中，本发明的单链RNA分子对基因表达的调节可通过RISC或通过翻译抑制对RNA(编码或非编码RNA)的切割引起，如本领域已知，或者调节可由转录抑制引起(参见例如，Janowski等人，2005，Nature Chemical Biology[自然化学生物学]1：216-222)。

如本文所用的术语“抑制”、“下调”、“减少”或“敲低”是指它们在本领域中普遍接受的含义。关于本发明的示例性RNAi介导分子，这些术语通常指以下的降低：(i)基因或靶序列的表达和/或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子水平，和/或(ii)一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性，低于在不存在本发明的RNAi介导分子的情况下所观察到的。下调也可能与转录后沉默有关，例如RNAi介导的切割，或通过DNA甲基化模式或DNA染色质结构的改变。RNAi剂情况下的抑制、下调、减少或敲低可指无活性分子、减毒分子、具有乱序序列的RNAi剂或具有错配的RNAi剂。短语“基因沉默”是指通过靶向抑制细胞中的内源靶基因而部分或完全丧失功能。因此，该术语可与RNAi、靶基因表达的“敲低”、“抑制”、“下调”或“减少”互换使用。

为了确定抑制的程度，可以将测试样品(例如，来自表达一个或多个靶基因或一个或多个靶序列的目的生物体的生物样品或表达靶基因/序列的培养中的细胞的样品)与沉默、减少或抑制靶基因或序列表达的RNAi介导分子接触。将测试样品中靶基因/序列的表达与未与RNAi介导分子接触的对照样品(例如，来自表达靶基因/序列的目的生物体的生物样品或表达靶基因/序列的培养中的细胞的样品)中靶基因/序列的表达进行比较。对照样品(即表达靶基因/序列的样品)被指定为100％的值。当测试样品相对于对照样品的值约为95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％时，实现靶基因/序列表达的沉默、抑制或减少。合适的测定包括，例如，使用本领域技术人员已知的技术检查蛋白质或mRNA水平，例如斑点印迹、RNA印迹、原位杂交、ELISA、微阵列杂交、免疫沉淀、酶功能，以及本领域技术人员已知的表型测定。

在一些实施例中，RNAi介导分子包含第一链和第二链，其中a)该第一链和该第二链形成双链体；b)该第一链包含至少11个碱基的引导区，其中该引导区包含种子区，该种子区包含引导链的碱基1-N，其中N＝7或N＝8；和c)该第二链包含至少11个碱基的非引导区，其中该非引导区包含与双链体中引导区的碱基1-(N+2)中的任何一个或多个相对的凸起序列。在一些实施例中，其中N＝7并且该凸起是引导区的相对碱基1、2、3、4、5、6、7、8或9。在其他实施例中，N＝8并且该凸起是引导区的相对碱基1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些实施例中，RNAi介导分子包含第一链和第二链，其中a)该第一链和该第二链形成双链体，b)该第一链包含至少9个碱基的引导区，其中该引导区包含种子区，该种子区包含引导链的碱基2-7或2-8，和c)该第二链包含至少9个碱基的非引导区，其中该非引导区包含与双链体中引导区的碱基1或碱基9相对的凸起序列。

在一些实施例中，第一链和第二链通过能够形成环结构的RNA(例如，RNA接头)连接。如本领域公知的，当RNA分子包含碱基配对在一起的、被不碱基配对在一起的RNA序列隔开的两个RNA序列时，形成RNA环结构(例如，茎环或发夹)。例如，如果序列A和C是互补的或部分互补的，使得它们碱基配对在一起，但序列B中的碱基不碱基配对在一起，则环结构可以在RNA分子A-B-C中形成。

在一些实施例中，能够形成环结构的RNA包含4至50个核苷酸。在某些实施例中，能够形成环结构的RNA包含13个核苷酸。在一些实施例中，RNA中能够形成环的核苷酸数目是4至50个核苷酸或其间的任何整数。在一些实施例中，环的0-50％可以与环的另一部分互补。如本文所使用的，术语“环结构”是连接核酸的两条互补链的序列。在一些实施例中，环结构的1-3个核苷酸与核酸的互补链相邻并且可以与环结构远端部分的1-3个核苷酸互补。例如，环结构5’末端的三个核苷酸可以与环结构3′末端的三个核苷酸互补。

在另外的方面，RNAi介导分子可以是dsRNA分子。在一些方面，dsRNA包含对应于靶基因的靶区域的序列。整个dsRNA不是绝对必要与靶区域的序列相对应。例如，dsRNA可以包含位于靶特异性序列侧翼的短非靶区域，前提是这样的序列不会在实质程度上影响dsRNA在RNA抑制中的性能。

在进一步的方面，dsRNA可以包含一个或多个替代碱基以优化RNAi中的性能。如何依次改变dsRNA的每个碱基并测试所得dsRNA的活性(例如，在合适的体外测试系统中)以优化给定dsRNA的性能，这对技术人员来说是显而易见的。在一些方面，dsRNA可以进一步包含DNA碱基、非天然碱基或非天然主链连接或糖-磷酸主链的修饰，例如以增强储存期间的稳定性或增强对核酸酶降解的抗性。

先前已报道，约21bp的短干扰RNA(siRNA)的形成对于有效的基因沉默是期望的。因此，在一个实施例中，双链RNA片段(或区域)本身将优选长度为至少17bp，优选长度为18或19bp，更优选至少20bp，更优选长度至少21bp，或至少22bp，或至少23bp，或至少24bp、25bp、26bp，或至少27bp。表述“双链RNA片段”或“双链RNA区域”是指与靶基因(的一部分)相对应的双链RNA的小实体。

通常，双链RNA优选在约17-1500bp之间，甚至更优选在约80-1000bp之间并且最优选在约17-27bp之间或在约80-250bp之间；例如17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp或1500bp的双链RNA区域。

双链RNA长度的上限可能取决于i)昆虫摄取dsRNA的要求和ii)dsRNA在细胞内加工成指导RNAi的片段的要求。所选择的长度也可能受到RNA合成方法和RNA向细胞的递送方式的影响。优选地，用于本发明方法的双链RNA的长度将小于10,000bp，更优选1000bp或更小，更优选500bp或更小，更优选300bp或更小，更优选100bp或更小。对于任何给定的靶基因和昆虫，可通过实验确定用于有效抑制的dsRNA的最佳长度。

双链RNA可以是完全或部分双链的。部分双链RNA可以在双链部分的一个末端或两个末端包含短的单链突出端，前提是该RNA仍然能够被昆虫摄取并指导RNAi。双链RNA也可包含内部非互补区域。

在一些方面，RNA分子可以是siRNA分子。在实施例中，“siRNA”(也称为“短干扰RNA”或“小干扰RNA”)被赋予其本领域接受的普通含义，通常指互补RNA寡核苷酸的双链体(有义链和反义链)，其可以包含或不包含约1至约4个核苷酸的3′突出端并且介导RNA干扰。

在进一步的方面，RNA分子可以是微小RNA。微小RNA(miRNA)是非蛋白编码RNA，通常为约19至约25个核苷酸长度，指导靶RNA转录物的反式干扰，负调节基因的表达(Ambros(2001)，Cell[细胞]，107(7)：823-6；Bartel(2004)Cell[细胞]，116(2)：281-97)。已经鉴定了许多miRNA基因，并且其可在几个数据库中公开获得(“miRBase”Griffiths-Jones等人(2003)Nucleic Acids Res.[核酸研究]，31：439-441)。首先在线虫中报道了MiRNA，并且此后在其他无脊椎动物中也已经鉴定出来；参见，例如，Lee和Ambros(2001)Science[科学]，294：862-864；Lim等人(2003)Genes Dev.[基因与发育]，17：991-1008；Stark等人(2007)Genome Res.[基因组研究]，17：1865-1879。可以在miRNA基因自身的启动子的控制下转录miRNA基因。然而，根据其基因组来源，微小RNA的生物合成途径可以变化，例如认为高达三分之一的动物miRNA源自内含子(mirtron)(Okamura等人(2008)Cell Cycle[细胞周期]7(18)：2840-5；Westholm和Lai(2011)Biochimie[生物化学]93(11)：1897-904)。可以在基因组中的簇中分离或出现MiRNA基因；它们可以全部或部分位于蛋白编码基因和非蛋白编码基因二者的内含子内，参见Kim(2005)Nature Rev.Mol Cell Biol.[自然综述：分子与细胞生物学]，6：376-385；(Westholm和Lai(2011)Biochimie[生物化学]93(11)：1897-904)。初级转录物(原miRNA(pri-miRNA))可以是相当长(数千碱基)并且可以是单顺反子的或多顺反子的，含有一个或多个前体miRNA(前miRNA)(含有加工为成熟miRNA的茎-环排列的折回结构)、以及mRNA的通常的5′帽和聚腺苷酸尾。参见例如以下文献中的图1：Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.[自然综述：分子与细胞生物学]，6：376-385。

从给出的前体精确地加工单个成熟miRNA，并且因此，此类“人工”miRNA(工程化的miRNA、短/小发夹RNA(shRNA)、shRNAmir、shRNA-miR、shmiR等)提供了优于双链RNA(dsRNA)的优点，因为仅特定miRNA序列被表达，限制了潜在的脱靶效应。尽管动物miRNA典型地与3′UTR中的不完美靶序列相互作用，但是具有完美靶互补性的人工miRNA将引导靶切割(参见Zeng等人(2003)RNA，9：112-123，以及Zeng等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院报]，100：9779-9784)。

在其他实施例中，本公开涉及细胞穿透肽与RNA分子的连接。在一些方面，多于一种类型的细胞穿透肽可以与RNA分子连接。在交联时可以使用的细胞穿透肽与RNA分子的比率(摩尔比)可以是例如至少约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、或50∶1、100∶1、200∶1、300∶1、400∶1、500∶1、600∶1、700∶1、800∶1、900∶1或1000∶1。在交联时可以使用的RNA分子与细胞穿透肽的比率(摩尔比)可以是例如至少约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8：1、9∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、或50∶1、100∶1、200∶1、300∶1、400∶1、500∶1、600∶1、700∶1、800∶1、900∶1或1000∶1。在其他方面，与RNA分子交联的细胞穿透肽的平均数量可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，或至少5-10、5-15、5-20或5-25。

在进一步的实施例中，细胞穿透肽和RNA分子可以通过非共价连接彼此连接。术语“非共价连接的”、“非共价附接的”、“非共价相关联的”、“非共价连接”、“非共价相互作用”等在本文中可互换使用。本文中非共价连接是指在电子不共享的原子之间的相互作用。这类相互作用弱于共价连接。疏水相互作用代表了RNA分子和一个或多个CPP之间可能发生的非共价连接的实例。可应用于本文的非共价连接的其他实例包括静电力(例如离子、氢键)和范德华力(伦敦色散力)。

在其他实施例中，可以利用通过酰胺桥的直接连接来连接RNA分子和一个或多个CPP。这种连接适用于将第一CPP连接到一个或多个CPP，其中待连接的组分具有反应性氨基或羧基。更特别地，如果待连接的组分是肽、多肽或蛋白质，则优选肽键。这样的肽键可以使用涉及待连接的两个组分(一个组分的N末端和另一个组分的C末端)的化学合成形成，或者可以直接通过两个组分的整个肽序列的蛋白质合成来形成，其中两个(蛋白质或肽)组分优选在一个步骤中合成。

在其他实施例中，细胞穿透肽可以通过N末端连接至RNA分子。在进一步的实施例中，细胞穿透肽可以通过C末端连接至RNA分子。在进一步的实施例中，肽可以在内部通过肽主链或侧链与RNA分子连接。

在进一步的实施例中，将RNA复合物引入昆虫细胞中。在一些实施例中，RNA复合物赋予杀昆虫活性。还提供了编码RNA分子的多核苷酸序列。RNA分子可以设计用于RNAi以下调昆虫有害生物的靶mRNA的表达。在其他方面，RNAi介导分子含有特异性抑制来自昆虫有害生物内表达基因的转录RNA的靶多核苷酸序列。例如，RNAi介导分子的靶多核苷酸通过阻遏靶基因的mRNA的表达来抑制靶基因。在进一步的方面，RNAi介导分子的茎结构可以是与植物有害生物的靶多核苷酸具有至少70％至100％序列同一性的任何多核苷酸序列。例如，所述多核苷酸可以与昆虫有害生物的靶多核苷酸共享至少70％序列同一性、71％序列同一性、72％序列同一性、73％序列同一性、74％序列同一性、75％序列同一性、76％序列同一性、77％序列同一性、78％序列同一性、79％序列同一性、80％序列同一性、81％序列同一性、82％序列同一性、83％序列同一性、84％序列同一性、85％序列同一性、86％序列同一性、87％序列同一性、88％序列同一性、89％序列同一性、90％序列同一性、91％序列同一性、92％序列同一性、93％序列同一性、94％序列同一性、95％序列同一性、96％序列同一性、97％序列同一性、98％序列同一性、99％序列同一性、99.5％序列同一性、99.9％序列同一性或100％序列同一性。在该方面的实例中，靶多核苷酸可以是昆虫有害生物的必需基因。因此，靶多核苷酸序列获得自植物有害生物并且合并为RNAi介导分子内16-23个多核苷酸长度的茎结构。类似地，靶多核苷酸序列获得自植物有害生物并且合并为RNAi介导分子内16-25个多核苷酸长度的茎结构。在其他方面，茎结构可以是选自由以下组成的组的靶多核苷酸：Caf1-180基因、RPA70基因、V-ATP酶H基因、Rho1基因、V-ATP酶C基因、Reptin基因、PPI-87B基因、RPS6基因、COPIγ基因、COPIa基因、COPIβ基因、COPIδ基因、Brahma基因、ROP基因、Hunchback基因、RNA聚合酶II 140基因、Sec23基因、Dre4基因、Gho基因、thread基因、ncm基因、RNA聚合酶II-215基因、RNA聚合酶I1基因、RNA聚合酶II 33基因、Kruppel基因、Spt5基因、Spt6基因、Snap25基因、SSJ1基因、CoatG基因、Prp8基因。在该方面的另外的实例中，茎结构的靶多核苷酸序列选自如在以下专利申请中描述的转录组序列数据库中鉴定的靶基因同源物：美国专利申请号20120174258；美国专利申请号20130091601；美国专利申请号20120198586；美国专利申请号US 20120174260；美国专利申请号20120174259；美国专利申请号20140298536；美国专利申请号20130091600；美国专利申请号20130097730；专利申请号WO 2016060911；专利申请号WO 2016060912；专利申请号WO 2016060913；专利申请号WO 2016060914；美国专利申请号20160208251；美国专利申请号20160222408；美国专利申请号20150176025；美国专利申请号20160222407；美国专利申请号20160208252；美国专利申请号20150176009；美国专利申请号20150322455；美国专利申请号20150322456；美国专利申请号20160186203；专利申请号WO 2016191357；美国专利申请号20160194658；美国专利申请号20160264992；美国专利申请号20160264991；美国专利申请号20160355841；美国专利申请号20160208253；美国专利申请号20160369296；美国专利申请号20160348130；美国专利申请号2016196241；美国专利申请号2017011764；以及美国专利申请号2017011771。这样的昆虫有害生物可包括损害以下的昆虫：任何经济上重要的农艺学、森林、温室、苗圃、观赏植物、食物和纤维、公共和动物健康、家庭和商业建筑物、家庭和储存产品。在其他方面，RNA复合物提供了针对一种或多种昆虫有害生物的毒性杀昆虫活性。此类昆虫有害生物的实例包括但不限于鳞翅目、双翅目、半翅目和鞘翅目或线虫纲的成员。在一些实施例中，提供了针对鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目或鞘翅目有害生物的杀昆虫活性。在该实施例的进一步的方面，可以通过本公开的方法杀伤或在数量上减少鞘翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目或鞘翅目有害生物。

在本公开的其他实施例中，提供了用于产生RNA复合物和用于使用RNA复合物来控制鳞翅目、鞘翅目、线虫、半翅目和/或双翅目有害生物、抑制其生长或将其杀伤的方法。在一些实施例中，将本公开的转基因植物工程化，从而表达编码如本文公开的多核苷酸的一种或多种多核苷酸。在不同实施例中，所述转基因植物进一步包含一种或多种另外的抗昆虫基因，例如，用于控制鞘翅目、鳞翅目、半翅目、双翅目、和/或线虫有害生物的一种或多种另外的基因。

示例性方面包括使用RNAi介导分子控制鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目或鞘翅目有害生物群体，抑制其生长或将其杀伤，并且可用于生产对此类昆虫具有杀昆虫活性的组合物。成虫和若虫包括在内作为目的昆虫有害生物。

来自鳞翅目的农艺上重要的目的物种包括但不限于：夜蛾科(Noctuidae)中的夜蛾、地老虎、尺蠖和实夜蛾亚科，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)(秋夜蛾(fall armyworm))；甜菜夜蛾(S.exigua Hübner，beet armyworm)；斜纹夜蛾(S.lituraFabricius)(斜纹夜蛾(tobacco cutworm)，茶蚕(cluster caterpillar))；蓓带夜蛾(Mamestra configurata Walker)(披肩粘虫(bertha armyworm))；甘蓝夜蛾(M.brassicaeLinnaeus)(菜夜蛾(cabbage moth))；小地老虎(Agrotis ipsilon Hufnagel)(黑切根虫(black cutworm))；西方灰地老虎(A.orthogonia Morrison)(西部切根虫(westerncutworm))；粒肤地老虎(A.subterranea Fabricius)(粒肤切根虫(granulate cutworm))；棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea Hübner)(棉叶虫(cotton leaf worm))；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hübner)(甘蓝银纹夜蛾(cabbage looper))；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)(大豆夜蛾(soybean looper))；黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis Hübner)(绒毛豆毛虫(velvetbean caterpillar))；粗长须夜蛾(Hypenascabra Fabricius)(苜猜绿夜蛾(green cloverworm))；烟芽夜蛾(Heliothis vipescensFabricius)(烟青虫(tobacco budworm))；一星粘虫(Pseudaletia unipuncta Haworth)(粘虫(armyworm))；粗皮委夜蛾(Athetis mindara Barnes and Mcdunnough)(粗皮切根虫(rough skinned cutworm))；暗缘地老虎(Euxoa messoria Harris)(暗黑切根虫(darksided cutworm))；棉斑实蛾(Earias insulana Boisduval)(多刺螟蛉(spinybollworm))；翠纹钻夜蛾(E.vittella Fabricius)(斑点螟蛉(spotted bollworm))；棉铃虫(Helicoverpa armieera Hübner)(美洲螟蛉(American bollworm))；玉米穗虫(H.zeaBoddie)(玉米穗蛾(corn earworm)或棉螟蛉(cotton bollworm))；斑马纹夜蛾(Melanchrapicta Harris)(斑马纹夜蛾(zebra caterpillar))；柑橘夜蛾(Egira (Xylomyges)curialis Grote)(柑橘地老虎(citrus cutworm))；来自螟蛾科玉米螟(Ostrinianubilalis Hübner，欧洲玉米螟(European corn borer))的螟虫、鞘蛾、结网虫、锥形虫(coneworms)、和雕叶虫(skeletonizers)；脐橙螟蛾(Amyelois transitellaWalker)(脐橙螟(naval orangeworm))；地中海粉螟(Anagasta kuehniella Zeller)(地中海粉斑螟(Mediterranean flour moth))；干果斑螟(Cadra cautella Walker)(粉斑螟(almond moth))；二化螟(Chilo suppressalis Walker)(水稻螟虫(rice stem borer))；斑禾草螟(C.partellus)，(高粱螟(sorghum borer))；米螟(Corcyra cephalonicaStainton)(米蛾(rice moth))；玉米根草螟(Crambus caliginosellus Clemens)(玉米根结网虫(corn root webworm))；早熟禾草螟(C.teterrellus Zincken)(早熟禾草螟(bluegrass webworm))；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenee)(稻纵卷叶螟(rice leaf roller))；葡萄里予螟(Desmia funeralis Hübner)(葡萄野螟(grapeleaffolder))；甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)(甜瓜野螟(melon worm))；黄瓜绢野螟(D.nitidalis Stoll)(泡菜虫(pickleworm))；巨座玉米螟(Diatraeagrandiosella Dyar)(西南玉米秆草螟(southwestern corn borer))、蔗螟(D.saccharalis Fabricius)(甘蔗螟虫(surgarcane borer))；墨西哥稻螟(Eoreumaloftini Dyar)(墨西哥稻螟(Mexican rice borer))；烟草粉斑螟(Ephestia elutella Hübner)(烟草飞蛾(tobacco(cacao)moth))；大蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus)(大蜡蛾(greater wax moth))；水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker)(草地螟(sod webworm))；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum Hulst)(向日葵螟(sunflowermoth))；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(小玉米茎蛀虫(lessercornstalk borer))；小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)(小蜡蛾(lesser waxmoth))；草地螟(Loxostege sticticalis Linnaeus)(草地螟(beet webworm))；茶树螟(Orthaga thyrisalis Walker)(茶树蛾(tea tree web moth))；豆英野螟(Marucatestulalis Geyer)(豆荚蛀螟(bean pod borer))；印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner)(印度谷螟(Indian meal moth))；三化螟(Scirpophaga incertulas Walker)(三化螟(yellow stem borer))；温室螟(Udea rubigalis Guenee)(芹菜卷叶螟(celeryleaftier))；和卷蛾科(Tortricidae)中的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana Walsingham)(西部黑头蚜虫(Western blackheadedbudworm))；东部黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)(东部黑头蚜虫(Easternblackheaded budworm))；果树黄卷蛾(Archips argyrospila Walker)(果树卷叶蛾(fruittree leaf roller))；罗萨娜黄卷蛾(A.rosana Linnaeus)(欧洲卷叶蛾(European leafroller))；和其他黄卷蛾属物种，苹小卷叶蛾(Adoxophyes ordna Fischer vonRosslerstamm)(苹果小卷蛾(summer fruit tortrix moth))；条纹向日葵螟(Cochylishospes Walsingham)(带状向日葵斑蛾(banded sunflower moth))；榛小卷蛾(Cydialatiferreana Walsingham)(榛小卷蛾(filbertworm))；苹果蠹蛾(C.pomonellaLinnaeus)(苹果蚕蛾(codling moth))；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana Clemens)(色稻纵卷叶螟(variegated leafroller))；荷兰石竹小卷蛾(P.stultana Walsingham)(杂食卷叶蛾(omnivorous leafroller))；鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermuller)(欧洲葡萄蛾(European grape vine moth))；苹白小卷蛾(Spilonotaocellana Denis&Schiffermuller)(苹果芽小卷叶蛾(eyespotted bud moth))；萄果实虫主虫(Endopiza viteana Clemens)(葡萄小卷叶蛾(grape berry moth))；女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella Hübner)(葡萄果蠹蛾(vine moth))；巴西苹果卷叶虫(Bonagotasalubricola Meyrick)(巴西苹果小卷叶蛾(Brazilian apple leafroller))；东方果实蛾(Grapholita molesta Busck)(梨小食心虫(oriental fruit moth))；向日葵芽蛾(Suleima helianthana Riley)(向日葵芽蛾(sunflower bud moth))；带卷蛾属物种(Argyrotaenia spp.)；卷叶蛾属物种(Choristoneura spp.)。

鳞翅目中其他选择的农艺学有害生物包括但不限于秋星尺蠖(Alsophilapometaria Harris)(秋星尺蠖(fall cankerworm))；桃条麦蛾(Anarsia lineatellaZeller)(桃条麦蛾(peach twig borer))；栎橙纹犀额蛾(Anisota senatoria J.E.Smith)(橙色斑纹橡木虫(orange striped oakworm))；柞蚕(Antheraea pernyi Guérin-Meneville)(中国橡树柞蛾(Chinese Oak Tussah Moth))；家蚕(Bombyx mori Linnaeus)(桑蚕(Silkworm))；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)(棉叶潜蛾(cotton leafperforator))；纹黄豆粉蝶(Collas eurytheme Boisduval)(苜蓿粉蝶(alfalfacaterpillar))；核桃舟蛾(Datana integerrima Grote&Robinson)(核桃天社蛾(walnutcaterpillar))；落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov)(西伯利亚蚕蛾(Siberian silk moth))，白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria Hübner)(榆角尺蠖(elmspanworm))；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)(椴尺蠖(linden looper))；黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾(browntail moth))；黑拟蛉蛾(Harrisina americana Guérin-Meneville)(野棉花夜蛾(grapeleaf skeletonizer))；牧草天蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(牧草天蚕蛾(range caterpillar))；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury)(美国白蛾(fall webworm))；番茄茎麦蛾(Keiferialycopersicella Walsingham)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；东部铁杉尺蠖(Lambdinafiscellaria fiscellaria Hulst)(东部铁杉尺蠖(Eastern hemlock looper))；西部铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)(西部铁杉尺蠖(Western hemlock looper))；柳毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(雪毒蛾(satin moth))；舞毒蛾(Lymantria disparLinnaeus)(舞毒蛾(gypsy moth))；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth)(五点天蛾(five spotted hawk moth)，番茄天蛾(tomato hornworm))；烟草天蛾(M.sextaHaworth)(番茄天蛾(tomato hornworm)、烟草天蛾(tobacco hornworm))；冬尺蠖蛾(Operophtera brumata Linnaeus)(冬尺蠖蛾(winter moth))；春尺蠖(Paleacritavernata Peck)(春尺蠖(spring cankerworm))；美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontesCramer)(大黄带凤蝶(giant swallowtail)，柑桔凤蝶(orange dog))；加州木角斗蛾(Phryganidia californica Packard)(加州槲蛾(California oakworm))；柑桔潜蛾(Phyllocnistis citrella Stainton)(柑桔潜叶蛾(citrus leafminer))；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella Fabricius)(斑点幕型潜叶虫(spotted tentiformleafminer))；欧洲粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(大白粉蝶(large whitebutterfly))；菜青虫(P.rapae Linnaeus)(小白粉蝶(small white butterfly))；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)(绿脉菜粉蝶(green veined white butterfly))；洋蓟葱羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley)(洋蓟羽蛾(artichoke plume moth))；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)(小菜蛾(diamondback moth))；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella Saunders)(粉螟蛉(pink bollworm))；多形云粉蝶(Pontiaprotodice Boisduval&Leconte)(南方菜青虫(Southern cabbageworm))；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenee)(杂食尺蠖(omnivorous looper))；红抚天社蛾(Schizuraconcinna J.E.Smith)(红疣天社蛾(red humped caterpillar))；麦蛾(Sitotrogacerealella Olivier)(麦蛾(Angoumois grain moth))；松异带蛾(Thaumetopoeapityocampa Schiffermuller)(松树列队毛虫(pine processionary caterpillar))；幕谷蛾(Tineola bissellislla Hummel)(负袋夜蛾(webbing clothesmoth))；番茄斑潜蝇(Tuta absoluta Meyrick)(番茄斑潜蝇(tomato leafminer))；苹果巢蛾(Yponomeutapadella Linnaeus)(巢蛾(ermine moth))；实夜蛾(Heliothis subflexa Guenee)；天幕毛虫属物种(Malacosoma spp.)和古毒蛾属物种(Orgyia spp.)。

来自鞘翅目的农艺上重要的目的物种包括来自长角象虫科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括但不限于：墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis Boheman)(棉铃象甲(boll weevil))；稻水象甲(Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel)(稻水象虫(rice water weevil))；谷象(Sitophilus granariusLinnaeus)(谷象(granary weevil))；米象(S.oryzae Linnaeus)(米象(rice weevil))；三叶草叶象(Hypera punctata Fabricius)(车轴草叶象虫(clover leaf weevil))；密点细枝象(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stemweevil))；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红葵花籽象甲(red sunflower seedweevil))；灰色小爪象(S.sordidus LeConte)(灰葵花籽象甲(gray sunflower seedweevil))；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis Chittenden)(玉米象虫(maize billbug))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(科罗拉多马铃薯甲虫)；玉米根萤叶甲(Didbrotica virgifera virgifera LeConte)(西方玉米根虫)；北方玉米根虫(D.barberi Smith&Lawrence)(北方玉米根虫)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southern corn rootworm))；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer)(玉米跳甲(corn flea beetle))；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)(玉米跳甲)；肖叶甲褐斑(Colaspis brunneaFabricius)(葡萄肖叶甲(grape colaspis))；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(谷叶甲虫(cereal leaf beetle))；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)(向日葵叶甲(sunflower beetle))；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫，包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epikachna varivestis Mulsant)(墨西哥豆瓢虫(Mexican beanbeetle))；金龟子和来自金龟子科(Scarabaeidae)的其他甲虫，包括但不限于：日本丽金龟(Popillia japonica Newman)(日本甲虫)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealisArrow)(北方独角仙(northern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆头犀金龟(C.immaculata Olivier)(南方独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬(whitegrub))；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)(欧洲金龟子(Europeanchafer))；长毛食叶然金龟(Phyllophaga crinita Burmeister)(白蛴螬(white grub))；胡萝卜金龟(Ligyrus gibbosus De Geer)(胡萝卜金龟(carrot beetle))；来自皮蠹科(Dermestidae)的红缘皮蠹(carpet beetle)；来自叩甲科(Elateridae)、伪金针虫属物种(Eleodes spp.)、梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)的金针虫；宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)；叩甲属物种(Limonius spp.)；缺隆叩甲属物种(Agriotes spp.)；特尼塞拉属物种(Ctenicera spp.)；埃俄罗斯属物种(Aeolus spp.)；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫和来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫。

引人关注的是来自双翅目的农艺上重要的物种，包括潜叶虫玉米斑潜蝇(Agromyza parvicornis Loew)(玉米斑潜蝇(corn blotch leafminer))；摇蚊科(包括但不限于：高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett)(高梁瘿蚊(sorghum midge))；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor Say)(黑森蝇(Hessian fly))；麦红吸浆虫(Sitodiplosismosellana Géhin)(小麦吸浆虫(wheat midge))；葵花籽蚊(Neolasiopteramurtfeldtiana Felt)(向日葵籽瘿蚊(sunflower seed midge)))；果蝇(实蝇科(Tephritidae))、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit Linnaeus)(果蝇(frit flies))；蛆虫，包括但不限于：灰地种蝇(Delia platura Meigen)(种蝇(seedcorn maggot))；麦地种蝇(D.coarctata Fallen)(麦秆蝇(wheat bulb fly))；和其他地种蝇属物种(Delia spp.)、美洲麦秆蝇(Meromyza americana Fitch)(美洲麦秆蝇(wheat stem maggot))；家蝇(Musca domestica Linnaeus)(家蝇(house flies))；夏厕蝇(Fannia canicularisLinnaeus)、小舍蝇(F.femoralis Stein)(小家蝇(lesser house flies))；厩螫蝇(Stomoxys calcitrans Linnaeus)(螫蝇(stable flies))；秋家蝇(face flies)、角蝇(horn flies)、丽蝇(blow flies)、金蝇属物种(Chrysomya spp.)；伏蝇属物种(Phormiaspp.)；和其他麝香蝇(muscoid fly)有害生物、马蝇虻属物种(horse flies Tabanusspp.)；肤蝇胃蝇属物种(bot flies Gastrophilus spp.)；狂蝇属物种(Oestrus spp.)；纹皮蝇皮蝇属物种(cattle grubs Hypoderma spp.)；鹿蝇斑虻属物种(deer fliesChrysops spp.)；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus)(绵羊蜱)；和其他短角亚目(Brachycera)，蚊子伊蚊属物种(Aedes spp.)；疟蚊属物种(Anopheles spp.)；家蚊属物种(Culex spp.)；黑蝇原蚋属物种(black flies Prosimulium spp.)；蚋属物种(Simuliumspp.)；吸血蠓、沙蝇、眼菌蚊(sciarid)和其他长角亚目(Nematocera)。

来自半翅目和同翅目的农学上重要的目的物种，例如但不限于：来自球蚜科(Adelgidae)的球蚜、来自盲蝽科(Miridae)的盲蝽、来自蝉科(Cicadidae)的蝉、叶蝉、小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.)；来自叶蝉科的，来自菱蜡蝉科(Cixiidae)、青翅飞虱科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、瓢蜡蝉科(lssidae)和(Delphacidae)的飞虱，来自角蝉科(Membracidae)的角蝉，来自木虱科(Psyllidae)的木虱，来自粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱，来自蚜科(Aphididae)的蚜虫，来自根瘤蚜科(Phylloxeridae)的葡萄根瘤蚜，来自粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧，来自链介壳虫科(Asterolecanidae)、蚧科(Coccidae)、粉蚧科(Dactylopiidae)、盾蚧科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、旌介壳虫科(ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)和绵蚧科(Margarodidae)的介壳虫，来自网蝽科的网蝽，来自蝽科(Pentatomidae)的椿象，长蝽(cinch bug)，土长蝽属物种(Blissus spp.)；和来自长蝽科(Lygaeidae)的其他籽长蝽、来自沫蝉科(Cercopidae)的沫蝉、来自缘蝽科(Coreidae)的南瓜缘蝽和来自红蝽科(Pyrrhocoridae)的秋恙螨和棉蝽。

来自同翅目的其他农艺上重要的成员进一步包括但不限于：豌豆蚜(Acyrthisiphon pisum Harris)(豌豆蚜虫(pea aphid))；黑豆蚜(Aphis craccivoraKoch)(蚕豆蚜(cowpea aphid))；甜菜蚜(A.fabae Scopoli)(黑豆蚜(black beanaphid))；棉蚜(A.gossypii Glover)(棉蚜虫(cotton aphid，melon aphid))；玉米根蚜(A.maidiradicis Forbes，corn root aphid)；苹果黄蚜(A.pomi De Geer)(苹蚜(appleaphid))；绣线菊蚜(A.spiraecola Patch)(绣线菊蚜(spirea aphid))；茄沟无网蚜(Aulacorthum solani Kaltenbach)(毛地黄蚜虫(foxglove aphid))；草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii Cockerell)(草莓蚜(strawberry aphid))；麦双尾蚜(Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko)(俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid))；车前圆尾蚜(Dysaphis plantaginea Paaserini)(苹粉红劣蚜(rosy apple aphid))；苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum Hausmann)(苹果绵蚜(woolly apple aphid))；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus)(菜蚜(cabbage aphid))；桃粉大尾蚜(Hyalopteruspruni Geoffroy)(桃大尾蚜(mealy plum aphid))；萝卜蚜(Lipaphis erysimiKaltenbach)(萝卜蚜(turnip aphid))；麦无网长管蚜(Metopolophium dirrhodumWalker)(麦蚜虫(cereal aphid))；马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas)(马铃薯蚜(potato aphid))；桃蚜(Myzus persicae Sulzer)(桃-马铃薯蚜虫，绿桃蚜虫)；莴苣衲长管蚜(Nasonovia ribisnigri Mosley)(莴苣蚜(lettuce aphid))；瘿绵对属物种(Pemphigus spp.)(根蚜虫(root aphids)和倍蚜(gall aphids))；玉米蚜(Rhopalosiphummaidis Fitch)(玉米蚜(corn leafaphid))；稻麦蚜(R.padi Linnaeus)(禾谷缢管蚜(birdcherry-oat aphid))；麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rondani)(麦二叉蚜(greenbug))；牛鞭草蚜(Sipha flava Forbes)(甘蔗黄蚜(yellow sugarcane aphid))；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius)(麦长管蚜(English grain aphid))；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculata Buckton)(苜蓿斑蚜(spotted alfalfa aphid))；桔二叉蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)(黑色桔二叉蚜(black citrus aphid))；以及大桔蚜(T.citricida Kirkaldy)(棕色桔二叉蚜(brown citrus aphid))；球属物种(Adelges spp.)(球蚜(adelgids))；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrixPergande)(山胡桃根瘤蚜(pecan phylloxera))；烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)(烟粉虱(tobacco whitefly)，甘薯粉虱(sweetpotato whitefly))；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows&Perring)(银叶粉虱(silverleafwhitefly))；柑橘粉虱(Dialeurodes citri Ashmead)(柑桔粉虱(citrus whitefly))；结翅白粉虱(Trialeurodes abutiloneus)(带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly))和温室粉虱(T.vaporariorum Westwood)(温室粉虱(greenhouse whitefly))；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris)(马铃薯叶蝉(potato leafhopper))；灰飞虱(Laodelphaxstriatellus Fallen)(小褐飞虱(smaller brown planthopper))；二点叶蝉(Macrolestesquadrilineatus Forbes)(紫菀叶蝉(aster leafhopper))；黑尾叶蝉(Nephotettixcinticeps Uhler)(青大叶蝉(green leafhopper))；二条斑黑尾叶蝉(N.nigropictus

来自半翅目的农艺上重要的目的物种包括但不限于：拟绿蝽(Acrosternumhilare Say)(稻绿蝽(green stink bug))；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(南瓜虫(squash bug))；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say)(麦长蝽(chinchbug))；方翅网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(棉网蝽(cotton lace bug))；番茄蝽(Cyrtopeltis modesta Distant)(番茄蝽(tomato bug))；棉蝽(Dysdercus suturellusHerrich-

此外，实施例可以对半翅目有效，如草莓蝽(Calocoris norvegicus Gmelin)(草莓长蝽(strawberry bug))；荒野奥盲蝽(Orthops campestris Linnaeus)；苹果盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen)(苹盲蝽(apple capsid))；番茄蝽(Cyrtopeltismodestus Distant，tomato bug)；黑斑烟盲蝽(Cyrtopeltis notatus Distant)(吸蝇(suckfly))；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus Reuter，whitemarkedfleahopper)；皂英蝽(Diaphnocoris chlorionis Say)(皂角蝽(honeylocust plantbug))；洋葱蝽(Labopidicila allii Knight)(葱盲蝽(onion plant bug))；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter)(棉盲蝽(cotton fleahopper))。苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris rapidus Say，rapid plant bug)；四线盲蝽(Poecilocapsus lineatusFabricius)(四线叶虫(four-lined plant bug))；小长蝽(Nysius ericae Schilling)(多彩长蝽(false chinch bug))；假麦长蝽(Nysius raphanus Howard，false chinch bug)；稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus)(南方绿椿象(Southern green stink bug))；扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)；缘蝽科物种(Coreidae spp.)；红蝽科物种(Pyrrhocoridaespp.)；谷蛾科物种(Tinidae spp.)；负子蝽科物种(Blostomatidae spp.)；猎蝽属物种(Reduviidae spp.)；和臭虫属物种(Cimicidae spp.)。

来自蜱螨目(Acari)(螨类)的农艺上重要的目的物种，例如小麦瘤瘿螨(Aceriatosichella Keifer)(小麦卷叶螨(wheat curl mite))；麦岩螨(Petrobia latens Müller)(褐色小麦螨(brown wheat mite))；叶螨科(Tetranychidae)中的蜘蛛螨(spidermite)和红螨(red mite)，苹果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)(欧洲红螨(European redmite))；二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)(二点叶螨(two spotted spider mite))；迈叶螨(T.medanieli McGregor)(迈叶螨(McDaniel mite))；朱砂叶螨(T.cinnabarinusBoisduval，carmine spider mite)；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski)(土耳其斯坦叶螨(strawberry spider mite))；细须螨科(Tenuipalpidae)中的葡萄短须螨(flat mites)，桔短须螨(Brevipalpus lewisi McGregor)(桔短须螨(citrus flatmite))；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他叶摄食螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨、硬蜱科(Ixodidae)的蜱。肩突硬蜱(Ixodes scapularisSay)(鹿蜱(deer tick))；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann)(澳大利亚麻痹蜱(Australian paralysis tick))；变异革蜱(Dermacentor variabilis Say)(美洲犬蜱(American dog tick))；美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)(孤星蜱(lonestar tick))；以及在痒螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)中的痒螨和疥螨。引人关注的是缨尾目(Thysanura)的昆虫有害生物，如衣鱼(Lepismasaccharina Linnaeus)(蠹虫(silverfish))；家衣鱼(Thermobia domestica Packard)(家衣鱼(firebrat))。

覆盖的另外的节肢动物有害生物包括：蜘蛛目(Araneae)的蜘蛛，例如褐隐毒蛛(Loxosceles reclusa Gertsch&Mulaik)(棕色隐蜘蛛(brown recluse spider))；和屠戮寇蛛(Latrodectus mactans Fabricius)(黑寡妇蜘蛛)；和蚰蜒目(Scutigeromorpha)的唇足类，例如地中海蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus)(家蜈蚣)。

线虫包括寄生线虫如根结线虫、胞囊线虫、和腐线虫，包括异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)、和球异皮线虫属物种(Globodera spp.)；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于：大豆异皮线虫(Heteroderaglycines)(大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode))；甜菜异皮线虫(Heteroderaschachtii)(甜菜胞囊线虫(beet cyst nematode))；禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)(禾谷孢囊线虫(cereal cyst nematode))；以及马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫)。腐线虫包括短体线虫属物种(Pratylenchus spp)。

用于测量杀昆虫活性的方法是本领域中所熟知的。参见，例如，Czapla和Lang，(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]83：2480-2485；Andrews等人，(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252：199-206；Marrone等人，(1985)J.of EconomicEntomology[经济昆虫学杂志]78：290-293以及美国专利号5,743,477，将其全部通过引用以其全文并入本文。通常，在取食测定中混合RNA复合物并使用。参见，例如，Marrone等人，(1985)，J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]78：290-293。此类测定可以包括将植物与一种或多种有害生物接触，并且确定所述植物存活和/或造成所述有害生物死亡的能力。对于每种物质或生物体，针对在特定环境中受影响的每种有害生物，根据经验确定杀昆虫有效量。

用于抑制昆虫有害生物或将其杀伤和控制昆虫群体的方法。

在一些实施例中，提供了用于抑制昆虫有害生物生长或将其杀伤的方法，所述方法包括使昆虫有害生物与杀昆虫有效量的RNA复合物接触。在某些方面，RNA复合物包含RNAi介导分子。

在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的RNA复合物接触。在某些方面，RNA复合物包含RNAi介导分子。

在一些实施例中，提供了用于控制对杀有害生物RNAi分子(例如小RNA分子)具有抗性的昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括将昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的RNA复合物接触。在某些方面，RNA复合物包含RNAi介导分子。

在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括在植物或其细胞中表达RNA复合物。在某些方面，RNA复合物包含RNAi介导分子。

抗昆虫管理(IRM)策略

用来增加转基因抗昆虫性状对靶昆虫有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的一种方法是使用或提供非转基因(即非杀昆虫蛋白或RNA复合物)庇护所(非杀昆虫作物/玉米的一部分)。美国环境保护局(United States EnvironmentalProtection Agency)(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm，其可以使用www前缀进行访问)发布了与生产对靶标有害生物具有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的要求。另外，国家玉米种植者协会(National Corn GrowersAssociation)在其网站上(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn，所述网址可使用www前缀访问)也提供了有关庇护所要求的类似指导。由于庇护区内的昆虫有害生物所造成的损失，较大的庇护所可能会降低总产量。

用来增加转基因抗昆虫性状对靶昆虫有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的另一种方法将是具有杀昆虫基因的储存库，所述储存库可以有效地对抗昆虫有害生物的组，并通过不同的作用方式显现其作用。

在植物中表达对相同昆虫物种有毒的两种或更多种杀昆虫组合物(每种杀昆虫剂以有效水平表达)是实现对转基因植物有抗性的昆虫发展的控制的另一种方法。这是基于以下原则：对两种不同作用模式的抗性演变远比仅一种更不可能。例如，Roush概述了用于管理杀昆虫转基因作物的双毒素策略，也称为“金字塔结构”或“堆叠”。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.[皇家学会伦敦皇家学会哲学会刊B系列]，(1998)353：777-1786)。两种不同杀昆虫分子(每种都能有效对抗靶标有害生物并几乎没有或没有交叉抗性)的堆叠或金字塔结构可以允许使用较小的庇护所。美国环境保护局要求所种植非Bt玉米的结构性庇护所(通常为5％)比单一性状产品(通常为20％)显著更少。存在提供庇护所的抗昆虫管理效应的多种方法，包括在作物田地中的多种几何种植模式和包装好(in-bag)的种子混合物，如进一步通过Roush所讨论的。

在一些实施例中，本公开的RNA复合物可用作与其他杀昆虫分子组合的(即金字塔的)抗昆虫管理策略，这些其他杀昆虫分子包括但不限于Bt毒素、致病杆菌属物种或发光杆状菌属物种杀昆虫蛋白、小RNA分子或RNAi介导分子等。在这样一个实施例中，植物的产量显著增加。

提供了在促进抗昆虫管理的转基因植物中控制一种或多种鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目或鞘翅目昆虫侵染的方法，所述方法包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫分子。在某些方面，这些杀有害生物分子中的一种包含RNAi介导分子。在这样一个实施例中，植物的产量显著增加。

在一些实施例中，在转基因植物中控制鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并且促进抗昆虫管理的方法，其中杀昆虫分子中的至少一种包含对以下目中的昆虫具有杀昆虫活性的RNAi介导分子：鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目和/或鞘翅目。在这样一个实施例中，植物的产量显著增加。

在一些实施例中，在转基因植物中控制鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并且促进抗昆虫管理的方法包括在转基因植物中表达具有不同作用模式的对以下目中的昆虫具有杀昆虫活性的RNA和蛋白：鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目和/或鞘翅目。在这样一个实施例中，植物的产量显著增加。

还提供了降低鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目和/或鞘翅目昆虫对表达杀昆虫分子以控制昆虫物种的转基因植物产生抗性的可能性的方法，所述方法包括表达与具有不同作用模式的针对这些昆虫物种的第二种杀昆虫分子组合的、对这些昆虫物种具有杀昆虫活性的RNA复合物。在某些方面，RNA复合物包含RNAi介导分子。在这样一个实施例中，植物的产量显著增加。

本文还提供了用于转基因植物的有效鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目和/或鞘翅目抗昆虫管理的方式，所述方式包括在植物中共表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有毒性的两种或更多种杀昆虫分子，但是每种杀昆虫分子都表现出不同的实行其抑制活性的模式，其中所述两种或更多种杀昆虫分子包括RNA复合物和Cry蛋白。在某些方面，RNA复合物包含RNAi介导分子。

另外，提供了用于获得让监管部门批准种植或商业化表达对鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目和/或鞘翅目中的昆虫具有杀昆虫作用的分子的植物的方法，所述方法包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，所述数据显示RNA复合物不与此类昆虫中的Cry蛋白的结合位点竞争。在某些方面，RNA复合物包含RNAi介导分子。另外，提供了用于获得让监管部门批准种植或商业化表达对鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目和/或鞘翅目中的昆虫具有杀昆虫作用的分子的植物的方法，所述方法包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，所述数据显示RNA复合物不与此类昆虫中的Cry蛋白的结合位点竞争。在这样一个实施例中，植物的产量显著增加。

使用Cry蛋白作为转基因植物性状是本领域技术人员所熟知的，并且Cry转基因植物(包括但不限于Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt)已获得监管部门的批准(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal[植物生物技术杂志]9：283-300和CERA(2010)转基因作物数据库环境风险评估中心(CERA)(GM CropDatabase Center for Environmental Risk Assessment)，ILSI研究基金会，华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。本领域技术人员熟知的多于一种杀昆虫分子也可以在植物中表达，这些杀昆虫分子如Vip3Ab和Cry1Fa(US 2012/0317682)、Cry1BE和Cry1F(US 2012/0311746)、Cry1CA和Cry1AB(US 2012/0311745)、Cry1F和CryCa(US 2012/0317681)、Cry1DA和Cry1BE(US 2012/0331590)、Cry1DA和CrylFa(US 2012/0331589)、Cry1AB和Cry1BE(US 2012/0324606)、以及Cry1Fa和Cry2Aa、Cry1I或Cry1E(US 2012/0324605)。杀昆虫分子还包括杀昆虫脂肪酶，这些杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Purcell等人(1993)Biochem Biophys Res Commun[生物化学与生物物理学研究通讯]15：1406-1413)。杀昆虫分子进一步包括IPD072(PCT/US14/55128)和IPD079(PCT/US2016/041452)。杀昆虫分子还包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020中的VIP(营养性杀昆虫蛋白)毒素等。其他VIP蛋白质是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀昆虫分子还包括毒素复合物(TC)蛋白，所述毒素复合物蛋白可从生物体如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属获得(参见，美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素(stand-alone toxin)的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)提高了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀昆虫分子还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的实例包括但不限于莱科毒素(lycotoxin)-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。在这样一个实施例中，植物的产量显著增加。

在进一步的实施例中，在植物内表达编码RNA复合物的基因的方法导致经由阻遏昆虫有害生物的靶mRNA的表达来保护植物免受昆虫有害生物侵害。在某些方面，RNA复合物包含RNAi介导分子。在这样一个实施例中，植物的产量显著增加。

本文还公开了将RNA复合物递送至昆虫有害生物的方法。这样的控制剂可以直接或间接地导致昆虫进食、生长或以其他方式对宿主植物造成损害的能力受损。在一些实施例中，提供了一种方法，该方法包括将RNA复合物递送至昆虫有害生物以阻遏昆虫有害生物中的至少一个靶基因，从而减少或消除昆虫有害生物造成的植物损害。在一些实施例中，抑制昆虫有害生物中靶基因表达的方法可导致昆虫有害生物的生长、发育、繁殖和/或取食停止。在一些实施例中，该方法可以最终导致昆虫有害生物死亡。

在一些实施例中，提供包含本公开的RNA复合物的组合物(例如，局部组合物)用于植物和/或植物的环境中以实现昆虫有害生物的消除或减少。在特定实施例中，组合物可以是营养组合物或食物来源以供昆虫有害生物摄取。一些实施例包括使营养组合物或食物来源可用于昆虫有害生物。摄取包含RNA复合物的组合物可导致昆虫有害生物的一个或多个细胞摄取分子，这又可导致抑制至少一个靶基因在昆虫有害生物的一个或多个细胞中的表达。通过在昆虫有害生物的宿主中提供包含本公开的RNA复合物的一种或多种组合物，昆虫有害生物对植物或植物细胞的摄取或损害可以在昆虫有害生物存在的任何宿主组织或环境中或其上被限制或消除。

在其他实施例中，该组合物可以是局部组合物。一些实施例包括使局部用组合物可用于昆虫有害生物。包含本公开的RNA复合物的组合物的接触可导致昆虫有害生物的一个或多个细胞摄取分子，这又可导致抑制至少一个靶基因在昆虫有害生物的一个或多个细胞中的表达。通过在昆虫有害生物的宿主中提供包含本公开的RNA复合物的一种或多种组合物，昆虫有害生物对植物或植物细胞的损害可以在昆虫有害生物存在的任何宿主组织或环境中或其上被限制或消除。

在实施例中，目的mRNA分子是多核苷酸。在某些方面，多核苷酸编码基因。在一些方面，目的分子是异源编码序列(例如，目的转基因)。目的转基因可以与本公开的细胞穿透肽复合。适用于本公开的构建体的目的示例性转基因包括但不限于赋予如下的编码序列：(1)有害生物抗性或疾病抗性、(2)对除草剂的耐受性、(3)添加农艺性状的价值，如；产量提高、氮利用效率、水利用效率和营养品质，(4)蛋白质以位点特异性方式与DNA结合，(5)表达小RNA或RNAi介导分子；以及(6)可选择标记。根据一个实施例，细胞穿透肽与目的mRNA分子复合以递送转基因/异源编码序列，该转基因/异源编码序列编码可选择标记或赋予杀昆虫抗性、除草剂耐受性、小RNA或RNAi介导分子表达、氮利用效率、水利用效率、或营养品质的基因产物。

1.抗昆虫

各种抗昆虫基因可以作为mRNA与细胞穿透肽连接。细胞穿透肽可以可操作地连接至表达抗昆虫性状的mRNA。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性抗昆虫编码序列是本领域已知的。作为可与本公开的调节元件可操作地连接的抗昆虫编码序列的实施方案，提供以下性状。提供示例性抗鳞翅目昆虫性的编码序列包括：cry1A：cry1A.105；cry1Ab；cry1Ab(截短的)；cry1Ab-Ac(融合蛋白)；cry1Ac(作为

2.除草剂耐受性

多种除草剂耐受性基因可以作为mRNA与细胞穿透肽连接。细胞穿透肽可以可操作地连接至表达除草剂耐受性性状的mRNA。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性除草剂耐受性编码序列是本领域已知的。作为可与本公开的调节元件可操作地连接的除草剂耐受性编码序列的实施方案，提供以下性状。草甘膦除草剂通过抑制EPSPS酶(5-烯醇式丙酮酸莽草酸酯-3-磷酸合酶)而发挥作用。该酶参与植物的生长和发育必不可少的芳香氨基酸的生物合成。本领域已知的多种酶促机制可用于抑制该酶。可以将编码此类酶的基因可操作地连接到本公开的基因调节元件。在实施例中，可选择标记基因包括但不限于编码如下的基因：草甘膦抗性基因，包括突变体EPSPS基因，例如2mEPSPS基因、cp4 EPSPS基因、mEPSPS基因、dgt-28基因；aroA基因；和草甘膦降解基因，如草甘膦乙酰基转移酶基因(gat)和草甘膦氧化酶基因(gox)。这些性状目前作为Gly-Tol

3.农艺性状

各种农艺性状基因可以作为mRNA与细胞穿透肽连接。细胞穿透肽可以可操作地连接到作为农艺性状基因的mRNA。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性农艺性状编码序列是本领域已知的。作为可与本公开的调节元件可操作地连接的农艺性状编码序列的实施方案，提供以下性状。当在玉蜀黍中表达时，由athbl7基因提供的玉蜀黍穗生物量的增加可以导致更大的穗大小和增加的穗丝潜力。pg基因提供的延迟的果实软化抑制了导致细胞壁中果胶分子分解的聚半乳糖醛酸酶的产生，从而导致了果实的延迟软化。

此外，延迟的acc基因果实成熟/衰老阻遏了天然acc合酶基因的正常表达，导致乙烯产量减少和果实成熟延迟。而accd基因代谢果实成熟激素乙烯的前体，导致果实成熟延迟。可替代地，sam-k基因通过减少S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(乙烯生产的底物)而导致延迟成熟。cspB基因提供的干旱胁迫耐受表型通过保持RNA稳定性和翻译来维持水分胁迫条件下的正常细胞功能。进一步的实例包括Hahb-4基因。另一个实例包括EcBetA基因，其催化渗透保护剂化合物甘氨酸甜菜碱的产生，赋予了对水分胁迫的耐受性。另外，RmBetA基因催化渗透保护剂化合物甘氨酸甜菜碱的产生，赋予了对水分胁迫的耐受性。bbx32基因提供光合作用和增产，该基因表达一种蛋白质，该蛋白质与一种或多种内源性转录因子相互作用以调节植物的昼/夜生理过程。可以通过表达编码热稳定的α-淀粉酶的amy797E基因来增加乙醇产量，该酶可以通过增加用于降解淀粉的淀粉酶的热稳定性来增强生物乙醇的产量。最后，修饰的氨基酸组合物可以通过编码二氢二吡啶甲酸合酶的cordapA基因的表达而产生，该酶增加了氨基酸赖氨酸的产生。农艺性状编码序列的列表并不意指是限制性的。本公开涵盖任何农艺性状编码序列。

4.DNA结合蛋白

各种DNA结合转基因/异源编码序列可以连接到作为mRNA的细胞穿透肽。细胞穿透肽可以作为表达DNA结合基因性状的mRNA可操作地连接。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性DNA结合蛋白质编码序列是本领域已知的。作为可与本公开的调节元件可操作地连接的DNA结合蛋白编码序列的实施例，以下类型的DNA结合蛋白可包括：锌指、TALEN、CRISPR和大范围核酸酶。DNA结合蛋白质编码序列的列表并不意指是限制性的。本公开涵盖任何DNA结合蛋白质编码序列。

5.小RNA

各种小RNA序列可以作为mRNA与细胞穿透肽连接。细胞穿透肽可以可操作地连接至表达小RNA序列性状的mRNA。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性小RNA性状是本领域已知的。作为可与本公开的调节元件可操作地连接的小RNA编码序列的实施方案，提供以下性状。例如，通过沉默编码乙烯形成酶的ACO基因的表达，阻遏了乙烯的产生，抗efe小RNA的延迟果实成熟/衰老延迟了成熟。通过抑制内源性S-腺苷-L-甲硫氨酸，改变了ccomt小RNA的木质素产生，从而降低了胍基(G)木质素的含量：反式咖啡酰氧基CoA 3-O-甲基转移酶(CCOMT基因)。

此外，可通过Ppo5小RNA减少疣状茄(Solanum verrucosum)中黑斑瘀伤耐受性，该Ppo5小RNA触发Ppo5转录物的降解，从而阻止黑点瘀伤的发展。还包括dvsnf7小RNA，其dsRNA包含西方玉米根虫(Western Corn Rootworm)Snf7基因的240bp片段，可抑制西方玉米根虫。修饰的淀粉/碳水化合物可以由小RNA产生，如pPhL小RNA(降解PhL转录物以限制通过淀粉降解形成还原糖)和pR1小RNA(降解R1转录物以限制通过淀粉降解形成还原糖)。另外，益处还包括asn1小RNA引起的丙烯酰胺含量降低，该asn1小RNA触发Asn1降解从而损害天冬酰胺的形成并降低了聚丙烯酰胺含量。最后，pgas ppo阻遏小RNA的非褐色表型导致阻遏PPO以产生具有非褐色表型的苹果。以上小RNA的列表并不意指是限制性的。本公开涵盖任何小RNA编码序列。

6.可选择标记

也被描述为报道基因的各种可选择标记可以连接至细胞穿透肽。细胞穿透肽可以可操作地连接至表达报告基因性状的mRNA。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。有许多方法可用于确认可选择标记在转化植物中的表达，包括例如DNA测序和PCR(聚合酶链式反应)、DNA印迹、RNA印迹、用于检测从载体表达的蛋白质的免疫学方法。但是，通常通过目测观察蛋白质时观察到的报告基因，这些蛋白质在表达时会产生有色产物。示例性的报告基因是本领域已知的，并编码β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP、Phi-YFP)、红色荧光蛋白(DsRFP、RFP等)、β-半乳糖苷酶等(参见Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第三版，冷泉港出版社，纽约，2001，其内容通过引以其全文并入本文)。

利用可选择标记基因来选择经转化的细胞或组织。可选择标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)、壮观霉素/链霉素抗性(AAD)和潮霉素磷酸转移酶(HPT或HGR)的基因，以及赋予对除草化合物抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码对除草剂不敏感的修饰目标蛋白，或编码在其起作用之前能降解植物中的除草剂或使其解毒的酶。例如，已经通过使用编码突变目标酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸酯-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因获得了对草甘膦的抗性。EPSPS的基因和突变体是熟知的，并且在下面进一步描述。通过使用编码PAT或DSM-2、腈水解酶、AAD-1或AAD-12(这些都是使其对应的除草剂去毒的蛋白质的实例)的细菌基因分别获得了对草铵膦、溴苯腈和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的抗性。

在实施例中，除草剂可抑制生长点或分生组织，包括咪唑啉酮或磺酰脲，并且对这些除草剂具有乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的抗性/耐受性的基因是众所周知的。草甘膦抗性基因包括突变型5-烯醇式丙酮酸莽草酸酯-3-磷酸合酶(EPSPs)和dgt-28基因(通过引入重组核酸和/或对天然EPSPs基因进行多种体内诱变)、aroA基因和草甘膦乙酰基转移酶(GAT)基因。其他膦酰基化合物的抗性基因包括来自链霉菌种的bar和pat基因，包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和Streptomyces viridichromogenes，以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(编码ACCase抑制剂的基因)。赋予对环己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸的抗性的示例性基因(包括吡氟氯禾灵、禾草灵、精恶唑禾草灵酸、吡氟禾草灵和喹禾灵)包括乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的基因；Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3。在实施例中，除草剂可以抑制光合作用，包括三嗪(psbA和1s+基因)或苄腈(硝化酶基因)。此外，此类可选择标记可以包括阳性选择标记，如磷酸甘露糖异构酶(PMI)酶。

在实施例中，可选择标记基因包括但不限于编码如下的基因：2，4-D；新霉素磷酸转移酶II；氰酰胺水合酶；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶；色氨酸脱羧酶；二氢吡啶二羧酸合酶和脱敏天冬氨酸激酶；bar基因；色氨酸脱羧酶；新霉素磷酸转移酶(NEO)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)；二氢叶酸还原酶(DHFR)；草丁膦乙酰转移酶；2，2-二氯丙酸脱卤素酶；乙酰羟酸合成酶；5-烯醇式丙酮酸-莽草酸酯-磷酸合酶(aroA)；卤代芳基腈水解酶；乙酰辅酶A羧化酶；二氢蝶呤合酶(sulI)；和32kD光系统II多肽(psbA)。实施例还包括可选择标记基因，其编码对以下的抗性：氯霉素；甲氨蝶呤；潮霉素；壮观霉素；溴草腈；草甘膦：和草丁膦。以上可选择标记基因的列表并不意在是限制性的。本公开涵盖任何报告基因或可选择标记基因。

在一些实施例中，合成编码序列以在植物中最佳表达。例如，在实施例中，已经通过密码子优化修饰了基因的编码序列以增强在植物中的表达。可以优化杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、或可选择标记转基因/异源编码序列，以在特定植物物种中表达，或可替代地可以修饰上述转基因/异源编码序列以在双子叶或单子叶植物中最佳表达。植物偏好性密码子可以从特定目的植物物种中以最大量表达的蛋白质中频率最高的密码子确定。在实施例中，编码序列、基因、异源编码序列或转基因/异源编码序列被设计成在植物中以更高的水平表达，从而导致更高的转化效率。植物基因优化的方法是熟知的。关于合成DNA序列的优化和产生的指导可以在例如WO 2013016546、WO 2011146524、WO 1997013402、美国专利号6166302和美国专利号5380831、美国专利申请号20140090115(通过引用并入本文)中找到。

在本公开的实施例中，本公开涉及在载体内工程改造的基因表达盒。载体的实例包括质粒、粘粒、细菌人工染色体、病毒、和噬菌体。在一个方面，基因表达盒包含一个或多个另外的转基因性状。在另一个方面，所述一个或多个另外的转基因性状选自由以下组成的组：赋予杀昆虫抗性、除草剂耐受性的异源编码序列，赋予氮利用效率的核酸，赋予水利用效率的核酸，赋予营养品质的核酸，编码DNA结合蛋白的核酸，以及编码可选择标记的核酸。在其他方面，异源编码序列可操作地连接到驱动RNA复合物的表达的一个或多个异源调控序列。

商品产品

在实施例中，本公开包括商品产品。在某些方面，在本公开的转基因植物内产生商品产品。示例性商品产品包括蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、谷物、粗粉、面粉、油或纤维。在其他实例中，当由转基因植物或植物部分制造时，此类商品产品可以包括完整的或加工的种子、含有本公开的转基因植物或转基因植物副产品的动物饲料、油、粗粉、面粉、淀粉、薄片、麸、生物质和秸秆、以及燃料产品和燃料副产品。

此外，商品产品可以出售给消费者或可以是活的或无法存活的。无法存活的商品产品包括但不限于无法存活的种子；加工的种子、种子部分、和植物部分；用于饲料或食品、油、粗粉、面粉、薄片、麸、生物质、和燃料产品的加工的种子和植物部分。活的商品产品包括但不限于种子、植物、和植物细胞。因此，包含本公开的多核苷酸和RNA复合物的植物可以用于制造典型地获得自这样一种转基因作物植物的任何商品产品。

作物植物

如本文所使用的，术语“植物”包括整株植物以及任何后代，细胞、组织或植物的一部分。可以在本发明中使用的植物类别通常与易于诱变的高等和低等植物类别一样广泛，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶植物和单子叶植物。术语“植物部分”包括植物的一个或多个任何部分，包括例如且不限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物切段；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如花粉、胚、花朵、果实、枝、叶、根、茎和外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织或组织成结构或功能单元的任何其他组的植物细胞。植物细胞或组织培养物可能能够再生具有从其获得细胞或组织的植物的生理和形态特征的植物，并且能够再生具有与所述植物基本上相同的基因型的植物。相反，一些植物细胞不能再生以产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚胎、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花丝、花、籽粒、穗、穗轴、苞叶或茎秆。

植物部分包括可收获部分和可用于后代植物繁殖的部分。可用于繁殖的植物部分包括例如但不限于：种子；果实；插条；秧苗；块茎；和根茎。植物的可收获部分可以是植物的任何有用的部分，包括例如但不限于：花；花粉；秧苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。

植物细胞是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单个细胞或细胞聚集物(例如，易碎的愈伤组织和培养的细胞)的形式，并且可以是更高组织的单元(例如，植物组织、植物器官和植物)的部分。因此，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞或可以再生为整株植物的细胞或细胞集合。这样，包含多个植物细胞并且能够再生为整株植物的种子在本文的实施例中被认为是“植物细胞”。

本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利和专利申请)均以与本公开的明确细节不矛盾的程度通过引用特此并入，并且并入程度如同每个参考文献是单独并且特别地指示通过引用并入并且在本文以其全文阐述一般。本文讨论的参考文献只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容不应解释为承认诸位发明人无权因在先发明而享有早于此类公开内容的权利。

在以下实例中进一步例示本公开的实施例。应当理解的是，这些实例仅是通过说明的方式给出的。从上述实施例和以下实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特性，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可进行本公开的实施例的各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，从上述说明书来看，除了本文所示出和描述的那些之外，本公开的实施例的各种修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。此类修改也当视为落入所附权利要求的范围内。以下内容以说明的方式提供，并不旨在限制本发明的范围。

实例

实例1：RNA的制备

从TriLink生物技术公司(TriLink Biotechnologies)(圣地亚哥，加利福尼亚州)获得编码mCherry荧光蛋白的未经标记的单链信使RNA(mRNA)(CleanCap mCherry mRNA[5moU]，1.0mg·mL

实例2：细胞穿透肽的制备

制备表3中的细胞穿透肽(CPP)子集用于昆虫细胞系或全昆虫测定中。表1和表2中提供了可用于与RNA分子缀合的CPP的更完整列表。线性CPP从金斯瑞公司(Genscript)(皮斯卡塔韦，新泽西州)订购，有和没有荧光修饰。未经标记的CPP或与FAM染料缀合的CPP的原液在干冰上冻干，在水中重构，并储存在-80℃。根据处理准备的需要，在水中稀释工作原液。接收CPP-YFP融合原液后在-80℃储存在磷酸盐缓冲盐水(PBS)、10％甘油、pH 7.4中，并且根据处理准备的需要，在分子生物学级水中稀释工作原液。分支两亲肽胶囊(BAPC1)购自Phoreus

实例3：纳米复合物样品的制备

样品制备和分析方法基于之前报道的方法(Jafari等人(2014)“Serum stabilityand physicochemical characterization of a novel amphipathic peptide C6M 1 forsiRNA delivery[用于siRNA递送的新型两性肽C6M 1的血清稳定性和物理化学表征]”，PLoS One[公共科学图书馆-综合]，9(5)，e97797；和Gillet等人(2017)“InvestigatingEngineered Ribonucleoprotein Particles to Improve Oral RNAi Delivery in CropInsect Pests[研究工程化核糖核蛋白颗粒以改善作物有害生物的口服RNAi递送]”，Frontiers in Physiology[生理学前沿]，8(256)，doi：10.3389/fphys.2017.00256)。试剂在实例1和2中描述。根据CPP、RNA或测定的类型，纳米复合物样品以几种方式之一制备。对于使用CPP-FAM或CPP·mRNA进行的基于昆虫细胞的测定，单独使用增加量的CPP(从25μM到100μM，以25μM的增量)，或将其与20μg mRNA在水中混合，并在细胞处理前在25℃孵育15分钟。添加到细胞中的反应体积为6.38μL CPP和6.38μL mRNA。通过细胞内明显的荧光信号量评估最终最佳CPP浓度。对于使用CPP-YFP·Cy3-dsRNA或CPP·dsRNA的基于昆虫细胞的测定，首先是在含有90mg·mL

实例4：昆虫细胞对CPP的摄取

培养以下代表重要模式生物或农业有害生物系统发育顺序的昆虫细胞以评估摄取CPP的能力：Schneider 2(S2)，来自晚期黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)胚胎(双翅目：果蝇科)；IPLB-Sf21AE衍生物(Sf9)，来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢(秋粘虫-FAW，鳞翅目：夜蛾科)；IPLB-DU182A(DU182A)，来自Diabrotica undecimpunctata胚胎(南方玉米根虫-SCR，鞘翅目：叶甲科)；DvWL2，来自十一星黄瓜甲虫(Diabroticavirgifera virgifera)中肠(西部玉米根虫-WCR，鞘翅目：叶甲科)。使用标准试剂和方案培养细胞：Schneider昆虫培养基(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯市，密苏里州)中的S2，该培养基含10％Gibco

昆虫细胞对CPP的暴露条件因CPP的类型和可用性、荧光信号的可检测性和特定细胞考虑因素而异。通常，将含有细胞的板离心浓缩，去除细胞培养基，并将细胞培养基中的200μL CPP溶液应用于每个孔。将细胞在25℃避光条件下暴露4小时(BAPC1)或约25分钟(所有其他CPP)。然后用培养基洗涤细胞一次，并在成像前使其在最佳条件下恢复过夜。在一到两个24孔细胞培养板中，对每种细胞类型和CPP组合进行四到六个重复，一个重复等于一个孔。对照处理包括暴露于缓冲液而非CPP的细胞。通过使用SDR

为了对细胞成像，将大约50-75μL细胞分配到Fisherbrand

实例5：CPP介导的mRNA货物向昆虫细胞的递送

如实例4中所述培养昆虫细胞并用于评估CPP递送mRNA货物的能力。CPP·mRNA复合物的形成在实例3中进行了描述。试剂和供应、细胞处理条件、恢复时间、处理、成像准备和成像如实例4中所述，除了用于荧光数据收集的波长专门包括：mCherry在532激发，激光功率为30％，发射波长为551-800nm。对照处理包括暴露于仅缓冲液的细胞，以及暴露于与用于形成CPP·mRNA复合物的相同数量的未经标记的CPP或单独的mRNA。基于对细胞内荧光信号的检测以及仅缓冲液、仅CPP或仅mRNA处理的细胞中荧光信号的缺乏，使用测试的CPP和昆虫细胞系观察了来自CPP递送的mRNA的荧光蛋白的翻译。通过显微镜观察从昆虫细胞内CPP递送的mRNA翻译的荧光蛋白的检测。昆虫细胞(SF9、DU182A、DvWL2)暴露于CPP·mRNA复合物。如实例4和5所述进行暴露和成像；使用由75μM的三种不同的未经标记的CPP(MPG、多节-1、CyLoP)和10μg mCherry mRNA形成的复合物获得的结果通过显微镜目视确认。mRNA翻译成功能性荧光蛋白在每种细胞类型中发生过夜，由点状洋红色点表示。洋红色点在相应的阴性对照处理中不可见-显示了代表性的阴性对照图像。

这些结果表明，CPP不仅可以携带mRNA等核酸货物进入昆虫细胞，而且这些货物可以具有功能活性。CPP的细胞内化被认为是通过内吞作用发生的；如果在昆虫中是这样的，则要看到正确折叠的蛋白质的翻译可能需要将mRNA货物从内吞囊泡释放到细胞质中。

实例6：dsRNA经CPP介导增强摄取进入昆虫细胞

如实例4中所述培养昆虫细胞并用于评估CPP增加递送的dsRNA货物量的能力。CPP·Cy3-dsRNA复合物的形成在实例3中进行了描述。试剂和供应、细胞处理条件、恢复时间、处理、成像准备和成像通常如实例4中所述，但有两个例外。细胞暴露于单独Cy3-dsRNA或CPP·Cy3-dsRNA复合物的时间量是变化的，用于荧光数据收集的波长包括：YFP激发波长为488nm，激光功率为15％，发射波长为493-778nm；Cy3激发波长为532nm，激光功率为25％，发射波长为537-758nm。对照处理包括仅暴露于以下单独组分的细胞：缓冲液、Cy3-dsRNA、Cy3-siRNA或CPP。在这些对照处理中使用与用于形成CPP·dsRNA复合物的相同量的Cy3-dsRNA或CPP(或Cy3-siRNA dsRNA等效物)。根据细胞内的荧光信号量，与仅用dsRNA处理的细胞相比，用CPP·dsRNA复合物处理的细胞中观察到更高量的Cy3。在仅缓冲液、仅Cy3-dsRNA、仅Cy3-siRNA或仅CPP处理的细胞中观察到YFP或Cy3的荧光信号很低或没有。使用显微镜完成了在CPP存在下昆虫细胞增加的荧光dsRNA内化的可视化。昆虫细胞(S2)暴露于CPP·Cy3-RNA复合物。如实例4和6所述进行暴露和成像；使用在针对测试的特定CPP和Cy3-dsRNA最佳的条件下形成的复合物获得的结果通过显微镜得到证实。显示两个图像/处理，通过显微镜观察。8.8×10

昆虫细胞可以在没有转染剂或其他辅助分子存在的情况下摄取裸dsRNA。这些结果表明，与裸核酸相比，CPP可以在给定浓度或一定时间内介导增加量的核酸货物进入昆虫细胞。

实例7：WCR整体中CPP的口服毒性筛选

如前所述并进行一些修改，将未经标记的CPP或阳性对照肽掺入人工昆虫饮食中用于筛选针对西方玉米根虫(WCR)幼虫的毒性筛选(Zhao，J.-Z.等人(2016)“mCry3A-selected western corn rootworm(Coleoptera：Chrysomelidae)colony exhibits highresistance and has reduced binding of mCry3A to midgut tissue[mCry3A-选择的西部玉米根虫(鞘翅目：叶甲科)集落表现出高抗性，并且降低了mCry3A与中肠组织的结合]”J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]109，1369-1377，doi：10.1093/jee/tow049)。简而言之，CPP以96孔微量滴定板的形式被掺入标准的WCR人工饮食中。将给药溶液的25μL等分试样与75μL熔融低熔点WCR饮食组合，并在定轨摇床上振荡混合。饮食中的最终CPP或阳性对照肽浓度为0到200ppm，如表5所示。一旦饮食凝固，将预处理的一龄期WCR(在转移到测试饮食之前置于中性饮食中24小时的刚孵化的昆虫)以1只昆虫·孔

实例8：dsRNA经CPP介导增强摄取进入昆虫细胞

如实例4中所述培养昆虫细胞并用于评估CPP增加递送的dsRNA货物量的能力。CPP：Cy3-dsRNA复合物的形成在实例3中进行了描述。试剂和供应、细胞处理条件、恢复时间、处理、成像准备和成像通常如实例4中所述。用于荧光数据收集的波长包括：Cy3激发波长为532nm，激光功率为25％，发射波长为537-758nm。对照处理包括仅暴露于以下单独组分的细胞：缓冲液、Cy3-dsRNA、Cy3-siRNA或CPP。在这些对照处理中使用与用于形成CPP：dsRNA复合物的相同量的Cy3-dsRNA或CPP(或Cy3-siRNA dsRNA等效物)。根据细胞内的荧光信号量，与仅用dsRNA处理的细胞相比，用CPP：dsRNA复合物处理的细胞中观察到更高量的Cy3。在仅缓冲液、仅Cy3-dsRNA、仅Cy3-siRNA或仅CPP处理的细胞中观察到荧光信号很低或没有。昆虫细胞可以在没有转染剂或其他辅助分子存在的情况下摄取裸dsRNA。在CPP存在下昆虫细胞增加的荧光dsRNA内化的可视化。昆虫细胞(SF9)暴露于CPP：Cy3-RNA复合物4小时。如实例4和8所述进行暴露和成像；使用在针对测试的特定CPP和Cy3-dsRNA最佳的条件下形成的复合物获得的结果通过显微镜获得。通过显微镜研究获得两个图像/处理。如实例3中所述，在细胞应用之前立即以5的N/P比率组装使用5.9μg BAPC1和100ng Cy3-dsRNA的复合反应。在使用前类似地制备仅有dsRNA和仅有siRNA的对照处理，但不含BAPC1。与在相同Cy3-dsRNA剂量下用单独Cy3-dsRNA处理相同时间量的细胞相比，在用CPP：Cy3-dsRNA处理的细胞中看到经标记的dsRNA的内化增加，如通过显微镜观察的红色点状点的存在和强度所表示的。在相应的单组分处理中看不到红点。这些结果表明，与裸核酸相比，CPP可以在给定浓度或一定时间内促进增加量的核酸货物进入昆虫细胞。

实例9：CPP对易感鞘翅目昆虫生物测定中dsRNA活性的影响

本实例说明了针对CPP增强的dsRNA活性测定对外部引入的dsRNA易感的鞘翅目昆虫。制备了靶向鞘翅目生命周期所必需的一个或多个基因的双链RNA。在一系列dsRNA剂量和CPP∶dsRNA比率范围内制备由裸dsRNA或与经荧光标记的或未经标记的CPP复合的dsRNA构成的处理。复合的CPP：dsRNA与糖组合以促进进食，并用食用色素染色。然后通过液滴将处理物喂给饥饿的一龄期鞘翅目昆虫，持续不同的时间长度，之后，根据一个或多个靶基因的作用，将通过幼虫体内可见的食物颜色被鉴定为已经进食的幼虫转移至标准的人工饮食并正常饲养，直到达到适当的测定终点。记录基于基因靶标的活性测量值，诸如死亡、发育迟缓或对易感的鞘翅目有害生物的繁殖影响，并用于确定CPP在给定剂量、复合物组成和暴露时间下增强dsRNA的有效性。RT-qPCR、RNA印迹、蛋白质印迹或酶活性测定等分子和生化方法也可用于确认一个或多个转录物和/或一个或多个蛋白质的敲低。结果表明，包含细胞穿透肽和抑制昆虫生长的RNA分子的RNA复合物。

实例10：CPP对抗性鞘翅目昆虫生物测定中dsRNA活性的影响

本实例说明了针对CPP增强的dsRNA活性测定对外部引入的dsRNA有抗性的鞘翅目昆虫。制备了靶向鞘翅目生命周期所必需的一个或多个基因的双链RNA。在一系列dsRNA剂量和CPP：dsRNA比率范围内制备由裸dsRNA或与经荧光标记的或未经标记的CPP复合的dsRNA构成的处理，与糖组合以促进进食，并用食用色素染色。然后通过液滴将处理物喂给饥饿的一龄期鞘翅目昆虫，持续不同的时间长度，之后，根据一个或多个靶基因的作用，将通过幼虫体内可见的食物颜色被鉴定为已经进食的幼虫转移至标准的人工饮食并正常饲养，直到达到适当的测定终点。记录基于基因靶标的活性测量值，诸如死亡、发育迟缓或对抗性鞘翅目有害生物的繁殖影响，并用于确定CPP在给定剂量、复合物组成和暴露时间下增强dsRNA的有效性。RT-qPCR、RNA印迹、蛋白质印迹或酶活性测定等分子和生化方法也可用于确认一个或多个转录物和/或一个或多个蛋白质的敲低。

实例11：CPP对鳞翅目昆虫生物测定中dsRNA活性的影响

本实例说明了针对CPP增强的dsRNA活性测定对外部引入的dsRNA有抗性的鳞翅目昆虫。制备了靶向鳞翅目生命周期所必需的一个或多个基因的双链RNA。在一系列dsRNA剂量和CPP：dsRNA比率范围内制备由裸dsRNA或与经荧光标记的或未经标记的CPP复合的dsRNA构成的处理，与糖组合以促进进食，并用食用色素染色。然后通过液滴将处理物喂给饥饿的一龄期鳞翅目昆虫，持续不同的时间长度，之后，根据一个或多个靶基因的作用，将通过幼虫体内可见的食物颜色被鉴定为已经进食的幼虫转移至标准的人工饮食并正常饲养，直到达到适当的测定终点。记录基于基因靶标的活性测量值，诸如死亡、发育迟缓或对抗性鳞翅目有害生物的繁殖影响，并用于确定CPP在给定剂量、复合物组成和暴露时间下增强dsRNA的有效性。RT-qPCR、RNA印迹、蛋白质印迹或酶活性测定等分子和生化方法也可用于确认一个或多个转录物和/或一个或多个蛋白质的敲低。

虽然本公开可能易于进行各种修改和替代形式，但是本文已经通过例示的方式详细描述了特定实施例。然而，应当理解，本公开并不旨在限于所公开的特定形式。而是，本公开将覆盖落入如由以下所附权利要求及其合法等同物所定义的本公开的范围内的所有修改、等同物和替代物。

                         序列表

<110>  先锋良种国际有限公司（Pioneer Hi-Bred International Inc）

       Samuel, Pon

       Thilges, Katherine

       Mendez, Edwin

       Davis-Vogel, Courtney

<120>  昆虫细胞内细胞穿透肽介导的RNA转导

<130>  8540-US-PSP

<160>  70

<170>  PatentIn 3.5版

<210>  1

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  BAPC1（例如，BAP tofect细胞穿透肽

<400>  1

Phe Leu Ile Val Ile Lys Lys Lys Lys Lys

1               5                   10

<210>  2

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽（CPP）

<400>  2

Lys Gln Ile Asn Asn Trp Phe Ile Asn Gln Arg Lys Arg His Trp Lys

1               5                   10                  15

<210>  3

<211>  19

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽γ玉米醇溶蛋白

<400>  3

Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Leu Val Arg Pro

1               5                   10                  15

Pro Pro Leu

<210>  4

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽CyLoP

<400>  4

Cys Arg Trp Arg Trp Lys Cys Cys Lys Lys

1               5                   10

<210>  5

<211>  27

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽MPG v2

<400>  5

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1               5                   10                  15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val

            20                  25

<210>  6

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  6

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1               5

<210>  7

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  7

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg

1               5                   10                  15

Arg Arg

<210>  8

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  8

Ala Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1               5

<210>  9

<211>  35

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  9

Leu Lys Arg Trp Gly Thr Ile Lys Lys Ser Lys Ala Ile Asn Val Leu

1               5                   10                  15

Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn Arg

            20                  25                  30

Arg Arg Arg

        35

<210>  10

<211>  28

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  10

Lys Leu Phe Met Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr Ile Pro

1               5                   10                  15

Pro Thr Ala Gly Ile Leu Lys Arg Trp Gly Thr Ile

            20                  25

<210>  11

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  11

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1               5

<210>  12

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  12

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1               5

<210>  13

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  13

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1               5                   10

<210>  14

<211>  13

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  14

Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1               5                   10

<210>  15

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  15

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1               5

<210>  16

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  16

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg

1               5                   10                  15

Arg Arg

<210>  17

<211>  11

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  17

Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Tyr Leu

1               5                   10

<210>  18

<211>  22

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  18

Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Tyr Leu Lys Lys Leu Phe Lys

1               5                   10                  15

Lys Ile Leu Lys Tyr Leu

            20

<210>  19

<211>  17

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  19

Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln

1               5                   10                  15

Arg

<210>  20

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  20

khkhkhkhkh khkhkhkh                                                    18

<210>  21

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  21

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

1               5

<210>  22

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  22

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

1               5                   10                  15

Lys Lys

<210>  23

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  23

Arg Gln Ile Lys Ile Phe Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Phe Lys Lys

1               5                   10                  15

<210>  24

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  24

Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser

1               5                   10                  15

<210>  25

<211>  8

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  25

Gly Arg Lys Arg Lys Lys Arg Thr

1               5

<210>  26

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  26

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg

1               5

<210>  27

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  27

Gly Leu Arg Lys Arg Leu Arg Lys Phe Arg Asn Lys Ile Lys Glu Lys

1               5                   10                  15

<210>  28

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  28

Lys Ala Leu Lys Lys Leu Leu Ala Lys Trp Leu Ala Ala Ala Lys Ala

1               5                   10                  15

Leu Leu

<210>  29

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  29

Gln Leu Ala Leu Gln Leu Ala Leu Gln Ala Leu Gln Ala Ala Leu Gln

1               5                   10                  15

Leu Ala

<210>  30

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  30

Leu Lys Thr Leu Ala Thr Ala Leu Thr Lys Leu Ala Lys Thr Leu Thr

1               5                   10                  15

Thr Leu

<210>  31

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  31

Arg Ala Trp Met Arg Trp Tyr Ser Pro Thr Thr Arg Arg Tyr Gly

1               5                   10                  15

<210>  32

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  32

Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His

1               5                   10                  15

Ser Lys

<210>  33

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  33

Arg Gln Ile Arg Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Arg Trp Arg Arg

1               5                   10                  15

<210>  34

<211>  22

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  34

Met Val Thr Val Leu Phe Arg Arg Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly

1               5                   10                  15

Pro Pro Arg Val Arg Val

            20

<210>  35

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  35

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1               5                   10                  15

<210>  36

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  36

Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro

1               5                   10                  15

Pro Pro

<210>  37

<211>  14

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  37

Leu Leu Leu Phe Leu Leu Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Tyr

1               5                   10

<210>  38

<211>  23

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  38

Ser Tyr Phe Ile Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Phe Pro Tyr Phe Phe

1               5                   10                  15

Thr Asp Val Arg Val Ala Ala

            20

<210>  39

<211>  17

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  39

Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg

1               5                   10                  15

Lys

<210>  40

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  40

Ile Ala Ala Arg Ile Lys Leu Arg Ser Arg Gln His Ile Lys Leu Arg

1               5                   10                  15

His Leu

<210>  41

<211>  23

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  41

Ser Tyr Asp Asp Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Phe Pro Tyr Phe Phe

1               5                   10                  15

Thr Asp Val Arg Val Ala Ala

            20

<210>  42

<211>  26

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  42

Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu Ala

1               5                   10                  15

Leu His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala

            20                  25

<210>  43

<211>  20

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  43

Gly Leu Phe Lys Ala Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Leu Trp Lys Leu

1               5                   10                  15

Leu Leu Lys Ala

            20

<210>  44

<211>  27

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  44

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1               5                   10                  15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

            20                  25

<210>  45

<211>  40

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  45

Gly Leu Phe Lys Ala Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Leu Trp Lys Leu

1               5                   10                  15

Leu Leu Lys Ala Gly Leu Phe Lys Ala Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser

            20                  25                  30

Leu Trp Lys Leu Leu Leu Lys Ala

        35                  40

<210>  46

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  46

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1               5                   10                  15

<210>  47

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  47

Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1               5                   10                  15

<210>  48

<211>  13

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  48

Lys Met Asp Cys Arg Trp Arg Trp Lys Cys Cys Lys Lys

1               5                   10

<210>  49

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  49

Met Asp Cys Arg Trp Arg Trp Lys Cys Cys Lys Lys

1               5                   10

<210>  50

<211>  14

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  50

Lys Cys Gly Cys Arg Trp Arg Trp Lys Cys Gly Cys Lys Lys

1               5                   10

<210>  51

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  51

Cys Arg Trp Arg Trp Lys Cys Cys Lys Lys

1               5                   10

<210>  52

<211>  22

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  52

Thr Lys Arg Arg Ile Thr Pro Lys Asp Val Ile Asp Val Arg Ser Val

1               5                   10                  15

Thr Thr Glu Ile Asn Thr

            20

<210>  53

<211>  26

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  53

Ala Glu Lys Val Asp Pro Val Lys Leu Asn Leu Thr Leu Ser Ala Ala

1               5                   10                  15

Ala Glu Ala Leu Thr Gly Leu Gly Asp Lys

            20                  25

<210>  54

<211>  22

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  54

Thr Lys Arg Arg Ile Thr Pro Lys Asp Val Ile Asp Val Arg Ser Val

1               5                   10                  15

Thr Thr Lys Ile Asn Thr

            20

<210>  55

<211>  22

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  55

Met Val Arg Arg Phe Leu Val Thr Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly

1               5                   10                  15

Pro Pro Arg Val Arg Val

            20

<210>  56

<211>  25

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  56

Gly Thr Lys Met Ile Phe Val Gly Ile Lys Lys Lys Glu Glu Arg Ala

1               5                   10                  15

Asp Leu Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Ala

            20                  25

<210>  57

<211>  22

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  57

Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro

1               5                   10                  15

Val Ser Cys Ile Lys Arg

            20

<210>  58

<211>  13

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  58

Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Lys Arg Lys Lys Arg Thr

1               5                   10

<210>  59

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  59

Phe Leu Gly Lys Lys Phe Lys Lys Tyr Phe Leu Gln Leu Leu Lys

1               5                   10                  15

<210>  60

<211>  23

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  60

Phe Leu Ile Phe Ile Arg Val Ile Cys Ile Val Ile Ala Lys Leu Lys

1               5                   10                  15

Ala Asn Leu Met Cys Lys Thr

            20

<210>  61

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  61

Tyr Ile Val Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Val Asn Thr Lys Arg Ser

1               5                   10                  15

<210>  62

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  62

Lys Thr Val Leu Leu Arg Lys Leu Leu Lys Leu Leu Val Arg Lys Ile

1               5                   10                  15

<210>  63

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  63

Leu Leu Lys Lys Arg Lys Val Val Arg Leu Ile Lys Phe Leu Leu Lys

1               5                   10                  15

<210>  64

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  64

Lys Lys Ile Cys Thr Arg Lys Pro Arg Phe Met Ser Ala Trp Ala Gln

1               5                   10                  15

<210>  65

<211>  23

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  细胞穿透肽

<400>  65

Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Trp Gly Lys Ala Phe

1               5                   10                  15

Val Gly Gln Ile Met Asn Cys

            20

<210>  66

<211>  14

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  BAPC1（例如，BAP tofect细胞穿透肽

<400>  66

Phe Leu Ile Val Ile Gly Ser Ile Ile Lys Lys Lys Lys Lys

1               5                   10

<210>  67

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  dvssj1标记的siRNA有义链

<400>  67

uccuugauau ccgguucggu a                                                21

<210>  68

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  dvssj1标记的siRNA反义探针

<400>  68

aggaacuaua ggccaagcca u                                                21

<210>  69

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  dvssj1标记的frag1 dsRNA正向引物

<400>  69

ataataagtt cgatttttta cgaaaatg                                         28

<210>  70

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  dvssj1标记的frag1 dsRNA反向引物

<400>  70

tacgaatacg ccggaagc                                                    18