一种复合多肽的多功能止血修复海绵及其制备方法

技术领域

本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及一种具有伤口止血、抗炎及修复功能的多孔海绵制剂及其制备方法。

背景技术

伤口治疗是医学领域的一个重要方向。在创伤和外科手术等伤口处理中，止血修复材料具有广泛的应用。传统的止血材料往往只具备单一功能，且无法满足不同伤口的多方面需求。因此，开发一种具有多功能的止血修复材料具有重要的实际意义。

目前，一些具有多功能的止血修复材料已经被开发出来。例如，一些含有生物活性物质(如生长因子、抗菌药物等)的材料已经被应用于伤口治疗。此外，一些含有多种成分的材料也被用于伤口治疗中。然而，这些材料仍然存在一些问题，如生物相容性和稳定性差、成分无法控制等。因此，需要开发一种具有良好生物相容性和稳定性的多功能止血修复材料。

海绵制剂是一种常见的止血修复材料。它具有大量的孔隙结构，可与体液等液体相互作用。因此，海绵制剂具有较高的组织相容性和生物活性，可用于伤口治疗。然而，传统的海绵制剂仍然存在一些问题，如孔隙结构不稳定、未能充分利用孔隙结构等。

因此，开发一种具有良好生物相容性和稳定性的多孔海绵制剂，具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种多功能止血修复海绵及其制备方法，该海绵具有快速止血、抗炎及修复等功能，可广泛应用于伤口处理。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种多功能多孔止血修复海绵，所述海绵包括：

内层：由丝素蛋白和DES-1系列制备而成；中间层：由丝素蛋白和DES-2系列组成；外层：由丝素蛋白和短肽组成；

其中，所述DES-1由传明酸和有机酸制备得到；所述DES-2由精氨酸和有机酸制备得到；所述短肽的序列为KIIK(SEQ NO ID:1)、KKIIKK(SEQ NOID:2)、RRIIRR(SEQ NO ID:3)、KRIIKR(SEQ NO ID:4)、KRIIIIKR(SEQ NOID:5)、KKIIIIKK(SEQ NO ID:6)或RRIIIIRR(SEQ NO ID:7)。

在一种实施方式中，所述内层中，DES-1占丝素蛋白的质量的0.1％～3％，优选为0.5％～2.5％，可以是0.5％、1％、2％或2.5％。

在一种实施方式中，所述中间层中，DES-2占丝素蛋白的质量的0.1％～6％，优选为1％～5％，可以是1％、2％、3％或5％。

在一种实施方式中，所述外层中，短肽占丝素蛋白的质量的0.1％～5％，优选为0.5％～3％，可以是0.5％、2％或3％。

在一种实施方式中，所述内层、中间层、外层中丝素蛋白的质量比为1:2～4:2～6

在一种实施方式中，所述DES-1是按照传明酸和有机酸的摩尔比1:1-5:1制备得到，其中，所述有机酸包括苹果酸、柠檬酸、酒石酸、扁桃酸中任一种或几种，按照摩尔比1:1～5:1分别称量有机酸和传明酸溶于溶剂中，置于惰性氛围下30-80℃搅拌反应6-24h，除去多余溶剂，透析纯化得到DES-1。优选的，所述溶剂为水。

在一种实施方式中，所述DES-2是按照精氨酸和有机酸的摩尔比为1:1-5:1制备得到，有机酸包括但不限于甘草酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸等的任一种，按照摩尔比1:1～2分别称量有机酸和精氨酸溶于溶剂中，置于惰性氛围下30-80℃搅拌反应6-24h，除去多余溶剂，透析纯化得到DES-1。优选的，所述溶剂为水。

在一种实施方式中，所述丝素蛋白可以通过以下方法提取：1、脱胶：1)将25.44g无水Na

在一种实施方式中，所述多功能多孔止血修复海绵：内层由丝素蛋白和DES-1制备而成，具有较大孔径，能够快速止血；中间层由丝素蛋白和DES-2组成，具有较小孔径，能够止血同时具有抗炎功能；外层由丝素蛋白和短肽组成，具有修复功能。

本发明还提供了上述多功能多孔止血修复海绵的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别按照比例制备得到DES-1和DES-2；

(2)根据不同层需求将丝素蛋白分别与DES-1、DES-2、短肽混合，分别得到内层溶液、中间层溶液、外层溶液，溶剂为水；

(3)先经内层溶液冷冻；之后将冷冻后的内层结构放置于中间层溶液下，再次进行冷冻；之后将冷冻得到的结构放置在外层溶液下，进行冷冻；

(4)将步骤(3)得到的冷冻后的多孔结构进行冷冻干燥；

(5)将冷冻干燥后的海绵进行水蒸汽处理即可。

在一种实施方式中，步骤(3)中，所述冷冻优选梯度冷冻：将上述混合溶液进行梯度冷冻，分别包括-80～0℃，处理时间分别是2～72小时。

在一种实施方式中，所述内层溶液、中间层溶液、外层溶液中丝素蛋白的浓度分别为5～20wt％、5～20wt％、5～20wt％。

在一种实施方式中，步骤(3)中，所述冷冻可以是先将内层-20℃、-80℃梯度冷冻，然后在其上层浇筑中间层，-20℃、-80℃下梯度冷冻，然后外层溶液覆盖上层，梯度-20℃、-80℃冷冻。

在一种实施方式中，步骤(4)中，所述冷冻干燥(冷阱-65℃)的时间是48h-96h。

在一种实施方式中，步骤(5)中，所述蒸汽处理是指在50-60℃用水蒸气熏蒸，处理时间为12-72小时。

最后，本发明还提供了包含所述的多功能多孔止血修复海绵的医疗器械。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明所提供的方法可用于制备含有DES的海绵材料，这些材料适用于药物缓释、组织工程和生物医学应用等领域。

(2)本发明采用独特的组成和结构，结合冷冻干燥和蒸汽处理等工艺，形成了多孔的海绵结构。这些工艺能够保持DES的稳定性和活性，并且为海绵材料提供了良好的孔隙结构和生物相容性。

(3)本发明所制备的海绵材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，能够在体内有效地缓释药物，并且促进细胞生长和修复。

附图说明

图1实施例1制备的一种复合短肽的多功能止血修复海绵的实物图。

图2实施例1制备的一种复合短肽的多功能止血修复海绵的微观形貌图。

图3实施例1～2和对比例1～2制备的绵的凝血指数对比图。

图4实施例1制备的一种复合短肽的多功能止血修复海绵的细胞增殖率统计图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步详细阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1：

(1)提取丝素蛋白：丝素蛋白的提取：1、脱胶：1)将25.44g无水Na

DES的制备方法：按照摩尔比1:1分别称量有机酸和碱的粉末溶于样品瓶中，置于氮气氛围下加热(40℃)搅拌6h，使用旋蒸仪蒸干多余水分，透析纯化得到DES。其中，传明酸苹果酸为DES-1，精氨酸甘草酸为DES-2。

(2)内层溶液：将丝素蛋白(6％)与0.5％ DES-1混合均匀，中间层溶液：将丝素蛋白(6％)与2％ DES-2混合均匀，外层溶液：将丝素蛋白(6％)与0.5％的短肽(序列为KKIIIIKK)混合均匀，其中，内层、中间层、外层溶液中丝素蛋白的质量比为1:2:2；

(3)将溶液按照内层、中间层、外层的顺序进行梯度冷冻；梯度冷冻的参数为：内层在4℃冷藏2小时，-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻10小时；中间层在-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻10小时，外层在-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻10小时；

(4)将冷冻后的多孔结构进行冷冻干燥72h；

(5)将冻干后的海绵进行蒸汽处理12小时。

实施例2：

(1)提取丝素蛋白：丝素蛋白的提取：1、脱胶：1)将25.44g无水Na

DES的制备方法：按照摩尔比1:2分别称量有机酸和碱的粉末溶于样品瓶中，置于氮气氛围下加热(50℃)搅拌12h，使用旋蒸仪蒸干多余水分，透析纯化得到DES。有机酸包括：扁桃酸、甘草酸，碱包括传明酸、精氨酸。传明酸扁桃酸为DES-1，精氨酸甘草酸为DES-2。

(2)内层溶液：将丝素蛋白(8％)与1％ DES-1混合均匀，中间层溶液：将丝素蛋白(8％)与3％ DES-2混合均匀，外层溶液：将丝素蛋白(8％)与1％的短肽(序列为RRIIIIRR)混合均匀，其中，内层、中间层、外层溶液中丝素蛋白的质量比为1:2:4；

(3)将溶液按照内层、中间层、外层的顺序进行梯度冷冻；梯度冷冻的参数为：内层在4℃冷藏4小时，-20℃冷冻7小时，-80℃冷冻15小时；中间层在-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻10小时，外层在-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻10小时；

(4)将冷冻后的多孔结构进行冷冻干燥96h；

(5)将冻干后的海绵进行蒸汽处理24小时。

实施例3：

(1)提取丝素蛋白：丝素蛋白的提取：1、脱胶：1)将25.44g无水Na

DES的制备方法：按照摩尔比1:2分别称量有机酸和碱的粉末溶于样品瓶中，置于氮气氛围下加热(60℃)搅拌24h，使用旋蒸仪蒸干多余水分，透析纯化得到DES。有机酸包括：柠檬酸、甘草酸，碱包括传明酸、精氨酸。传明酸柠檬酸为DES-1，精氨酸苹果酸为DES-2。

(2)内层溶液：将丝素蛋白(14％)与2％ DES-1混合均匀，中间层溶液：将丝素蛋白(14％)与4％甘草酸精氨酸DES-2混合均匀，外层溶液：将丝素蛋白(10％)与1.5％的8肽(序列为KKIIIIKK)混合均匀，其中，内层、中间层、外层溶液中丝素蛋白的质量比为1:3:5；

(3)将溶液按照内层、中间层、外层的顺序进行梯度冷冻；梯度冷冻的参数为：内层在4℃冷藏6小时，-20℃冷冻9小时，-80℃冷冻18小时；中间层在-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻10小时，外层在-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻10小时；

(4)将冷冻后的多孔结构进行冷冻干燥72h；

(5)将冻干后的海绵进行蒸汽处理48小时。

实施例4：

(1)提取丝素蛋白：丝素蛋白的提取：1、脱胶：1)将25.44g无水Na

DES的制备方法：按照摩尔比1:2分别称量有机酸和碱的粉末溶于样品瓶中，置于氮气氛围下加热(80℃)搅拌6h，使用旋蒸仪蒸干多余水分，透析纯化得到DES。有机酸包括：柠檬酸、甘草酸，碱包括传明酸、精氨酸。传明酸柠檬酸为DES-1，精氨酸甘草酸为DES-2。

(2)内层溶液：将丝素蛋白(12％)与2.5％传明酸柠檬酸DES-1混合均匀，中间层溶液：将丝素蛋白(10％)与5％精氨酸甘草酸DES-2混合均匀，外层溶液：将丝素蛋白(17％)与2％的短肽(序列为KKIIKK)混合均匀，其中，内层、中间层、外层溶液中丝素蛋白的质量比为1:2:4；

(3)将溶液按照内层、中间层、外层的顺序进行梯度冷冻；梯度冷冻的参数为：内层在4℃冷藏5小时，-20℃冷冻8小时，-80℃冷冻16小时；中间层在-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻16小时，外层在-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻16小时；

(4)将冷冻后的多孔结构进行冷冻干燥72h；

(5)将冻干后的海绵进行蒸汽处理48小时。

本发明所提供的方法可用于制备含有DES的海绵材料，这些材料适用于药物缓释、组织工程和生物医学应用等领域。

对比例1

(1)提取丝素蛋白：丝素蛋白的提取：1、脱胶：1)将25.44g无水Na

(2)将丝素蛋白溶液(6％)在4℃冷藏2小时，-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻10小时；

(3)将冷冻后的多孔结构进行冷冻干燥72h；

(4)将冻干后的海绵进行蒸汽处理48小时。

对比例2

(1)提取丝素蛋白：丝素蛋白的提取：1、脱胶：1)将25.44g无水Na

(2)内层溶液：将丝素蛋白(6％)与2％精氨酸甘草酸DES-2(制备方法同实施例1)混合均匀，外层溶液：将丝素蛋白(6％)与0.5％的短肽(序列为KKIIIIKK)混合均匀，其中，内层、外层溶液中丝素蛋白的质量比为1:1；

(3)将溶液按照内层、外层的顺序进行梯度冷冻；梯度冷冻的参数为：内层在4℃冷藏2小时，-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻10小时；外层在-20℃冷冻5小时，-80℃冷冻10小时；

(4)将冷冻后的多孔结构进行冷冻干燥72h；

(5)将冻干后的海绵进行蒸汽处理12小时。

在本发明的实施例中，我们以丝素蛋白为模板材料，通过与不同配方的DES混合，制备出了六种不同类型的DES海绵材料。这些材料的物理性质和生物活性已在实验室中进行了测试和评估。

测定实施例1～2和对比例1～2得到的海绵材料的凝血指数和吸水率测试。

凝血指数测试(通过血红蛋白溶液的吸光度值来判断其血液凝结速率)结果见图3，其中3M是指3M公司购买的Tegaderm型号的止血海绵，正常组是指未经干预的实验情况。可见，本发明实施例1的止血效果最优，凝血指数在30s时为58％，止血速度更快。实施例2和市售3M的止血海绵水平相当，同样为凝血效果优异的海绵材料，对比例1的止血效果和正常组差异不大，基本上无有效凝血效果，对比例2中DES-2的加入能够有效提高凝血速率，但是仍然不及本发明实施例1～2和3M海绵材料。

图4为修复海绵的浸提液对L929细胞增殖的影响，方法是按照碧云天CCK-8试剂盒的属龙进行，利用酶标仪进行检测。参考标准G/B 16886，结果表明我们制备的修复海绵具有很好的生物安全性。

测定本发明实施例1～2和对比例1～2得到的海绵材料的吸水率，结果见表1。

表1本发明实施例1～2和对比例1～2得到的海绵材料的吸水率

可见，本发明的海绵材料的吸水效果优异且吸水速度快。同样的利用本发明实施例3～4制备得到的海绵材料用于上述测试时，均能取得和实施例1基本上一致的效果。

当实施例1中的短肽KKIIIIKK替换为KIIK、KKIIKK、RRIIRR、KRIIKR、KRIIIIKR或RRIIIIRR时，制备得到的海绵材料的性能和实施例1相差不大。

在本发明的实施例中，我们使用了冷冻干燥和蒸汽处理等工艺，以形成多孔的海绵结构。这些工艺能够保持DES的稳定性和活性，并且为海绵材料提供了良好的孔隙结构和生物相容性。

在实验中，我们发现所制备的海绵材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，能够在体内有效地缓释药物，并且促进细胞生长和修复。这些数据表明，所制备的DES海绵材料具有广泛的应用前景，可以用于药物缓释、组织工程和生物医学应用等领域。

因此，本发明所提供的方法和材料，可以满足人们对高效、稳定和生物相容性的海绵材料的需求，具有重要的工业和医学应用价值。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。