一种具有护肝功能的动物肝肽及其制备方法

技术领域

本发明属于提取制备技术领域，具体涉及一种具有护肝功能的动物肝肽及其制备方法。

背景技术

中国食品工业协会《2022年中国食品工业经济运行报告》中公开了2022年中国肉制品的生产总量为3632.5万吨，而一般肝脏占动物体重的1%～3%，也就意味着每年动物肝脏的产量约为36~109万吨。动物肝脏作为一种重要的副产物，其是一种营养极其丰富的食品蛋白源，可以作为多肽的良好来源。

有研究给部分肝脏切除的小鼠口服牛肝水解物，结果发现肝细胞增殖信号鸟氨酸脱羧酶的含量显著提高，且小鼠肝重的增加与口服剂量呈线性关系，这表明牛肝脏水解物可以促进大鼠的肝脏再生

基于动物肝肽的不同效果，动物肝肽的制备方法研究越来也就越来越广。目前动物肝肽的制备方法主要有酶解法、分离提取法、化学合成法、基因重组法及微生物发酵法。其中酶解法因其工艺设备成熟，被广泛用于小分子肽的生产中，但是酶解法得到的产物存在产物有苦味等问题。如中国专利CN116726140 A公开了一种解酒护肝的鲨肝肽复配产品及其应用的方法，该方法通过木瓜蛋白酶水解鲨鱼肝脏来制备鲨肝肽，但它的酶解产物具有苦味，影响产品的风味和消费者的接受程度。

中国专利CN115181775A公开了一种小分子肝肽的提取方法，该提取方法包括初步酶解，二次酶解、三次酶解、灭酶、分离纯化、浓缩干冻步骤。该专利采用小麦羧肽酶能够将疏水胺基酸释放，直接在二次酶解时进行脱苦，并且引入能够掩盖苦味的谷氨酸。但该方法步骤繁琐，操作麻烦。

[1] Fukuda Y, Sawata M, Washizuka M, et al. Effect of liverhydrolysate on hepatic proliferation in regenerating rat liver][J]. Nihonyakurigaku zasshi. Folia pharmacologica Japonica, 1999, 114(4): 233-238。

[2] 傅颖, 梅松, 来伟旗, 等. 新生牛肝提取物生物学活性分析[J]. 医学研究杂志, 2007(07): 95-97。

发明内容

为此，为解决上述技术问题，本发明提供了一种具有护肝功能的动物肝肽的制备方法，该方法包括酶解和发酵步骤，方法简便，适合工业化生产；且该方法可得到分子量＜1KDa的含量较高的分子肽段，并且该肽段具有很好的抗氧化能力和保护化学性肝损伤的作用。

本发明的技术方案为：

一种具有护肝功能的动物肝肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将新鲜肝脏洗净，剥离结缔组织，搅拌成肝肉糜，加入纯净水，搅拌均匀制成肝脏组织匀浆；（2）将所述肝脏组织匀浆调节pH至6.0-7.0，加入脂肪酶和糖原磷酸化酶后，在室温下酶解20-50min得到酶解液；（3）将所述酶解液在80-90℃条件下灭菌30-60min，得到灭菌液；（4）将所述灭菌液冷却至室温，加入发酵菌粉液，在温度30-40℃下发酵30-53h得到发酵液，将发酵液离心去除残渣得到上层清液；（5）用分子量为3kDa、2KD、1kDa的串联超滤膜对离心后的上层清液进行超滤分级分离，得到不同分子质量段的多肽液；

其中所述发酵菌粉液由发酵菌粉和纯净水按照1:10的比例组成，发酵菌粉包括动物双歧杆菌乳亚种、卷曲乳杆菌和枯草芽孢杆菌，其重量比依次为（1-3）：（2-5）：（2-6）。

优选的，所述新鲜肝脏和脂肪酶的重量比（100-200）：1；所述新鲜肝脏和糖原磷酸化酶的重量比为（40-150）：1。

进一步优选的，所述脂肪酶的酶活为3-6万U/g，所述糖原磷酸化酶的酶活为4-8万U/g。

优选的，所述动物双歧杆菌乳亚种的菌活为1000-3000亿CFU/g，卷曲乳杆菌的菌活为500-2000亿CFU/g，枯草芽孢杆菌的菌活为2000-4000亿CFU/g。

进一步优选的，所述新鲜肝脏和发酵菌粉的重量比为（70-180）：1。

更进一步优选的，步骤（1）中新鲜肝脏和纯净水的总量比为1：（4-7）。

优选的，步骤（1）中新鲜动物肝脏为猪或牛肝脏中的一种。

优选的，步骤（2）中采用柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液调节pH。

优选的，还包括将步骤（6）得到的多肽冷冻干燥得到动物肝肽粉的步骤。

一种动物肝肽，采用上述制备方法得到。

1.本发明提供的具有护肝功能的动物肝肽的制备方法，采用先酶解后发酵的步骤，其中脂肪酶可以将动物肝脏中的脂肪水解为脂肪酸、甘油三酯；糖原磷酸化酶可以将肝糖原水解为葡萄糖，为后续菌种的发酵过程提供营养，不需要额外的添加营养物质。另外肝脏中含有大量的蛋白质，而氨基酸是构成蛋白质的基本单位，两个氨基酸就可以形成肽。在肝脏制备肝脏多肽的过程中，蛋白酶是常见的主要酶制剂，而本申请中使用的是脂肪酶和糖原磷酸化酶进行酶解，并未使用蛋白酶，是因为申请人发现动物双歧杆菌乳亚种、卷曲乳杆菌和枯草芽孢杆菌协同配合发酵可产生大量的分解蛋白的物质，实现了蛋白的分解，且同时进一步实现了肽段的分解，从而得到在＜1KDa的含量较高分子肽段。

2.本发明提供的具有护肝功能的动物肝肽的制备方法，采用先酶解后发酵的工艺，避免了先发酵造成的体系偏酸，需要大量碱性调节剂调节pH以利于酶解的问题，减少了试剂的使用。

3. 本发明供的具有护肝功能的动物肝肽的制备方法，采用发酵法制备动物肝肽，在发酵过程中会生成醇、氨基酸等鲜味物质掩盖小分子肽的苦味。

4. 本发明提供的分子量＜1kDa动物肝肽粉具有很好的抗氧化能力和保护化学性肝损伤的作用。

附图说明

图1 肽标准品量对数与保留时间的标准曲线图

图2 小鼠体重随时间的变化情况图

具体实施方式

为使本发明的目的，技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式做进一步的详细描述。基于本发明公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内文献所描述的常规步骤的操作或条件即可进行。所有试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

以下实施例中，部分产品的来源信息如下：

新鲜牛肝购自本地超市；脂肪酶购自中诺生物科技发展江苏有限公司，型号：5000U；糖原磷酸化酶购自艾美捷生物科技有限公司，型号为AS09-455；碱性磷酸酶购自沪慧（上海）生物科技有限公司，货号J11939；动物双歧杆菌乳亚种购自均瑶润盈生物科技（上海）有限公司的动物双歧杆菌乳亚种BL-G101，；卷曲乳杆菌购自江苏新申奥生物科技有限公司，编号为LCP 051；枯草芽孢杆菌购买自上海白益生物科技有限公司，货号为BY-BC0634的冻干粉；鼠李糖乳酪杆菌购自山东中科嘉亿生物工程有限公司的鼠李糖乳杆菌JYLR-005。

实施例1

本实施例提供了一种牛肝肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）将100g新鲜的牛肝洗净，剥离结缔组织，用绞肉机搅拌成肝肉糜，加入560mL纯净水，搅拌均匀后制成组织匀浆。

（2）向步骤1得到的动物肝脏匀浆中加入柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液调节pH至7.0，随后加入0.6g酶活力5万U/g的脂肪酶，1.0g酶活力5万U/g的糖原磷酸化酶，在室温下酶解30 min得到酶解液。

（3）将上述酶解液在90℃的条件下水浴加热保持30min，得到灭菌液。

（4）将上述灭菌液冷却至室温，向灭菌液中加入发酵菌粉液，在35℃的条件下发酵48h，得到发酵液。其中发酵菌粉液由0.6g发酵菌粉和6.0g纯净水组成、发酵菌粉由0.2g动物双歧杆菌乳亚种、0.2g卷曲乳杆菌、0.2g枯草芽孢杆菌组成。双歧杆菌乳亚种的酶活力为2000亿CFU/g、卷曲乳杆菌的酶活力为1000亿CFU/g、枯草芽孢杆菌的酶活力为2000亿CFU/g。

（5）将发酵液在8000×g的条件下离心10 min，去除残渣收集上层清液。

（6）用分子量为3kDa、2KD、1kDa的串联超滤膜对离心后的上层清液进行超滤分级分离，得到不同分子质量段的多肽液。

实施例2

本实施例提供了一种牛肝肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）将100g新鲜的牛肝洗净，剥离结缔组织，用绞肉机搅拌成肝肉糜，加入400mL纯净水，搅拌均匀后制成组织匀浆。

（2）向步骤1得到的动物肝脏匀浆中加入柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液调节pH至7.0，随后加入0.5g酶活力5万U/g的脂肪酶，0.7g酶活力5万U/g的糖原磷酸化酶，在室温下酶解20 min得到酶解液。

（3）将上述酶解液在80℃的条件下水浴加热保持60min，得到灭菌液。

（4）将上述灭菌液冷却至室温，向灭菌液中加入发酵菌粉液，在40℃的条件下发酵30h，得到发酵液。其中发酵菌粉液由0.8g发酵菌粉和8.0g纯净水组成、发酵菌粉由0.1g动物双歧杆菌乳亚种、0.5g卷曲乳杆菌、0.2g枯草芽孢杆菌组成。双歧杆菌乳亚种的酶活力为2000亿CFU/g、卷曲乳杆菌的酶活力为1000亿CFU/g、枯草芽孢杆菌的酶活力为2000亿CFU/g。

（5）将发酵液在8000×g的条件下离心10 min，去除残渣收集上层清液。

（6）用分子量为3kDa、2KD、1kDa的串联超滤膜对离心后的上层清液进行超滤分级分离，得到不同分子质量段的多肽液。

实施例3

本实施例提供了一种牛肝肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）将100g新鲜的牛肝洗净，剥离结缔组织，用绞肉机搅拌成肝肉糜，加入700mL纯净水，搅拌均匀后制成组织匀浆。

（2）向步骤1得到的动物肝脏匀浆中加入柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液调节pH至7.0，随后加入0.9g酶活力5万U/g的脂肪酶，1.5g酶活力5万U/g的糖原磷酸化酶，在室温下酶解40 min得到酶解液。

（3）将上述酶解液在90℃的条件下水浴加热保持40min，得到灭菌液。

（4）将上述灭菌液冷却至室温，向灭菌液中加入发酵菌粉液，在30℃的条件下发酵53h，得到发酵液。其中发酵菌粉液由1.2g发酵菌粉和12.0g纯净水组成、发酵菌粉由0.3g动物双歧杆菌乳亚种、0.3g卷曲乳杆菌、0.6g枯草芽孢杆菌组成。双歧杆菌乳亚种的酶活力为2000亿CFU/g、卷曲乳杆菌的酶活力为1000亿CFU/g、枯草芽孢杆菌的酶活力为2000亿CFU/g。

（5）将发酵液在8000×g的条件下离心10 min，去除残渣收集上层清液。

（6）用分子量为3kDa、2KD、1kDa的串联超滤膜对离心后的上层清液进行超滤分级分离，得到不同分子质量段的多肽液。

实施例4

本实施例提供了一种牛肝肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）将100g新鲜的牛肝洗净，剥离结缔组织，用绞肉机搅拌成肝肉糜，加入600mL纯净水，搅拌均匀后制成组织匀浆。

（2）向步骤1得到的动物肝脏匀浆中加入柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液调节pH至7.0，随后加入0.8g酶活力5万U/g的脂肪酶，2.1g酶活力5万U/g的糖原磷酸化酶，在室温下酶解30 min得到酶解液。

（3）将上述酶解液在85℃的条件下水浴加热保持50min，得到灭菌液。

（4）将上述灭菌液冷却至室温，向灭菌液中加入发酵菌粉液，在35℃的条件下发酵48h，得到发酵液。其中发酵菌粉液由1.1g发酵菌粉和11.0g纯净水组成、发酵菌粉由0.2g动物双歧杆菌乳亚种、0.4g卷曲乳杆菌、0.5g枯草芽孢杆菌组成。双歧杆菌乳亚种的酶活力为2000亿CFU/g、卷曲乳杆菌的酶活力为1000亿CFU/g、枯草芽孢杆菌的酶活力为2000亿CFU/g。

（5）将发酵液在8000×g的条件下离心10 min，去除残渣收集上层清液。

（6）用分子量为3kDa、2KD、1kDa的串联超滤膜对离心后的上层清液进行超滤分级分离，得到不同分子质量段的多肽液。

实施例5

本实施例提供了一种猪肝肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）将100g新鲜的猪肝洗净，剥离结缔组织，用绞肉机搅拌成肝肉糜，加入550mL纯净水，搅拌均匀后制成组织匀浆。

（2）向步骤1得到的动物肝脏匀浆中加入柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液调节pH至7.0，随后加入0.7g酶活力5万U/g的脂肪酶，1.2g酶活力5万U/g的糖原磷酸化酶，在室温下酶解35 min得到酶解液。

（3）将上述酶解液在90℃的条件下水浴加热保持40min，得到灭菌液。

（4）将上述灭菌液冷却至室温，向灭菌液中加入发酵菌粉液，在35℃的条件下发酵48h，得到发酵液。其中发酵菌粉液由1.0g发酵菌粉和10.0g纯净水组成、发酵菌粉由0.3g动物双歧杆菌乳亚种、0.4g卷曲乳杆菌、0.3g枯草芽孢杆菌组成。双歧杆菌乳亚种的酶活力为2000亿CFU/g、卷曲乳杆菌的酶活力为1000亿CFU/g、枯草芽孢杆菌的酶活力为2000亿CFU/g。

（5）将发酵液在8000×g的条件下离心10 min，去除残渣收集上层清液。

（6）用分子量为3kDa、2KD、1kDa的串联超滤膜对离心后的上层清液进行超滤分级分离，得到不同分子质量段的多肽液。

对比例1

本对比例提供了一种牛肝肽的制备方法，其同实施例1得到区别在于，步骤（2）中仅包括脂肪酶，其余同实施例1相同。

具体为：（2）向步骤1得到动物肝脏匀浆中加入柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液调节pH至7.0，随后加入1.6g酶活力5万U/g的脂肪酶，在室温下酶解30 min得到酶解液。

对比例2

本对比例提供了一种牛肝肽的制备方法，其同实施例1得到区别在于，步骤（2）中仅包括糖原磷酸化酶，其余同实施例1相同。

具体为：（2）向步骤1得到动物肝脏匀浆中加入柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液调节pH至7.0，随后加入1.6g酶活力5万U/g的糖原磷酸化酶，在室温下酶解30 min得到酶解液。

对比例3

本对比例提供了一种牛肝肽的制备方法，其同实施例1得到区别在于，步骤（2）中包括脂肪酶和碱性磷酸酶，其余同实施例1相同。

具体为：（2）向步骤1得到动物肝脏匀浆中柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液调节pH至7.0，随后加入0.6g酶活力5万U/g的脂肪酶，1.0g酶活力5万U/g的碱性磷酸酶，在室温下酶解30 min得到酶解液。

对比例4

本对比例提供了一种牛肝肽的制备方法，其同实施例1得到区别在于，步骤（4）中菌株不同，其余同实施例1相同。

具体为：（4）将上述灭菌液冷却至室温，向灭菌液中加入发酵菌粉液，在35℃的条件下发酵48h，得到发酵液。其中发酵菌粉液由0.6g发酵菌粉和6.0g纯净水组成、发酵菌粉由0.6g动物双歧杆菌乳亚种组成。动物双歧杆菌乳亚种的酶活力为2000亿CFU/g。

对比例5

本对比例提供了一种牛肝肽的制备方法，其同实施例1得到区别在于，步骤（4）中菌株不同，其余同实施例1相同。

具体为：（4）将上述灭菌液冷却至室温，向灭菌液中加入发酵菌粉液，在35℃的条件下发酵48h，得到发酵液。其中发酵菌粉液由0.6g发酵菌粉和6.0g纯净水组成、发酵菌粉由0.6g卷曲乳杆菌组成。卷曲乳杆菌的酶活力为1000亿CFU/g。

对比例6

本对比例提供了一种牛肝肽的制备方法，其同实施例1得到区别在于，步骤（4）中菌株不同，其余同实施例1相同。

具体为：（4）将上述灭菌液冷却至室温，向灭菌液中加入发酵菌粉液，在35℃的条件下发酵48h，得到发酵液。其中发酵菌粉液由0.6g发酵菌粉和6.0g纯净水组成、发酵菌粉由0.6g枯草芽孢杆菌组成。枯草芽孢杆菌的酶活力为2000亿CFU/g。

对比例7

本对比例提供了一种牛肝肽的制备方法，其同实施例1的区别在于，步骤（4）中菌株不同，其余同实施例1相同。

具体为：（4）将上述灭菌液冷却至室温，向灭菌液中加入发酵菌粉液，在35℃的条件下发酵48h，得到发酵液。其中发酵菌粉液由0.6g发酵菌粉和6.0g纯净水组成、发酵菌粉由0.2g鼠李糖乳杆菌、0.2g卷曲乳杆菌、0.2g枯草芽孢杆菌组成。鼠李糖乳杆菌的酶活力为2000亿CFU/g、卷曲乳杆菌的酶活力为1000亿CFU/g、枯草芽孢杆菌的酶活力为2000亿CFU/g。

对比例8

本对比例提供了一种牛肝肽的制备方法，其同实施例1得到区别在于，先发酵后酶解，具体如下：

（1）将100g新鲜的牛肝洗净，剥离结缔组织，用绞肉机搅拌成肝肉糜，加入560mL纯净水，搅拌均匀后制成组织匀浆。

（2）将上述组织匀浆在90℃的条件下水浴加热保持30min，得到灭菌液。

（3）将上述灭菌液冷却至室温，向灭菌液中加入发酵菌粉液，在35℃的条件下发酵48h，得到发酵液。其中发酵菌粉液由0.6g发酵菌粉和6.0g纯净水组成、发酵菌粉由0.2g动物双歧杆菌乳亚种、0.2g卷曲乳杆菌、0.2g枯草芽孢杆菌组成。双歧杆菌乳亚种的酶活力为2000亿CFU/g、卷曲乳杆菌的酶活力为1000亿CFU/g、枯草芽孢杆菌的酶活力为2000亿CFU/g。

（4）向步骤3得到的发酵液加入柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液调节pH至7.0，随后加入0.6g酶活力5万U/g的脂肪酶，1.0g酶活力5万U/g的糖原磷酸化酶，，在室温下酶解30 min得到酶解液。

（5）将酶解液在8000×g的条件下离心10 min，去除残渣收集上层清液。

（6）用分子量为3kDa、2KD、1kDa的串联超滤膜对离心后的上层清液进行超滤分级分离，得到不同分子质量段的多肽液。

对比例9

本对比例提供了一种牛肝肽的制备方法，其同实施例1得到区别在于，只有发酵，具体如下：

（1）将100g新鲜的牛肝洗净，剥离结缔组织，用绞肉机搅拌成肝肉糜，加入560mL纯净水，搅拌均匀后制成组织匀浆。

（2）将上述组织匀浆在90℃的条件下水浴加热保持30min，得到灭菌液。

（3）将上述灭菌液冷却至室温，向灭菌液中加入发酵菌粉液，在35℃的条件下发酵48h，得到发酵液。其中发酵菌粉液由0.6g发酵菌粉和6.0g纯净水组成、发酵菌粉由0.2g动物双歧杆菌乳亚种、0.2g卷曲乳杆菌、0.2g枯草芽孢杆菌组成。双歧杆菌乳亚种的酶活力为2000亿CFU/g、卷曲乳杆菌的酶活力为1000亿CFUU/g、枯草芽孢杆菌的酶活力为2000亿CFUU/g。

（4）将发酵液在8000×g的条件下离心10 min，去除残渣收集上层清液。

（5）用分子量为3kDa、2KD、1kDa的串联超滤膜对离心后的上层清液进行超滤分级分离，得到不同分子质量段的多肽液。

对比例10

本对比例提供了一种牛肝肽的制备方法，其同实施例1得到区别在于，只有酶解，具体如下：

（1）将100g新鲜的牛肝洗净，剥离结缔组织，用绞肉机搅拌成肝肉糜，加入560mL纯净水，搅拌均匀后制成组织匀浆。

（2）向步骤1得到的动物肝脏匀浆中柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液调节pH至7.0，随后加入0.6g酶活力5万U/g的脂肪酶，1.0g酶活力5万U/g的糖原磷酸化酶，，在室温下酶解30min得到酶解液。

（3）将酶解液在8000×g的条件下离心10 min，去除残渣收集上层清液。

（4）用分子量为3kDa、2KD、1kDa的串联超滤膜对离心后的上层清液进行超滤分级分离，得到不同分子质量段的多肽液。

实验例1：牛肝肽分子量分布实验

具体如下：

色谱条件：采用高效液相色谱仪（配紫外检测器和 Empower 工作站 GPC 软件）。色谱柱：TSK G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流动相：乙腈/水/三氟乙酸（40:60:0.05，V/V/V）；柱温：30 ℃；流速：0.5 mL/min；进样量：10μL；波长：220 nm；标准品：抑肽酶(Mw=6500Da)、胰岛素（分子量5808Da）、杆菌酶(Mw=1422Da)、四肽(甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸，Mw=451Da)、三肽 (三甘氨酸，Mw=190Da)。

通过高效液相色谱确定标准品的保留时间，得到标准品的色谱流出曲线图，以肽标准品分子量的对数(lg Mw)对其保留时间作图，经线性拟合得到肽标准品分子量对数值与其保留时间的标准曲线方程：lg(Mw)=-0.16641t+6.64795(R

测试样品：实施例1-4及对比例1-10得到的上层清液冷冻干燥后，取0.05g样品用流动相溶解，转移至10mL的容量瓶中超声提取30min后定容，8000×g高速离心10min，上层清液用0.22μm的滤膜过滤，参照上述色谱条件进行高效液相色谱分析，每个样品平行测定三次。

其中根据图1中肽标准品的保留时间为判断点，对各实施例、对比例的动物肝肽的分子量分布进行分析；利用峰面积归一化法分析各实施例、对比例动物肝肽中M

数据分析：试验数据 使 用Excel和SPSS 19.0软件统计分析，结果记为“平均值±标准偏差”，采用 Decan检验进行显著性分析，p<0.05为具有显著性差异，注：表格同列中凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，同列凡具有不同标记字母的即为差异显著(p<0.05)。

表1：不同实施例及对比例得到的动物肝肽的分子量分布

结果分析：

（1）由表1可知，实施例1-4组得到的动物肝肽分子量小于1kDa的组分比例明显高于对比例1-10，表明本发明提供的动物肝肽的制备方法，可以显著提高分子量小于1kDa的组分比例。

（2）针对分子量小于1kDa的组分比例进行显著性分析，其中对比例1-3同实施例1比较具有显著性差异，说明酶解过程酶制剂的选择对于得到的肝肽的分子量比例有着影响，而本申请中的脂肪酶和糖原磷酸化酶为较优的选择。

（3）针对分子量小于1kDa的组分比例进行显著性分析，对比例4-7组同实施例1比较具有显著性差异。这意味着菌株的选择对发酵过程有着重要影响，进而影响得到的肝肽中分子量小于1kDa的组分比例，而本申请中动物双歧杆菌乳亚种、卷曲乳杆菌和枯草芽孢杆菌为最优的组合。

（4）针对分子量小于1kDa的组分比例进行显著性分析，对比例6组同对比例4和5相比，得到的动物肝肽分子量小于1kDa的组分比例明显提高，这说明枯草芽孢杆菌在发酵过程中起到主要的作用要优于动物双歧杆菌乳亚种和卷曲乳杆菌。

（5）针对分子量小于1kDa的组分比例进行显著性分析，对比例8-10同实施例1相比具有显著性差异。这说明，酶解和发酵均为必须的步骤，且只有先酶解，后发酵才能得到较高含量的分子量小于1kDa的组分。

实验例2：牛肝肽的体外抗氧化能力评价

对实施例1得到的＞3kDa、2-3kDa、1-2 kDa和＜1kDa 4个肽段的分子多肽液冻干干燥后，分别进行自由基清除试验。DPPH自由基清除能力是评价物质抗氧化活性的常用方法。本研究采用半抑制浓度（IC

实验方法：

（1）取0.4g DPPH溶解于50mL乙醇中，配制成20mM的DPPH试剂，避光保存。（2）用无水乙醇将不同分子量的牛肝肽冻干粉配制成10mg/mL浓度牛肝肽的溶液。（3）准确移取 100µL不同浓度的牛肝肽样品溶液与 100 µL DPPH溶液于96孔板上混合，室温反应 30 min后，于 517 nm 测吸光值（A

式中：A

结果分析：

试验结果见表2，Mw小于1kDa的小分子牛肽的DPPH清除效果最好，接下来用Mw小于1kDa的小分子牛肽来做对化学性肝损伤的保护作用试验。

表2

注：表格每一列中凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著。

实验例3 ：牛肝肽对化学性肝损伤的保护作用

1. 试验样品：选用实施例1-4制备的小于1kDa、1~2kDa、 2~3kDa和大于3kDa组分的动物肝肽冻干粉和实施例2-4组小于1kDa组分的动物肝肽冻干粉。

2. 试验动物与分组：18~22 g的成年小鼠90只，适应性喂养1周后，随机分为9组，每组10只。试验设置正常对照组、急性化学性肝损伤模型对照组、阳性对照组（水飞蓟组）和牛肝肽干预组，包括牛肝肽实施例1组（高、中、低3个剂量组）、牛肝肽实施例2高剂量组、牛肝肽实施例3高剂量组、牛肝肽实施例4高剂量组。

3. 剂量设置：

牛肝肽干预组：样品以人体推荐量的5倍为低剂量组，10倍为中剂量组，30倍为高剂量组，即牛肝肽干预组，低剂量为 400 mg/kg中剂量为 800 mg/kg，高剂量为 2400 mg/kg；阳性药组：灌胃水飞蓟素，水飞蓟素用量设置为140mg/kg；空白对照组：给与等体积的蒸馏水；模型对照组：给与等体积的蒸馏水。

4. 试验方法：

每日经口灌胃牛肝肽溶液，空白对照组和模型对照组给予蒸馏水，连续灌胃 30天。小鼠采用标准饲养环境，自由饮食饮水，每天观察动物摄食和饮水、活动和一般情况，每隔3天称重 1 次，以调整受试样品剂量。 急性化学性肝损伤模型于试验第 30天进行，除空白对照组给与等量蒸馏水，其余小鼠一次灌胃14mL/kg的 50%分析纯乙醇，禁食16 小时处死动物，进行各项指标的检测。

5. 检测指标：

5.1 小鼠体重指标监测

试验期间小鼠活动正常，给与牛肝肽灌胃后无不良反应出现，如图2所示，各组小鼠在试验期间体重变化都整体呈现增长趋势，在第31天，各组试验小鼠体重都有降低，且第31天时各组间没有显著差异（P>0.05），这说明小鼠体重下降 的原因是由禁食，而不是酒精灌胃的原因。

5.2 肝匀浆组织丙二醛（MDA）、甘油三酯（TG）、还原型谷胱甘肽（GSH）测定

取0.2g 小鼠肝脏组织，用生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，以20000rpm匀浆10s，间歇30s，反复进行3 次，制成5%组织匀浆（W/V），3000rpm离心5～10min，取上清液待测。通过保健食品功能检验与评价方法（2023年版）中《对化学性肝损伤有辅助保护作用检验方法》测定小鼠肝脏中MDA、TG、GSH的含量。

6. 数据分析

试验数据 使 用Excel和SPSS 19.0软件统计分析，结果记为“平均值±标准偏差”，采用 Decan检验进行显著性分析，p<0.05为具有显著性差异，结果见表3。其中表格同列中凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，同列凡具有不同标记字母的即为差异显著(p<0.05)。

表3 各组试验小鼠血清中GSH、MDA、TG活力测定结果

结果分析：

当给各组小鼠灌胃酒精以后，模型组小鼠肝脏中氧化还原的关键酶 GSH 水平显著下降，相应地，肝脏中脂质过氧化产物 MDA 和 TG 水平显著升高，这说明肝脏中氧化还原反应和脂代谢失衡，导致脂质过氧化产物MDA和TG增加。

实施例1分子量<1kDa低剂量组、中剂量和高剂量组中比较可知，小鼠肝脏中 GSH的水平显著增加，且改善效果呈剂量依赖性，并且牛肝肽各剂量组小鼠肝脏中 MDA 和 TG的积累显著减少，说明本发明制备得到的肝肽能有效缓解饮酒造成的肝脏氧化还原反应异常和脂质代谢异常。

实施例1组分子量<1kDa高剂量组、实施例1分子量1~2kDa高剂量、实施例1<2~3kDa高剂量和实施例1分子量>3kDa高剂量比较可知，实施例1组分子量<1kDa高剂量组肝脏MDA水平、TG水平显著低于其他组，而GSH水平高于其他组，表明牛肝肽对肝脏的保护作用与分子量的分布有关，分子量越低，牛肝肽对肝脏的保护作用越好。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。