与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记及应用。

背景技术

栽培烟草中的蔗糖酯是其叶片表面化学主要成分之一，也是烟草中重要的潜在致香前体物质，其主要是蔗糖四酯，降解后可产生小分子挥发性脂肪酸并可极大地提高烟叶的香气品质。

研究表明，栽培烟草中的蔗糖四酯依据分子量的大小不同，可分为6种类型，即，I型烟草蔗糖酯～VI型烟草蔗糖酯；进一步依据是否含有酯化的3-甲基戊酸基团(即，3-甲基戊酰)，可将6种类型的蔗糖四酯分为I、II型不含3-甲基戊酰的蔗糖酯(SE)和III型～VI型含有3-甲基戊酰的蔗糖酯(BMVSE)(Vontimitta V,Danehower D A,Steede T,Moon H S,Lewis R S,Analysis of a Nicotiana tabacum L.genomic region controlling twoleaf surface chemistry traits.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58:294-300.)。不同栽培烟草类型中蔗糖四酯的结构类型和含量存在较大差异，烤烟、白肋烟和马里兰烟中含有I型和II型烟草蔗糖酯(SE)，不含或含有痕量的BMVSE；而香料烟和雪茄烟则刚好相反，含有BMVSE，不含或含有痕量的SE。

栽培烟草中的蔗糖酯经硅烷化气相色谱质谱(GC-MS)进一步解析后，依据葡萄糖环部分特征碎片离子大小又可将两种不含3-甲基戊酰的蔗糖酯(SE)分为SE443(I型烟草蔗糖酯)和SE457(II型烟草蔗糖酯)，此2种类型烟草蔗糖酯也是培育含高蔗糖酯而具有高香气品质烤烟新品种的核心关注点。

但是，现有技术往往错误的将原本分别属于SE443(I型)、SE457(II型)、BMVSE471(III型)、BMVSE485(IV型)、BMVSE499(V型)和BMVSE513(VI型)六个不同独立基因视作一个基因(而且统一命名为BMVSE)进行遗传定位研究(Vontimitta V,Danehower D A,SteedeT,Moon H S,Lewis R S,Analysis of a Nicotiana tabacum L.genomic regioncontrolling two leaf surface chemistry traits.Journal of Agricultural andFood Chemistry,2010,58:294-300.)。故此，获得的定位结果是错误的。导致远未达到分子标记辅助选择(MAS)100％精准要求。

比如，BMVSE基因被定位于SSR标记PT30354和PT52061、PT61362之间约5.2cM区域内，且与SSR标记PT30209和PT20315呈共分离(Vontimitta V,Danehower D A,Steede T,Moon H S,Lewis R S,Analysis of a Nicotiana tabacum L.genomic regioncontrolling two leaf surface chemistry traits.Journal of Agricultural andFood Chemistry,2010,58:294-300.)。但利用上述5个SSR标记对不同遗传背景的烟草材料及192份重组自交系群体进行BMVSE筛选验证，结果表明仅2个标记(PT20135和PT30354)可使用，且该2个可用标记的基因型与BMVSE表型的一致率仅约92.165％(陈彪，陈铭，李洋洋，屈亚芳，程立锐，杨爱国，胡日生，刘旦，罗成刚，向世鹏，冯全福，常爱霞，烟草糖酯SSR分子标记筛选及辅助育种应用.中国烟草科学,2019,40(3):8-15.)，远未达到用于分子标记辅助选择要求的100％一致率。主要原因为：文献的作者错误的将原本分别属于六个不同独立基因(I～VI型)视作一个基因。此外，针对含有3-甲基戊酰的蔗糖酯(BMVSE)已有研究报道，并进行了相应的专利，如III型烟草蔗糖酯BMVSE471(ZL 2021 1 1346741.1)、IV型烟草蔗糖酯BMVSE485(ZL 2021 1 1363676.3)和V型烟草蔗糖酯BMVSE499(申请号202111394234.5)三种类型烟草糖脂基因已被分别定位并获得可用于指导烟草高香气品质育种的两侧紧密连锁标记。但迄今，尚未见到针对2种不含3-甲基戊酰的烟草蔗糖酯(SE；I型蔗糖酯SE443和II型蔗糖酯SE457)的研究报道。

鉴于此，本发明首先将栽培烟草中的蔗糖四酯进行是否含3-甲基戊酰区分，即，不含3-甲基戊酰基团的I～II型烟草蔗糖酯(SE)与含3-甲基戊酰基团的III～VI型烟草蔗糖酯(BMVSE)；其次，以优质多抗雪茄烟品种Beinhart1000-1(含BMVSE，不含SE)和烤烟品种红花大金元(含SE，不含BMVSE)为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建一个含有341份株系的烟草重组自交系(RILs_F

因此，首次将不含3-甲基戊酰的SE中包含的SE443(I型)和SE457(II型)2种类型烟草蔗糖酯进行区分与遗传定位研究，既有效的填补了国内外关于SE443(I型)和SE457(II型)定位分析的空白，又可精准获得与其中某一独立基因(qSE443或qSE457)紧密连锁的共显性SSR标记，是精准、高效利用分子标记辅助选择(MAS)培育含高蔗糖酯而具有高香气品质烤烟新品种的重要途径。

发明内容

本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记及应用。

本发明的第一目的在于提供一种与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记；第二目的在于将上述共显性SSR标记应用于检测烟草基因组DNA中是否存在I型烟草蔗糖酯基因qSE443及待测植株中的I型烟草蔗糖酯的基因型状态。

本发明的创新点：本发明首次针对不含3-甲基戊酰的I型烟草蔗糖酯基因qSE443进行遗传与定位分析；发现了现有技术中的一个重大错误认识。

本发明人发现，文献中将I～VI型烟草蔗糖酯混为一个基因(BMVSE)进行定位是不准确的，甚至是错误的，应该在上述六种类型烟草蔗糖酯中具体选择一种类型才能精确定位。现有技术的这个错误或不足，严重地制约了利用与I、II型烟草蔗糖酯基因(qSE443和qSE457)紧密连锁标记开展高香气烟草新品种的选育进程。

本发明人的研究表明，I型和II型烟草蔗糖酯(SE)属于典型的数量性状，且受烤烟类型品种红花大金元基因组内不同染色体的QTLs控制，这些基因/QTLs被暂命名为qSE443和qSE457。

本发明采用如下技术方案实现。

一种与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记，本发明所述的与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TMc42465和TMc42467，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

SEQ ID No.1：

AAATGGCGATTGGTGGAGTCAATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTATTATTCTGTTTTCCGGATTACGCCTAATATAAAAAGTTATTTGTTGATATAGGTCAATGATATTGTATCAAGTCTTTCTAATGTATGCACATTGCACAGAATATAAACTCATATTTTTAAAATTTGATAACTGATAATGGTTGTGCCAACCCCTGGTTTCACTACATCTCCCACTGTTTTGAGGCT。

SEQ ID No.2：

AAATGGCGATTGGTGGAGTCAATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTATTATTCTGTTTTCCGGATTACGCCTAATATAAAAAGTTATTTGTTGATATAGGTCAATGATATTGTATCAAGTCTTTCTAATGTATGCACATTGCACAGAATATAAACTCATATTTTTAAAATTTGATAACTGATAATGGTTGTGCCAACCCCTGGTTTCACTACATCTCCCACTGTTTTGAGGCT。

SEQ ID No.3：

CAACTGCTGAGATTCGATTACGTGTATATACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGATTAAAAAAGTCACCATCTATCGATAAATATTTGTCTCTAAACCCAGTTATTATTGTACGCTAACTTAAGGTTACAATAAAATCTATAAAATTCAAATTTGGAATCCAATTCTGCTTACTAACGGCCTTAGTCCGGTCAAAAAGACA。

SEQ ID No.4：

CAACTGCTGAGATTCGATTACGTGTATATACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGATTAAAAAAGTCACCATCTATCGATAAATATTTGTCTCTAAACCCAGTTATTATTGTACGCTAACTTAAGGTTACAATAAAATCTATAAAATTCAAATTTGGAATCCAATTCTGCTTACTAACGGCCTTAGTCCGGTCAAAAAGACA。

本发明所述共显性标记TMc42465和TMc42467位于目的基因qSE443两侧。

本发明所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：

扩增TMc42465的引物序列为：

TMc42465F：5’-AAATGGCGATTGGTGGAGT-3’(SEQ ID NO.5)，

TMc42465R：5’-AGCCTCAAAACAGTGGGAGA-3’(SEQ ID NO.6)；

扩增TMc42467的引物序列为：

TMc42467F：5’-CAACTGCTGAGATTCGATTACG-3’(SEQ ID NO.7)，

TMc42467R：5’-TGTCTTTTTGACCGGACTAAGG-3’(SEQ ID NO.8)。

上述的与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记的应用在于检测烟草基因组DNA中是否存在I型烟草蔗糖酯基因qSE443及待测植株中的I型烟草蔗糖酯的基因型状态。

本发明上述的应用，该应用的方法为，以TMc42465和TMc42467序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物。

本发明PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列则表明该待测烟草植株含有高香气品质的I型烟草蔗糖酯的纯合等位基因，基因型为SE443 SE443。

本发明PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示序列则为待测烟草植株不含有高香气品质的I型烟草蔗糖酯的纯合等位基因，基因型为se443 se443。

本发明PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.4所示序列，或同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示序列则为待测烟草植株含有高香气品质的I型烟草蔗糖酯的杂合等位基因，基因型为SE443 se443。

为了简捷高效选择具有高香气品质潜力的I型烟草蔗糖酯烟草品种，本发明有针对性并特异性地选择含I型烟草蔗糖酯基因qSE443的后代材料，可用于I型烟草蔗糖酯基因qSE443的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及高香气烟草品种选育的效率。利用本发明提供的2个与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记，不仅可用于定性检测任何生育期的烟草基因组DNA中是否存在I型烟草蔗糖酯基因qSE443，还可以清晰鉴别待测植株中的I型烟草蔗糖酯的基因型状态(即，具有最高含量值且稳定遗传的纯合基因型SE443 SE443、具有中等含量值且遗传不能稳定的杂合基因型SE443 se443、不含或含痕量值且稳定遗传的纯合基因型se443 se443)，进而既提高了具有高香气品质烤烟新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1、填补了国内外关于不含3-甲基戊酰的I型烟草蔗糖酯基因qSE443遗传与定位研究的空白。

2、纠正了现有技术的错误

本发明有效纠正并弥补了文献中将六种不同类型烟草蔗糖酯基因视作一个基因(BMVSE)的错误与不足，同时也可精准的鉴别具有I型烟草蔗糖酯的基因型。

3、检测I型烟草蔗糖酯准确度高

提供了用于检测I型烟草蔗糖酯基因qSE443的分子标记，可精准确定待测烟草中是否含有I型烟草蔗糖酯，与现有技术检测烟草蔗糖酯含量的方法相比，本方法的检测准确度更高。

4、检测方法高效、稳定、可靠，且操作简捷和低成本

与现有的采用低通量、高成本、耗时费力的GC-MS法检测成熟期烟草蔗糖酯含量相比，本发明所述的共显性SSR标记具有高效、稳定、可靠、简捷和低成本的特点。

5、不限检测时机

本方法可在烟草生长的任何时期进行检测，极大的缩短了实验周期，进而加速了选育高香气品质烤烟新品种进程。

下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

附图说明

图1是基于烟草重组自交系群体(RILs_F

其中，利用软件为：QTL IciMapping v4.2；参数设置：定位方法为ICIM-ADD：Inclusive Composite Interval Mapping of ADDitive(and dominant)QTL，迭代次数为1000(Permutation times＝1000)，显著性为0.01(Significance＝0.01)，步长为0.5cM(Walk speed＝0.5cM)。横坐标为遗传距离(单位：厘摩cM)；纵坐标为LOD值。图中的横向虚线是在0.01显著性阈值下的LOD值＝3.3806；LOD曲线最高点为主效基因(qSE443)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照相关产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明所述的与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TMc42465和TMc42467，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：

扩增TMc42465的引物序列为：

TMc42465F：5’-AAATGGCGATTGGTGGAGT-3’，

TMc42465R：5’-AGCCTCAAAACAGTGGGAGA-3’；

扩增TMc42467的引物序列为：

TMc42467F：5’-CAACTGCTGAGATTCGATTACG-3’，

TMc42467R：5’-TGTCTTTTTGACCGGACTAAGG-3’。

本发明所述的与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记的应用为所述的与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在I型烟草蔗糖酯基因qSE443中的应用。

所述的与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记的应用是分别以TMc42465序列的引物和TMc42467序列的引物扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示序列即为该烟草植株含有I型烟草蔗糖酯的纯合等位基因qSE443 qSE443；如果PCR扩增产物中同时含有如SEQID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列则为待测烟草植株不含I型烟草蔗糖酯的纯合等位基因qse443qse443；如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示序列，或含有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列所示序列即为待测烟草植株中含有I型烟草蔗糖酯的杂合基因qSE443 qse443。

实施例1与I型烟草蔗糖酯基因qSE443连锁的共显性SSR标记的筛选

采用数量性状连锁分析(QTL)法并结合硅烷化气相色谱质谱(GC-MS)法，在烟草全基因组范围内筛选与I型烟草蔗糖酯基因qSE443连锁的共显性SSR标记

一、实验材料

以综合性状优良且含I型烟草蔗糖酯的烤烟品种红花大金元为母本，以不含I型烟草蔗糖酯的雪茄烟品种Beinhart1000-1为父本，经杂交、连续自交，获得341份株系的重组自交系(RILs_F

二、亲本及RILs_F

试验材料成苗后移栽至大田，待大田烟叶成熟时(采烤前)，每个株系随机选10株，且每株烟草选取3片中部叶片；将上述每个株系的30片中部叶片叠在一起，利用直径1cm的打孔器在叶片中部位置随机打2个孔，获得60个直径1cm的圆形叶片。

将获得的60个圆形小叶片按照文献(蔡莉莉，谢复炜，刘克建，张映，谢剑平，香料烟中蔗糖酯的气相色谱/质谱分析.烟草科技,2009,3:40-44.王瑞玲，王莹莹，毛多斌，贾春晓，烟草中蔗糖四酯类化合物的GC-MS分析.化学研究与应用,2011,23(8):1030-1035.)报道的方法，进行烟草蔗糖酯含量检测。

经GC-MS法检测获得的341份RILs_F

三、SSR标记分析

烟草基因组DNA提取：采用常规CTAB法或植物组织DNA提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。

PCR扩增及电泳检测：PCR扩增体系是常规的体系可参照已发表的文献，其中，本发明所提供的标记退火温度均为60℃；PCR扩增程序信息可参照相关文献；电泳检测也是采用常规的方法，可参照已发表的相关文献。

利用本实验室分别基于烤烟红花大金元和雪茄烟Beinhart1000-1基因组信息开发的约50000个SSR标记，对RILs_F

再利用筛选获得2093个多态SSR标记，对341份RILs_F

其次，利用遗传连锁作图软件JoinMap 4.0对341份RILs_F

四、I型烟草蔗糖酯(qSE443)的全基因组QTL定位分析

利用QTL定位分析软件QTL IciMapping v4.2对RILs_F

其中，相关参数设置为：定位方法选ICIM-ADD：Inclusive Composite IntervalMapping of ADDitive(and dominant)QTL，迭代次数为1000(Permutation times＝1000)，显著性为0.01(Significance＝0.01)，步长为0.5cM(Walk speed＝0.5cM)。

最后，在全基因组范围内的LOD＝3.3806条件下，位于第12号连锁群的81.50cM处定位获得I型烟草蔗糖酯性状的1个主效QTL(暂时命名为qSE443)。该主效QTL可解释约15.3934％的表型变异率，且此时的LOD值约为24.4767，详见图1和表1。

表1I型烟草蔗糖酯QTL(qSE443)信息统计

注：PVE为QTL的效应值，即，该QTL可解释表型变异百分比；Add为加性效应。

实施例2共显性连锁标记在RILs_F

利用获得的与I型烟草蔗糖酯基因qSE443两侧紧密连锁的共显性SSR标记TMc42465和TMc42467，对苗期的RILs_F

另一方面，待RILs_F

最后，分析341份RILs_F

具体的分析方法为：通过GC-MS检测获得的各株系I型烟草蔗糖酯含量高于或等于烤烟类型亲本红花大金元含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如SEQ ID NO.1(267bp)和SEQ ID NO.3(224bp)所示序列即为纯合基因型SE443 SE443；

检测获得的各株系I型烟草蔗糖酯含量等于或低于雪茄烟类型亲本Beinhart1000-1含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如ID NO.2(255bp)和SEQ ID NO:4(234bp)所示序列即为纯合基因型se443 se443；

而当检测获得的各株系I型烟草蔗糖酯含量介于烤烟类型亲本红花大金元与雪茄烟类型亲本Beinhart1000-1之间，也即与子一代(F

实验结论：以上结果表明，共显性标记TMc42465和TMc42467分别与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁，且该两个标记位于目的基因(qSE443)两侧。

利用上述两个共显性紧密连锁SSR标记，不仅可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草任何生育期的I型烟草蔗糖酯含量的检测，而且也可清晰鉴别待测植株中的I型烟草蔗糖酯的基因型状态(即，具有最高含量值且稳定遗传的纯合基因型SE443 SE443、具有中等含量值且遗传不能稳定的杂合基因型SE443 se443、不含或含痕量值且稳定遗传的纯合基因型se443se443)，进而既提高了具有高香气品质烤烟新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。

以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述(包括但不仅限于简写、缩写、本领域惯用的单位)。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。