一种包括三白草白叶提取物的用于皮肤美白的组合物

技术领域

本申请要求2021年7月9日提交的韩国专利申请第10-2021-0090492号的优先权，并且其公开内容通过引用全部结合在本申请中。

涉及一种用于皮肤美白的化妆品组合物，用于预防、治疗或改善黑色素过度沉着疾病的药物组合物以及保健功能食品组合物。

背景技术

皮肤上出现的色素沉着，如黄褐斑、雀斑等，都是因表皮中的黑色素增加而引起，并且决定肤色的重要因素也在于黑色素。

皮肤色素形成机制大致可分为黑色素生物合成(melanogenesis)、黑素体输送(melanosome transport)、以及黑素体转移(melanosome transfer)。黑色素生物合成机制是指，在作为黑素细胞(melanocyte)小器官(melanosome)的黑素体中，因酪氨酸酶(tyrosinase)、酪氨酸酶相关蛋白1/2(TRP-1/2，tyrosinase related protein-1/2)的作用而形成黑色素的过程。黑素体输送机制是黑素体连接到微细胞器和肌动蛋白，从而移动到树突末端的过程。最后，黑素体转移机制是指移动到黑素细胞树突末端的黑素体移动到周围扩散的表皮的过程。通过以上三种机制，促进酪氨酸酶在被紫外线激活的黑素细胞中的合成，并促进黑色素生成而向表皮外输送、排出(Jody P.Ebanks，MechanismsRegulating SkinPigmentation：The Rise and Fall of Complexion Coloration，Int JMol Sci.Sep；10(9)：4066-4087，2009)。

肤色取决于黑色素的含量和分布，并且与在细胞内黑素细胞中生成后释放到细胞外的黑素体的数量和分布有关。皮肤的色素沉着过度(hyperpigmentation)可由皮肤炎症反应后的体内荷尔蒙异常、遗传性疾病、紫外线照射等多种因素引起，其主要原因是黑色素合成异常和分布异常。黑色素的主要功能是通过清除氧自由基保护皮肤免受其造成的损伤，黑色素较多表示具有有效的应对系统，可保护皮肤免受物理和化学有毒物质的侵害。

然而，黑色素过度沉着会成为皮肤等病理问题的起因，但也被认为是黄褐斑、雀斑、痣以及老年斑等美容方面的问题。因此，需要研发一种从源头抑制黑色素形成的美白剂。

近期研究结果显示，研发出可抑制黑色素生物合成以及黑素体输送转移过程相关因子的物质也是能够预防皮肤色素沉着的方法(Jong il Park at al.，Inhibitoryeffect of 2-methyl-naphtho[1,2,3-de]quinolin-8-one on melanosome transportand skin pigmentation，Scientific Reports volume 6，Article number：29189，2016)。

因此，需要研发一种可抑制黑色素生物合成以及黑素体转移过程相关因子的新的美白原料。

发明内容

技术问题

提供一种组合物，其包括三白草白叶提取物作为活性成分。

提供一种制备三白草白叶提取物的方法。

提供一种预防或治疗黑色素过度沉着疾病的方法，其包括将包含有效量的三白草白叶提取物的组合物施用于需要其的个体。

提供一种用于制备药剂的三白草白叶提取物的用途，所述药剂用于预防或治疗黑色素过度沉着疾病。

技术方案

一方面提供一种组合物，其包括三白草白叶提取物作为活性成分。

“三白草(Asian lizard's tail，Saururus chinensis)”因叶、根以及花呈白色而被称作三白草。在开花之前，三白草的叶子呈绿色，但花期时为了吸引昆虫变为白色，并在开花后重新变为绿色。据了解，三白草的花期为六月至八月。即，三白草在特定时期才会出现“白叶(white leaf)”。

因此，所述“三白草白叶”是指在三白草开花期间采集的三白草的白色叶子。所述三白草白叶与三白草绿叶在颜色、采集时期等方面存在差异。

术语“提取物”包括通过提取天然物的成分而获得的所有物质，并且与提取方法、提取溶剂、提取条件、提取的成分或提取物的形式无关，并且还包括在提取天然物的成分后可通过其它方法加工或处理后得到的物质。例如，所述加工或处理可包括稀释、浓缩、干燥、纯化、分馏、过滤、发酵、酶处理等。因此，所述提取物可以包括提取液、提取液的稀释液或浓缩液、通过干燥提取液获得的干燥物、或其粗产物或纯化产物、以及分馏其后的级分。

上述提取方法可以使用已知的天然物提取方法，例如热水提取、乙醇提取、加热提取、冷浸提取、回流提取、回流冷却提取、超声波提取、以及亚临界提取等，但不限于此。在一具体实施方式中，所述提取方法可以是热水提取或乙醇提取。

所述提取溶剂可选自水、有机溶剂或其混合物。所述水可以是蒸馏水或纯净水。所述有机溶剂可包括但不限于C1至C6低级醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、二乙醚、甲乙酮以及氯仿中的至少一种。

在一具体实施方式中，所述提取物的提取溶剂可以是水、C1至C4醇、或其混合物。

在另一具体实施方式中，所述提取物的提取溶剂可以是水以及C1至C4醇的混合物。在另一具体实施方式中，所述提取物的提取溶剂可以是乙醇。在另一具体实施方式中，所述提取物的提取溶剂可以为10％(v/v)至90％(v/v)、20％(v/v)至80％

(v/v)、30％(v/v)至70％(v/v)、40％(v/v)至60％(v/v)或50％(v/v)乙醇。因此，所述三白草白叶提取物可以是三白草白叶的热水提取物或者三白草白叶的乙醇提取物。在一实施例中，证实了三白草白叶的乙醇提取物与三白草白叶的热水提取物相比，具有优异的黑色素生成抑制效果和黑色素分泌抑制效果。因此，所述三白草白叶提取物可以是三白草白叶的乙醇提取物。

所述提取条件是指提取天然产物成分的条件，例如提取时间、提取温度等。所述提取时间为30分钟至120小时、30分钟至100小时、30分钟至80小时、30分钟至60小时、30分钟至40小时、30分钟至20小时、30分钟至10小时、2小时至120小时、2小时至100小时，2小时至80小时，2小时至60小时，2小时至40小时，2小时至20小时，或2小时至10小时，但是可根据提取溶剂、提取温度等其它条件适当选择。所述提取温度可以是10℃至150℃、10℃至120℃、10℃至100℃、10℃至80℃、2

0℃至150℃、20℃至120℃、20℃至100℃、20℃至80℃、20℃至60℃、20℃至4

0℃、或常温，但是可根据提取溶剂、提取时间等其它条件适当选择。

所述术语“作为活性成分而包括”是指以能够表现出本说明书中所提及效果的程度来添加三白草白叶提取物，并且其含义包括为了传递和稳定药物而通过添加作为副成分的各种成分后配制成各种形式。

所述包括三白草白叶提取物作为活性成分的组合物可用于皮肤美白，抑制黑色素生成，抑制黑色素分泌，使黑色素减少，抑制黑色素过度沉着，或预防、治疗或改善黑色素过度沉着疾病。

术语“皮肤美白”可以是指通过抑制黑色素合成提亮肤色，并改善由紫外线、激素或遗传引起黄褐斑或雀斑等的皮肤过度沉着。

术语“抑制黑色素生成”可以是指抑制黑色素在细胞等中重新生成。

术语“抑制黑色素分泌”可以是指抑制黑色素在细胞等中分泌。

术语“使黑色素减少”可以是指使原本存在于细胞等中的黑色素含量减少。

术语“黑色素过度沉着”是包括所有由各种原因引起的黑色素过度沉着的广义概念，是指皮肤或手指甲或脚趾甲的特定区域因黑色素过度增加而变得比其它部位暗淡。

所述黑色素过度沉着疾病可以是选自雀斑(freckle)、黄褐斑(melasma)、肝斑(chloasma)、老年斑(liver spot)、母斑(nevus)、日光性黑子(solar lentigo)、黑变病(melanosis)、波伊茨-耶格综合症(peutz-jegher's syndrome)、妊娠黄褐斑(chloasmagravidarum)、使用药物后的色素过度沉着、以及炎症后色素沉着(postinflammatoryhyperpigmentation)中的任一种，但不限于此。

术语“预防”包括抑制疾病的发生。术语“治疗”包括抑制、减轻或消除疾病的发展。术语“改善”可以是指缓和状态或至少减轻治疗相关参数的所有行为，例如，至少减轻症状。

相较于所述三白草绿叶提取物，所述三白草白叶提取物具有高的皮肤美白功效、黑色素生成抑制能力、黑色素分泌抑制能力、使黑色素减少的能力、或黑色素过度沉着抑制能力。

所述三白草白叶提取物可以包括槲皮苷(quercitrin)和阿福豆苷(afzelin)中的任一种或多种。在一实施例中，确认到所述三白草白叶提取物的槲皮苷和阿福豆苷含量显着高于三白草绿叶提取物。

所述组合物可以抑制黑色素的生成或分泌。在一实施例中，确认到所述三白草白叶提取物的黑色素生成抑制效果和黑色素分泌抑制效果比三白草绿叶提取物优异。此外，确认到三白草白叶提取物含有的槲皮苷具有优异的黑色素生成抑制效果和黑色素分泌抑制效果。此外，确认到三白草叶的乙醇提取物与三白草叶的热水提取物相比，具有优异的黑色素生成抑制效果和黑色素分泌抑制效果。

所述组合物可以抑制参与黑素体转移的蛋白酶激活受体-2(protease-activatedreceptor-2，PAR-2)的表达。在一实施例中，确认到所述三白草白叶提取物含有的阿福豆苷抑制参与黑素体转移的PAR-2的表达，因此具有皮肤色素沉着抑制功效。

以整体组合物为计，所述三白草白叶提取物的浓度可以是0.0001μg/ml至0.1μg/ml、0.0001μg/ml至0.05μg/ml、或0.0001μg/ml至0.001μg/ml，但不限于此。所述三白草白叶提取物的浓度可选择未表现出细胞毒性的同时表现出美白功效的适度范围。

以整体组合物为计，所述三白草白叶提取物含有的槲皮苷浓度可以是0.0001μg/ml至100μg/ml、0.0001μg/ml至10μg/ml、0.0001μg/ml至1μg/ml、0.001μg

/ml至100μg/ml、0.001μg/ml至10μg/ml、0.001μg/ml至1μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.01μg/ml至10μg/ml、或0.01μg/ml至1μg/ml，但不限于此。

所述槲皮苷的浓度可选择未表现出细胞毒性的同时表现出美白功效的适度范围。

以整体组合物为计，所述三白草白叶提取物能够以0.0001重量％至20.0重量％、0.00

01重量％至10.0重量％、0.0001重量％至5.0重量％、0.0001重量％至1.0重量％、0.00

1重量％至20.0重量％、0.001重量％至10.0重量％、0.001重量％至5.0重量％、0.001重量％至1.0重量％、0.01重量％至20.0重量％、0.01重量％至10.0重量％、0.01重量％

至5.0重量％、或0.01重量％至1.0重量％包括在其中，但不限于此。所述三白草白叶提取物的含量可选择未表现出细胞毒性的同时表现出美白功效的适度范围。

在一具体实施方式中，所述组合物可以是化妆品组合物。

所述化妆品组合物可用于皮肤美白、抑制黑色素生成，抑制黑色素分泌，使黑色素减少，或抑制黑色素过度沉着。

除本说明书中公开的活性成分之外，所述化妆品组合物可以进一步包括化妆品组合物中常规使用的成分、功能性添加剂等，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、分散剂、增稠剂，防腐剂、维生素、颜料、香料等常规辅助剂，以及化妆品学可接受的载体。

所述化妆品组合物可以被制备为常规制备的任何剂型。例如，所述化妆品组合物可具有爽肤水、面霜、精华液、洁面乳、卸妆水、面膜、安瓿、润肤露、润肤油、

润肤啫喱、洗发水、护发素、润发乳、发用啫喱、粉底、口红、睫毛膏或底妆化妆品剂型。

在一具体实施方式中，所述组合物可以是皮肤外用剂组合物。

所述皮肤外用剂组合物可用于皮肤美白，抑制黑色素生成，抑制黑色素分泌，使黑色素减少，抑制黑色素过度沉着，或预防、治疗或改善黑色素过度沉着疾病。

所述皮肤外用剂可以是乳霜、凝胶、软膏、皮肤乳化剂、皮肤悬浮液、透皮贴剂、药物浸渍绷带、乳液、或其组合。所述皮肤外用剂可以根据需要与常规用于化妆品或药品等皮肤外用剂的成分，例如水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增稠剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、香料、着色剂、各种皮肤营养剂或其组合适度混合。

在一具体实施方式中，所述组合物可以是药物组合物。

所述药物组合物可用于皮肤美白，抑制黑色素生成，抑制黑色素分泌，使黑色素减少，抑制黑色素过度沉着，或预防或治疗黑色素过度沉着疾病。

所述药物组合物可以包括药学上可接受的稀释剂或载体。所述稀释剂可以是乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素或甘露醇，润滑剂可以是硬脂酸镁、滑石粉或其组合。所述载体可以是赋形剂、崩解剂、粘合剂润滑剂、或其组合。所述赋形剂可以是微晶纤维素、乳糖、低取代羟基纤维素，或其组合。所述崩解剂可以是羧甲基纤维素钙、淀粉乙醇酸钠、无水磷酸氢钙、或其组合。所述粘合剂可以是聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素、羟丙基纤维素、或其组合。所述润滑剂可以是硬脂酸镁、二氧化硅、滑石粉、或其组合。

所述药物组合物可被配制为口服或肠胃外施用剂型。口服剂型可以是颗粒剂、粉剂、液体、片剂、胶囊剂、干糖浆剂、或其组合。肠胃外施用剂型可以是注射剂。

在一具体实施方式中，所述组合物可以是保健功能食品组合物。

其可用于皮肤美白，抑制黑色素生成，抑制黑色素分泌，使黑色素减少，抑制黑色素过度沉着，或预防或改善黑色素过度沉着疾病。

所述保健功能食品组合物可以单独使用所述提取物，或可以与其它食品或食品成分一同使用提取物，并且可根据常规方法被适度使用。有效成分的混合量可根据使用目的(预防、健康或治疗性处理)适度确定。所述保健功能食品的种类无特别限制。保健功能食品种类中的饮料组合物可与常规饮料同样地含有各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。所述天然碳水化合物是葡萄糖、果糖等单糖，麦芽糖、蔗糖等双糖，糊精、环糊精等多糖，以及木糖醇、山梨醇、赤藓糖醇等糖醇。甜味剂可以使用索马甜、甜叶菊提取物等天然甜味剂，以及糖精、阿斯巴甜等合成甜味剂。所述保健功能食品组合物可以含有营养素、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂、或其组合。所述保健功能食品组合物可以含有用于生产天然果汁、果汁饮料、蔬菜饮料的果肉、或其组合。

另一方面提供一种制备三白草白叶提取物的方法。

所述方法包括通过温育三白草白叶与提取溶剂获得提取物。

关于所述三白草白叶、提取溶剂以及提取物的详细描述如上所述。

所述温育可在常规的提取条件下进行。关于所述提取条件的详细描述如上所述。

所述方法可以进一步包括过滤和/或干燥所述获得的提取物。所述过滤和干燥可以适用已知的常规方法。

另一方面提供一种预防或治疗黑色素过度沉着疾病的方法，其包括将包含有效量的三白草白叶提取物的组合物施用于需要其的个体。

术语“有效量”是指能够表现出如上效果的有效的量。

术语“施用”、“引入”、以及“移植”可以互换使用，并且可以是指通过将根据一具体实施方式的组合物至少部分定位到所需部位的方法或途径，将根据一具体实施方式的组合物施用到个体中。

可根据所属领域已知的方法进行施用。可通过例如静脉内、肌肉内、口服、透皮(transdermal)、粘膜(intranasal)、鼻内(intratracheal)、气管内或皮下施用等路径，以任意方式直接施用于个体。所述施用可以是全身或局部施用。

所述施用可以是涂布在皮肤上。

所述个体可以是人、牛、马、猪、狗、羊、山羊或猫等哺乳动物。所述个体可以是需要预防或治疗黑色素过度沉着疾病的个体。

剂量可以根据配制方法、施用方式、患者的年龄、体重、性别、患病程度、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度以及反应敏感性等因素进行多种参与方，所属领域的技术人员可以在考虑这些因素的情况下适度调整剂量。施用次数可以是每天1次或是在临床可接受的副作用范围内每天两次或多次，施用部位也可以是1处或者2处或更多，并且总施用日期可以是每天或每隔1天至5天、1次治疗时施用1天至30天。必要时可在适当时期以后重复相同治疗。对于人以外的动物，每公斤的剂量可与人相同，或者例如按照目标动物和人器官(心脏等)的体积比(例如，平均值)等计算出所述剂量后施用。

另一发面提供一种用于制备药剂的三白草白叶提取物的用途，所述药剂用于预防或治疗黑色素过度沉着疾病。

考虑到本说明书的复杂性，省略了重复的内容，并且本说明书中未定义的术语具有本发明所属领域常规使用的含义。

有益效果

根据一方面的组合物包括三白草白叶提取物，因此能够具有皮肤美白、抑制黑色素生成和分泌、以及抑制黑色素过度沉着的功效。相较于三白草绿叶提取液，所述三白草白叶提取物对黑色素生成和分泌的抑制高效、以及对皮肤色素沉着的抑制功效优异，因此可用作用于皮肤美白的化妆品组合物或药物组合物。

附图说明

图1a示出实施例1中三白草白叶提取物的LC-QTOF-MS分析结果。

图1b示出比较例1中三白草绿叶提取物的LC-QTOF-MS分析结果。

图2a和图2b是三白草白叶中含有的槲皮苷的MS断裂模式。

图3a和图3b是三白草白叶中含有的阿福豆苷的MS断裂模式。

图4示出实施例1、比较例1、实施例2、以及比较例2的细胞毒性实验结果。

图5示出三白草白叶提取物含有的槲皮苷的细胞毒性实验结果。

图6示出三白草白叶提取物含有的阿福豆苷的细胞毒性实验结果。

图7示出实施例1、比较例1、实施例2、以及比较例2的黑色素生物合成结果。

图8示出三白草白叶提取物含有的槲皮苷的黑色素生物合成结果。

图9示出实施例1和比较例1的黑色素分泌率结果。

图10示出三白草白叶提取物含有的槲皮苷的黑色素分泌率结果。

图11示出三白草白叶提取物含有的阿福豆苷的PAR-2表达抑制效果。

具体实施方式

以下，通过实施例详细描述本发明。然而，这些实施例旨在示例性描述本发明，本发明的范围不限于此。

实施例1.制备三白草白叶提取物

仅从三白草中分离出白叶，利用50％乙醇常温浸渍提取3天，以防止组分分解。过滤后浓缩滤液，并进行真空干燥。

比较例1.制备三白草绿叶提取物

仅从三白草中分离出绿叶，利用50％乙醇常温浸渍提取3天，以防止组分分解。过滤后浓缩滤液，并进行真空干燥。

实施例2.制备三白草白叶热水提取物

仅从三白草中分离出白叶，在其中添加相当于三白草白叶原料重量10倍重量的蒸馏水并混合，然后以90℃的温度提取4.5小时。利用滤纸过滤得到的提取液，然后用旋转式蒸发干燥器对过滤液进行减压浓缩。通过冻干得到粉状的三白草白叶热水提取物，以去除减压浓缩后溶液中残留的溶剂。

比较例2.制备三白草绿叶热水提取物

仅从三白草中分离出绿叶，在其中添加相当于三白草绿叶原料重量10倍重量的蒸馏水并混合，然后以90℃的温度提取4.5小时。利用滤纸过滤得到的提取液，然后用旋转式蒸发干燥器对过滤液进行减压浓缩。通过冻干得到粉状的三白草绿叶热水提取物，以去除减压浓缩后溶液中残留的溶剂。

实验例1.确认白叶和绿叶提取物的次级代谢物并对比其含量

为确认实施例1的三白草白叶提取物和比较例1的三白草绿叶提取物的次级代谢物并分析其含量进行了试验。

首先，将三白草白叶提取物和三白草绿叶提取物分别溶于50％甲醇，以使其浓度达到1mg/mL。然后，用0.45μmPVDF(Polyamide Fluoride)过滤器进行过滤，并用LC-QTOF-MS(liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry)进行了分析。将LC-QTOF-MS分析结果示于图1a至图1b。

如图1a和图1b所示，确认到三白草白叶中含量似乎高于绿叶中含量的4个峰(peak)。针对4个峰分析了MS断裂模式(fragmentation pattern)，结果均可预测为黄酮醇苷(flavonoid glycoside)。

在所述4种黄酮醇苷中，将针对主要表现出差异的2个峰的MS断裂模式示于图2a至图2b以及图3a至图3b。此外，将所述两个峰的MS片段去重(dereplication)结果示于表1。

【表1】

如图2a、图2b、图3a、图3b以及表1所示，白叶中含量似乎多于绿叶中含量的2个主峰被预测为槲皮苷和阿福豆苷。与槲皮苷和阿福豆苷的标准品一同测量后确认了相应成分，并确认到其在白叶中的含量高于绿叶中的含量。

实验例2.评价对B16黑色素瘤细胞的细胞毒性

评价了三白草白叶提取物和绿叶提取物以及指示成分槲皮苷对B16黑色素瘤细胞的细胞毒性。

具体地，将黑色素瘤细胞接种至6孔板中培养24小时后，替换为含有α-MSH和10％牛血清的新的DMEM培养基，然后以不同浓度处理每个试样并培养72小时。对已终止培养的细胞替换将2.5mg/ml的MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)溶液稀释10倍的培养基后使其反应。然后，去除上清液、添加2ml的DMSO(dimethylsulfoxide)，以此溶解已生成的MTT-formazan晶体后，通过ELISA reader在570nm下测量了吸光度。将处理α-MSH的试样作为对照组。与对照组不同，细胞毒性用吸光度的百分比来表示，并将其结果示于表2、表3、图4以及图5。

【表2】

【表3】

如表2、表3、图4以及图5所示，在黑色素瘤细胞中，实施例1的三白草白叶提取物、比较例1的三白草绿叶提取物、实施例2的三白草白叶热水提取物、以及比较例2的三白草绿叶热水提取物一直到0.1μg/ml浓度均未表现出毒性。此外，指标成分槲皮苷一直到100μg/ml浓度都未表现出毒性。

实验例3.评价对人永生化角质形成细胞(HaCaT)的细胞毒性

评价了指标成分阿福豆苷对人永生化角质形成细胞(HaCaT)的细胞毒性。

具体地，将人永生化角质形成细胞接种至24孔板后培养24小时，然后将已培养细胞的培养基替换为无血清培养基，并以不同浓度处理试样后培养了24小时。对已终止培养的细胞替换将2.5mg/ml的MTT溶液稀释10倍的培养基后使其反应。然后，去除上清液、添加1ml的DMSO，以此溶解已生成的MTT-formazan晶体后，通过ELISA reader在570nm下测量了吸光度。将未处理组作为对照组。与对照组不同，细胞毒性用吸光度的百分比来表示，并将其结果示于表4和图6。

【表4】

如表4和图6所示，作为指标成分的阿福豆苷一直到100μg/ml浓度都未对人永生化角质形成细胞表现出毒性。

实验例4.检测黑色素瘤细胞中每单位细胞抑制黑色素生物合成的美白功效

检测了三白草白叶提取物和绿叶提取物以及指标成分槲皮苷在黑色素瘤细胞中的每单位细胞抑制黑色素生物合成的美白功效。

具体地，将黑色素瘤细胞接种至6孔板中培养24小时后，替换为含有α-MSH和10％

牛血清的新的DMEM培养基，然后以不同浓度处理试样并培养72小时。培养72小时后，为检测分泌到培养基的黑色素量，将培养基转移至96孔板中，然后在450nm下测量吸光度，从而求得每单位细胞的黑色素分泌量。然后，用2ml的PBS(phosphate-bufferedsaline)洗涤去除所有培养基的细胞，然后用0.25ml的1N NaOH进行处理，并将细胞收集到1.5ml的管中，从而得到细胞内的黑色素。在60℃下温育30分钟已收集的细胞溶解产物后进行涡旋，转移至96孔板后测量450nm下的吸光度，从而求得每单位细胞的黑色素生成量。将处理α-MSH的组作为对照组，阳性对照组则施用了熊果苷(HyundaiBioland制造)。将每单位细胞的黑色素生物合成结果示于表5、表6、图7以及图8，并将每单位细胞的黑色素分泌率结果示于表7、表8、图9以及图10。

【表5】

【表6】

【表7】

/>

【表8】

如表5至表8以及图7至图10所示，三白草白叶乙醇提取物和绿叶乙醇提取物以浓度依赖性的方式降低了因α-MSH而增加的每单位细胞的黑色素生成率和分泌率。特别是，确认到三白草白叶乙醇提取物的每单位细胞的黑色素生成以及分泌抑制功效优异于绿叶乙醇提取物。此外，指示成分槲皮苷被认为通过抑制每单位细胞的黑色素生成率和分泌率，因抑制黑色素生物合成和分泌而表现出美白功效。

此外，确认到三白草白叶和绿叶中乙醇提取物的每单位细胞以浓度依存性方式降低黑色素生成率的效率均优异于热水提取物。

实验例5.检测通过阻碍转移至表皮的黑素体来抑制皮肤色素沉着的美白功效

检测了由指标成分阿福豆苷的黑素体抑制引起的皮肤色素沉着抑制功效。

黑素体转移(melanosome transfer)是将黑素体从黑素细胞(Melanocyte)转移至表皮的过程，其存在各种机制，其中广为人知的是由作为关键介质的PAR-2(protease-activated receptor-2)引起的吞噬作用(phagocytosis)。确认到通过阻碍这种PAR-2的表达来抑制转移至表皮的黑素体进而抑制皮肤色素沉着的美白功效(Eun-Jung CHOI at al，Macelignan Inhibits Melanosome Transfer Mediated by Protease-ActivatedReceptor-2in Keratinocytes，Biol.Pharm.Bull.34(5)748-754，2011)。

在60㎜的培养皿(corning)中接种人永生化角质形成细胞(HaCaT)后培养24小时，用HBSS(Hank's Buffered Salt Solution)洗涤2次后，添加HBSS并照射UVB 30mJ/cm

【表9】

【表10】

如表10和图11所示，在用指标成分阿福豆苷处理人永生化角质形成细胞后，确认到因UVB增加的PAR-2表达受到抑制。由此，证实指标成分阿福豆苷通过抑制转移至表皮的黑素体来表现出抑制皮肤色素沉着的美白功效。

SEQUENCE LISTING

<110>科丝美诗株式会社

<120>一种包括三白草白叶提取物的用于皮肤美白的组合物

<130>PX068311PCT

<150>KR 10-2021-0090492

<151>2021-07-09

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PAR-2 正向引物

<400>1

tgctagcagc ctctctctcc 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PAR-2 反向引物

<400>2

ccagtgagga cagatgcaga 20

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>β-Actin 正向引物

<400>3

ggcacccagc acaatgaag19

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>β-Actin 反向引物

<400>4

ccgatccaca cggagtactt g 21