一种基于全息成像的数字化生化分析方法及其配套检测装备

技术领域

本发明涉及一种基于全息成像的数字化生化分析方法及其配套检测装备，属于生化分析领域。

背景技术

近年来，随着人民生活水平的提高和科学技术的发展，食品安全、体外诊断和环境监测等领域所面临的挑战也随之增加，高效的检测方法、精准的信号读出手段和低成本检测装备在保障食品安全、生态环境安全和促进人类健康等方面都具有重要的意义。数字化单微球生化分析方法是一种具有单分子测定能力的检测方法，传统的数字化微球分析方法包括荧光微球免疫分析法、金纳米颗粒或上转换纳米颗粒免疫分析法以及基于纳米孔飞升阵列反应器等。这些方法均具有灵敏度高、准确度好和检测精度高的优点，且广泛用于各种目标物检测，例如核酸或非核酸目标。然而，这些方法大多数需要复杂的前扩增步骤和昂贵的成像设备，而这些设备通常只有先进的实验室或大型医院才能提供。同时使用的信号探针例如荧光探针稳定性比较差且成本高，这些局限性给数字化单微球分析方法的现场快速检测带来重大挑战。因此，迫切需要低成本、便携式成像设备和新颖的数字信号探针与高效信号读出技术相结合，以提升数字化单微球分析方法的现场快速检测的能力。

随着光学技术、软件工程和电气微芯片集成的进步，光学显微镜成像已成为单微球传感领域有前途的检测手段之一，并已广泛应用于数字化微球测定。然而，传统的光学显微镜通常需要配备复杂的图像传感器和镜头，必须由专业人员在专门的实验室中操作，且作为精密成像仪器无法实现便携化。为了应对这些挑战，我们探索了一种无透镜全息显微镜与紧凑、经济高效的宽视场图像传感器的结合。全息显微镜可以在互补金属氧化物半导体(CMOS)传感区域上的部分相干光源下捕获全息图，并记录样本的振幅和相位信息。数字重建算法可对捕获收集的全息图像进行重建，恢复相位和振幅，实现算法数字化自动对焦。聚苯乙烯微球(polystyrene microsphere，PS)具有粒径可控、稳定性好、表面容易进行化学修饰和成本低等优点，因此是一种理想的光学信号探针，它们可以通过无透镜全息显微镜记录，无需额外的操作即可实现可视化信号读出。基于光学全息成像技术可以监测数字重建后微球数量的变化，并结合训练好的基于深度学习的目标识别算法完成微球计数，建立微球个数与目标物含量的对应关系，并完成定量检测。

目前基于光学成像可视化微球计数的免疫分析方法已有多种实现方式，例如申请人前期申请的一种基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法(CN 112964868A)和一种同时检测多种目标物的生化分析方法(CN 112852925A)。上述方法虽然可以通过光学显微成像直接读取微球数量实现多目标物同时检测，与传统的库尔特小孔微球电阻法和差分阻抗法相比检测成本更低，操作也更加便捷。但是此类方法均只能在实验室内进行，需要使用较为昂贵的光学成像设备如光学显微镜，无法脱离实验室环境实现现场即时检测，且带镜头光学显微镜收受到视野场面积小等缺点的制约，每次观察的视野面积有限，对于同一个样品需要进行多次拍照以捕获样品内的微球图像，这些缺点进一步影响了检测结果的稳定性和准确性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出了一种基于全息成像的数字化生化分析方法及其配套检测装备，该方法将噬菌体介导的活菌核酸提取、CRISPR/Cas12a生物传感/基于抗体-抗原的免疫识别、可视化无透镜全息成像和深度学习目标检测集成于一个通用的数字化生物传感平台，用于检测核酸靶标或者是非核酸靶标，如食源性致病菌、炎症标志物、小分子抗生素等。

以检测食源性致病菌为例阐述本发明内容，首先将纳米磁颗粒-噬菌体偶联物加入复杂食品基质中反应，噬菌体特异性地捕获活细菌，磁分离后细菌被噬菌体抓取裂解释放DNA，实现活死菌区分和核酸富集。将偶联链霉亲和素的微球信号探针、偶联点击试剂1(如叠氮Azide)的纳米磁颗粒以及分别偶联生物素和点击试剂2(如二苯并环辛炔DBCO)的报告桥梁探针进行反应后形成信号探针-报告桥梁探针-纳米磁颗粒复合物，特定的细菌DNA能够与相对应的crRNA互补从而激活Cas12a酶的反式切割能力去切断报告桥梁探针使复合物发生断裂，磁分离后直接对上清液中的信号探针进行全息显微成像，通过深度学习算法捕获微球信号探针的全息图进行图像重建和目标检测计数，建立目标物浓度和上清液中微球数量的标准曲线，实现待测致病菌的定量检测。

对于炎症标志物和抗生素的检测，本发明首先在纳米磁颗粒上偶联检测炎症标志物对应的捕获抗体/抗生素对应的BSA完全抗原，并将炎症标志物对应的检测抗体/抗生素对应的抗体生物素化，然后将样品加入到磁颗粒-捕获抗体/BSA完全抗原复合物和生物素化的检测抗体/抗体溶液中充分混匀，反应30分钟后形成免疫复合物,磁分离后弃去上清液。随后加入偶联链霉亲和素的PS微球信号探针与纳米磁颗粒复合物反应10分钟，磁分离后收集上清液中未反应的PS微球，用于全息成像，建立目标物浓度和免疫复合物中微球数量的标准曲线，实现待测炎症标志物的定量检测。

本发明所使用的技术手段具体如下：

本发明的第一个目的在于提供一种基于全息成像的数字化生化分析方法，所述方法包括：

步骤1：将不同待测目标细菌对应的噬菌体或者识别其他目标物的生物识别元件偶联到纳米磁颗粒上，用于特异性的捕获活细菌或者非核酸目标物，磁分离保留纳米磁颗粒-噬菌体-细菌复合物，静置裂解释放DNA后收集反应液备用或者磁分离保留纳米磁颗粒-抗体-非核酸目标物；

步骤2：选用聚苯乙烯微球作为信号探针：

对于致病菌的检测，将偶联链霉亲和素的聚苯乙烯微球信号探针、偶联点击试剂1的纳米磁颗粒和两段分别偶联生物素和点击试剂2的报告桥梁探针进行生化反应，形成聚苯乙烯微球信号探针-报告桥梁探针-纳米磁颗粒复合物备用，将所述步骤1中提取好的细菌DNA和与crRNA组装好的Cas12a酶混合以激活其反式切割能力，随后将激活的Cas12a酶反应液加入到上述复合物中切断报告桥梁探针，磁分离后保留含有聚苯乙烯微球信号探针的上清液；

对于非核酸目标物的检测，先将纳米磁颗粒-捕获抗体/抗原偶联物、生物素化的检测抗体/抗体偶联物和待测目标物混合，完成双抗夹心免疫反应/竞争免疫反应；磁分离后去除未反应抗体和目标物，保留纳米磁颗粒偶联物，加入聚苯乙烯微球-链霉亲和素信号探针，生物正交反应后磁分离保留含有聚苯乙烯微球信号探针的上清液；

步骤3：将含有聚苯乙烯微球的上清液或者免疫复合物滴加到载玻片上，涂匀后盖上玻片，将盖玻片放置在无镜头的全息显微镜传感区域之上，便携式全息显微镜对聚苯乙烯微球信号探针进行全息成像，并将信号探针的全息图像传送至计算机；

步骤4：利用训练好的卷积神经网络重建聚苯乙烯微球全息图的相位与振幅，完成自动对焦功能，同时基于Pytorch的深度学习目标算法对于重建后的聚苯乙烯微球进行目标识别并标记检测到的微球，输出微球的数量，最后根据高分子微球的数量计算待测样品中目标物的含量，实现目标物的定量检测。

可选的，所述高分子微球的粒径为1μm～50μm，所述纳米磁颗粒的粒径为100nm～5000nm。

可选的，所述生化反应包括：基于CRISPR/Cas12a生物传感，基于抗体-抗原免疫识别反应、生物素-链霉亲和素反应、无需催化的点击反应。

可选的，所述点击反应的功能团包括叠氮-炔、四嗪(TZ)-反式环辛烯(TCO)、二苯并环辛炔(DBCO)-叠氮(Azide)、半胱氨酸(Cys)-氰基苯并噻唑(CBT)或其他。

可选的，对于CRISPR/Cas12a生物传感，纳米磁颗粒和报告桥梁探针的最佳优化浓度分别为250μg/mL和2.5μM，crRNA和Cas12a酶的浓度分别优化为1.25μM和1μM，切割时间为90分钟。

本发明的第二个目的在于提供一种基于全息成像的数字化生化分析检测装备，包括CMOS相机、光源发生器、相干光源、光圈、微控制器、移动电源和图像处理装置；

所述微控制器和光源发生器通过移动电源供电产生光源，随后通过带有小孔的光圈调制后变为部分相干光源；

含有微球探针的液滴样品滴加于盖玻片并放置于所述全息显微镜的CMOS传感芯片正上方，所述相干光源照射至微球样品上发生衍射，样品的相位和振幅信息被所述全息显微镜记录并保存为全息图储存至上位机，完成图像收集；无透镜全息显微镜是基于CMOS传感相机搭建的一个便携式装备，装备的成像基础是CMOS相机。

所述图像处理装置利用训练好的卷积神经网络重建聚苯乙烯微球全息图的相位与振幅，完成自动对焦功能，同时基于Pytorch的深度学习目标算法对于重建后的聚苯乙烯微球进行目标识别并标记检测到的微球，输出微球的数量，最后根据高分子微球的数量计算待测样品中目标物的含量，实现目标物的定量检测。

可选的，所述全息显微镜的传感相机包括：CMOS相机、CCD相机、智能手机图像传感器。

可选的，所述全息显微镜的光圈小孔直径为50μm～1000μm，相干光源波长为390nm～780nm。

可选的，所述微球为聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、聚丁二烯微球、聚异戊二烯微球中的任一种。

可选的，所述待测样品中目标物包括：病毒、细菌、RNA分子、生物标志物、抗生素分子、农药分子、兽药分子、生物毒素。

本发明有益效果是：

(1)基于全息成像的数字化生物传感平台是一种通用的检测平台，检测对象不仅限于核酸靶标，对于非核酸靶标也可以实现精准检测。本发明将噬菌体介导的活菌核酸提取、CRISPR/Cas12a生物传感/基于抗体-抗原的免疫识别、可视化无透镜全息成像和深度学习目标检测集成到一个通用的数字化生物传感平台中，与传统的qPCR核酸检测方法相比可以实现免扩增检测和活死菌区分，同时本发明所检测的目标物不仅限于核酸靶标，也可以结合不同的生化反应(如基于抗原-抗体的免疫反应)对非核酸靶标进行检测。与发明人之前申请的专利方法相比(CN 112964868A和CN 112852925A)，本发明实现了成像设备实现便携化、低成本和超宽视野场，将原来需要的光学显微镜设备成本从几万元降低到1千元，视野场面积扩大了5倍，解决了前期专利中的设备检测成本高、无法便携、视野场面积小等问题。

(2)计数过程可视化，准确性好。本发明通过搭建的便携式无透镜全息显微镜代替传统的光学显微镜对捕获信号探针进行全息成像，实现信号探针的可视化成像，全息显微镜可以实现在超宽视野场面积下感知低至一个微球信号探针的变化并准确记录捕获全息图，进一步提高了检测灵敏度和准确性。

(3)操作简便，检测速度更快。在细菌DNA提取上，本发明提出了基于噬菌体的DNA提取技术，与传统的试剂盒核酸提取法相比实现了活死菌区分和目标细菌富集，仅需一步法操作即可完成目标细菌富集和提取，且极大的缩短了提取时间，1小时内即可完成提取。在检测方法上，本发明方法无需复杂的前处理和预扩增手段，高效的生物正交反应和CRISPR/Cas12a反应进一步缩短了检测时间，提高了检测效率。从装备上，仅通过简单的样品滴加等操作即可完成制样，上位机会自动收集样品全息图，深度学习检测网络自动实现目标物含量检测，操作更加简便。本发明中信号探针的数量直接与目标物的含量相关，整个信号转换一步完成，不需要多余的信号放大步骤，从而进一步简化了操作步骤并提高了检测效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中检测食源性致病菌的生化反应原理流程图。

图2为本发明中搭建的便携式全息显微镜结构示意图。

图3为本发明中微球信号探针全息图的图像处理流程图。

图4为本发明中的全息显微镜和传统光学显微镜视野场面积对比图。

图5为本发明检测沙门鼠伤寒的生化反应中关键参数条件优化图。

图6为实施例1中本发明方法与标准qPCR方法检测鸡肉样品中沙门鼠伤寒标准曲线和线性范围对比图。

图7为本发明中深度学习算法对于聚集状态微球识别的准确性验证。

图8为实施例2中本发明方法检测生菜样品中金黄色葡萄球菌线性范围结果图。

图9为实施例3中本发明方法检测鲜牛乳样品中单增李斯特菌线性范围结果图。

图10为实施例4中本发明方法检测猪肉样品中大肠杆菌线性范围结果图。

图11为实施例5中本发明方法检测大分子降钙素原PCT的检测原理与检测结果。

图12为实施例6中本发明方法检测小分子氯霉素CAP的检测原理与检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

以检测食源性致病菌中的沙门氏菌为例，本发明的检测原理如下：参见图1，生化反应流程大体上分为三步：①噬菌体介导的DNA提取、②基于CRISPR的生物传感和③全息成像/智能目标检测。

首先，将沙门氏菌对应的噬菌体偶联在纳米磁颗粒上，将纳米磁颗粒-噬菌体偶联物加入待测物中，噬菌体特异性捕获有活性的沙门氏菌，磁分离后保留纳米磁颗粒-噬菌体-细菌复合物，静止后裂解细菌释放DNA，完成细菌DNA富集和提取。

随后，沙门氏菌DNA的特定序列片段会与crRNA互补从而激活Cas12a酶的反式切割活性，切断纳米磁颗粒-叠氮-DBCO-报告桥梁探针-生物素复合物，而不含沙门氏菌DNA的阴性样品不会激活Cas12a酶的反式切割能力。偶联链霉亲和素的信号探针，会与生物素发生生物正交反应，形成微球信号探针-链霉亲和素-生物素-报告桥梁探针-DBCO-叠氮-纳米磁颗粒复合物。当沙门氏菌DNA浓度升高时，激活的Cas12a酶数量越多则报告桥梁探针被切断的越多，磁分离后上清液中微球的数量就更多；反之沙门氏菌DNA浓度越低，激活的Cas12a酶数量越少则形成的复合物越多，磁分离后清液中微球的数量就更少。因此，上清液中微球信号探针的数量与待测细菌的浓度含量呈现负相关。

最后，通过全息显微镜对微球探针进行全息成像捕获生产的全息图，深度学习算法对全息图完成重建和微球目标检测，反馈微球数量和目标物含量，实现待测目标物的精准定量检测。

参见图2所述为搭建的便携式全息显微镜结构示意图，其主要组成部分CMOS传感芯片、光源发生器、相关光源、光圈、微控制器和移动电源。首先，微控制器和光源发生器通过移动电源供电产生光源，随后通过带有小孔的光圈调制后变为部分相干光源。含有微球探针的液滴样品滴加于盖玻片并放置于CMOS芯片的传感区域正上方，相干光源照射至微球样品上发生衍射，样品的相位和振幅信息被CMOS芯片记录并保存为全息图储存至上位机，完成图像收集。

参见图3所述为微球信号探针全息图的图像处理流程，微球信号探针的全息图被全息显微镜收集保存至上位机，全息图记录了微球探针的振幅和相位信息。与传统光学显微镜相比，全息显微镜没有物镜和目镜，因此无法实现对焦过程，对焦的流程需要通过算法实现。首先，微球信号探针的全息图通过背景矫正除去多余的噪声背景，使用角谱重建算法对微球全息图进行图像重建，同时双边滤波算法用于除去重建过程中生成的孪生干扰像，此过程中微球的相位和振幅信息将会被算法恢复，完成数字自动对焦的过程。重建后的微球图像被人工打上标签制作为训练数据集，这些标签包含微球大小信息和位置信息，图像和标签被输入到深度学习的神经网络中进行训练与学习，计算机会记录整个训练学习的流程并保存最近的训练识别模型用于后续预测，训练完的CNN可以实现微球的检测并标记，同时完成微球计数，与目标物的含量产生关联，最后直接输出目标物含量。

参见图4所述为本发明全息显微镜和传统光学显微镜视野场面积对比图，传统带镜头的光学显微镜受限于镜头对焦，虽能获取较高的空间分辨率和图像清晰度，但视野场面积也随之下降。与传统的光学显微镜相比，无透镜全息显微镜在视野场面积上有着突出优势，以型号为MT9P031的CMOS传感器为例，其视野场面积等同于传感芯片的成像面积为24.396mm2，而普通光学显微镜的4倍、10倍和20倍物镜下的视场面积分别为3.990mm2、0.723mm2和0.182mm2，相对比全息显微镜的视野场分别提升了7倍,33倍和134倍。因此，全息显微镜可以实现高分辨下更大视野场面积的成像效果，在同等拍照情况下可以记录更多的微球信息，这对于数字化免疫测定的准确性至关重要。

实施例1：定量检测鸡肉样品中的沙门鼠伤寒

(1)制备聚苯乙烯微球-链霉亲和素偶联物(PS-SA)、纳米磁颗粒-叠氮偶联物(MNP-Azide)和纳米磁颗粒-噬菌体偶联物(MNP-噬菌体)

聚苯乙烯微球-链霉亲和素偶联物(PS-SA)的制备如下。首先，将1mg的10μm聚苯乙烯微球溶液加入到1.5mL离心管中，并用MEST缓冲液洗涤3次。随后加入EDC(50μL,5mg/mL)和NHS(50μL,5mg/mL)与聚苯乙烯微球溶液混合以激活微球表面的羧基基团，将混合物用MES缓冲液稀释至1mL，并在室温下缓慢旋转混合15分钟。将活化后的聚苯乙烯微球溶液用PBST缓冲液(1mL)洗涤3次，并以6000r/min的速度离心5分钟。链霉亲和素(30μg)添加到含有活化后的聚苯乙烯微球的离心管中并用PBS缓冲液稀释至500μL，混合物在37℃缓慢旋转偶联30分钟以使反应充分。洗涤后加入PBST缓冲液(1mL，含1％ BSA，pH 7.4)与聚苯乙烯微球-链霉亲和素偶联物混合，封闭残留活性位点30分钟。最后，将封闭的聚苯乙烯微球-链霉亲和素偶联物用PBST缓冲液(1mL)洗涤3次，并用PBST(1mL，含0.5％BSA，0.02％NaN

纳米磁颗粒-叠氮偶联物和纳米磁颗粒-噬菌体偶联物的制备与上述类似，不同之处在于用磁分离分离代替离心。EDC和NHS的使用量对于偶联不同的种类的生物配体是不同的，其中纳米磁颗粒-叠氮偶联物EDC用量为20μL(5mg/mL)，纳米磁颗粒-噬菌体NHS偶联物用量为100μL(5mg/mL)，纳米磁颗粒-叠氮偶联物EDC用量为20μL(5mg/mL)，纳米磁颗粒-噬菌体偶联物NHS用量为50μL(5mg/mL)，偶联过程需要室温3h，并放置于4℃保存。

(2)噬菌体介导的沙门鼠伤寒DNA提取

对于纳米磁颗粒-沙门鼠伤寒噬菌体介导的沙门鼠伤寒DNA提取，将纳米磁颗粒-沙门鼠伤寒噬菌体(100μL，250μg/mL)添加到含有沙门鼠伤寒细菌前处理后的鸡肉样品中(100μL)中，在37℃下反应15分钟随后磁分离，将纳米磁颗粒-噬菌体-沙门鼠伤寒细菌复合物在室温下放置1.5小时以完全裂解以提取细菌DNA。最后将细菌DNA重悬于超纯水(50μL)中，保存于-20℃，并使用NanoPhotometer进行定量。

(3)沙门鼠伤寒检测流程

具体检测步骤如下：首先，将Lba Cas12a(2μL，1μM)和crRNA(2μL，1.25μM)与1×NEB buffer 2.1(6μL)在200μL离心管中于室温下混合反应20分钟进行组装。同时，纳米磁颗粒-叠氮化物偶联物(15μL，0.5mg/mL)和报告桥梁探针(5μL，2μM)在室温下混合10分钟。反应后，磁分离保留纳米磁颗粒-报告桥梁探针偶联物并用去离子水洗涤3次。随后，加入1×NEB buffer 2.1(10μL)、沙门鼠伤寒DNA(10μL)和组装完成的Lba Cas12a(10μL)，与纳米磁颗粒偶联物在37℃下轻微振荡混合1.5小时，磁分离后用去离子水洗涤纳米磁颗粒偶联物3次。最后，加入聚苯乙烯微球-链霉亲和素偶联物(30μL，0.5mg/mL)与上述纳米磁颗粒偶联物在37℃下混合15分钟，磁分离后保留上清液用于全息成像。每个液滴样品(～8μL)被选择用于三个感兴趣区域以记录三个图像，并且每个样品(～30μL)被分成三个液滴以进行三次测量。

(4)深度学习网络训练与图像处理

本发明通过在Pytorch构架上构建了一个用于目标识别的卷积神经网络CNN，由三部分组成：输入端、骨干网络和头网络。CNN的五个基本组件是CBS、MP、ELAN、ELAN-H和SPPCSPC。训练数据集由1100对输入重建图像(640×640像素)和手动标签组成。训练过程在配备了16核3.9GHz Intel i9-12900K CPU处理器和Nvidia GeForce RTX 3090ti GPU的计算机上进行。经过250轮次的训练(训练约3.5小时)，CNN实现了微球检测并同时标记和计数这些图像。训练后，最佳模型被迁移到配备Nvidia GeForce GTX 1060GPU的笔记本电脑上进行验证和测试。每个1280×960像素图像的处理时间约为0.5秒，每个样本(9个2560×1920像素图像)的处理时间约为18秒。值得注意的是，每张2560×1920像素的原始重建图像被分为4张1280×960像素的图像。分割后的图像通过检测CNN进行两次填充，以适应小目标检测。最后对所有自动对焦重建后的图像识别数据进行整合对比处理，当图像微球识别误差≤1％时系统判断计数有效，反馈函数值到计算机，计算机输出微球信号探针的数量完成目标识别检测。

(5)定量检测鸡肉样品中的沙门鼠伤寒

图像处理流程后，深度神经网络会圈出识别出的微球图像并反馈识别的上清液中的微球数，以上清液中的10μm聚苯乙烯微球个数为纵坐标，沙门鼠伤寒细菌浓度的对数值为横坐标，得到两者之间的相互关系可用于沙门鼠伤寒的定量检测。如图5所示，本实施例中对所涉及的生化反应的关键参数浓度进行了条件优化，包括纳米磁颗粒浓度，报告桥梁探针浓度，Cas12a酶浓度，crRNA浓度和Cas酶切割时间。在CRISPR反应之前，对不同浓度的纳米磁颗粒和报告桥梁探针进行优化，最佳优化浓度分别为250μg/mL和2.5μM，此外crRNA和Cas12a酶的浓度分别优化为1.25μM和1μM，切割时间优化为90分钟。在优化后的最佳条件下对沙门鼠伤寒检测结果如图6所示，结果表明本发明方法在10

如表1所示，为采用标准加入法对鸡肉样品中的沙门鼠伤寒进行检测的结果，实验结果表明本发明方法对鸡肉样品中的沙门鼠伤寒检测均具有较好的准确性和回收率。

表1采用标准加入法对鸡肉样品中的沙门鼠伤寒进行检测的结果

将本发明所用实验方法与传统的qPCR检测法和数字液滴PCR检测法相对比，对比结果如表2所示，对比结果表明本发明的检测方法优势明显。首先，本发明的检测与传统方法相比无需复杂的扩增手段，室温下即可完成，而传统方法均需要高温循环扩增，增加了仪器成本和操作复杂度。其次，本发明方法和检测装备在保证检测灵敏度高的基础上，进一步实现了低成本检测，同时缩短了检测时间。最后，本发明采用的检测方法无需荧光探针和荧光显微镜，通过简单便捷的明场全息成像代替了传统的荧光信号读出，提高了检测试剂的稳定剂，且极大的降低了检测成本。

表2本发明检测方法与传统qPCR和数字液滴PCR检测方法对比

将本发明所用无透镜全息显微镜与传统光学显微镜相比，对比结果如表3所示，对比结果表明本发明的所用全息成像显微镜优势明显。以徕卡的DM-3000光学显微镜为例，本发明所搭建的无透镜全息显微镜在质量上降低了约15.7倍，可以实现小型便携化，在设备成本上降低了约64.3倍，同时视野场与光学显微镜10倍物镜下的面积提升了约33.8倍。因此，本发明方法相比于传统显微成像数字化检测方法，在成像设备上更易实现低成本、高便携式检测，同时保证信号探针的宽视野场面积和高空间分辨率成像。

表3无透镜全息显微镜与光学显微镜成像设备对比

实施例2定量检测生菜样品中的金黄色葡萄球菌

对于生菜样品中的金黄色葡萄球菌的定量检测，其中聚苯乙烯微球-链霉亲和素偶联物(PS-SA)、纳米磁颗粒-叠氮偶联物(MNP-Azide)和纳米磁颗粒-噬菌体偶联物(MNP-噬菌体)的制备策略与实施例1相同。对于噬菌体介导的DNA提取，区别在于需要将噬菌体更换为金黄色葡萄球菌对应的噬菌体，操作流程和提取策略与实施例1相同，生菜的前处理方法参照国标方法进行。对于金黄色葡萄球菌检测流程，参照实施例1中沙门鼠伤寒检测流程，区别在于需要将实施例1中的沙门鼠伤寒对应的crRNA更换为金黄色葡萄球菌对应的crRNA，具体检测流程与全息图像捕获流程与实施例1一致。对于全息图像处理，实施例1中训练完成的卷积神经网络CNN模型会迁移保存至计算机，可用于相同种类尺寸微球信号探针的检测识别，图像中微球检测识别与实施例1一致，最终计算机输出微球信号探针的数量完成目标识别检测。按照上述操作流程对生菜样品中的金黄色葡萄球菌检测线性范围如图8所示，结果表明本发明方法在10

实施例3定量检测生鲜乳样品中的单增李斯特菌

对于生鲜乳样品中的单增李斯特菌的定量检测，其中聚苯乙烯微球-链霉亲和素偶联物(PS-SA)、纳米磁颗粒-叠氮偶联物(MNP-Azide)和纳米磁颗粒-噬菌体偶联物(MNP-噬菌体)的制备策略与实施例1相同。对于噬菌体介导的DNA提取，区别在于需要将噬菌体更换为单增李斯特菌对应的噬菌体，操作流程和提取策略与实施例1相同，生菜的前处理方法参照国标方法进行。对于单增李斯特菌检测流程，参照实施例1中沙门鼠伤寒检测流程，区别在于需要将实施例1中的沙门鼠伤寒对应的crRNA更换为单增李斯特菌对应的crRNA，具体检测流程与全息图像捕获流程与实施例1一致。对于全息图像处理，实施例1中训练完成的卷积神经网络CNN模型会迁移保存至计算机，可用于相同种类尺寸微球信号探针的检测识别，图像中微球检测识别与实施例1一致，最终计算机输出微球信号探针的数量完成目标识别检测。按照上述操作流程对生菜样品中的单增李斯特菌检测线性范围如图9所示，结果表明本发明方法在10

实施例4定量检测猪肉样品中的大肠杆菌

对于猪肉样品中的大肠杆菌的定量检测，其中聚苯乙烯微球-链霉亲和素偶联物(PS-SA)、纳米磁颗粒-叠氮偶联物(MNP-Azide)和纳米磁颗粒-噬菌体偶联物(MNP-噬菌体)的制备策略与实施例1相同。对于噬菌体介导的DNA提取，区别在于需要将噬菌体更换为大肠杆菌对应的噬菌体，操作流程和提取策略与实施例1相同，猪肉的前处理方法参照国标方法进行。对于大肠杆菌检测流程，参照实施例1中沙门鼠伤寒检测流程，区别在于需要将实施例1中的沙门鼠伤寒对应的crRNA更换为大肠杆菌对应的crRNA，具体检测流程与全息图像捕获流程与实施例1一致。对于全息图像处理，实施例1中训练完成的卷积神经网络CNN模型会迁移保存至计算机，可用于相同种类尺寸微球信号探针的检测识别，图像中微球检测识别与实施例1一致，最终计算机输出微球信号探针的数量完成目标识别检测。按照上述操作流程对猪肉样品中的大肠杆菌检测线性范围如图10所示，结果表明本发明方法在10

实施例5定量检测大分子降钙素原PCT

(1)制备纳米磁颗粒-降钙素原捕获抗体偶联物和生物素化降钙素原检测抗体

取2mg羧基修饰的纳米磁颗粒(150nm，10mg/mL)，用MES缓冲液(pH＝6.0)洗涤两次，用MES缓冲液重悬后加入50μL EDC(10mg/mL)和25μL NHS(10mg/mL)，混匀后在室温下活化15min。活化完成后用PBS缓冲液洗涤两次，用PBS缓冲液重悬后加入0.2mg降钙素原(PCT)捕获抗体，室温下反应2-4h，纳米磁颗粒-降钙素原捕获抗体偶联物用PBS缓冲液重悬后保存于4℃待用。

将生物素(2mg)溶解于超纯水(300μL)中，制备10mM生物素溶液，随后将PCT检测抗体(2mg)溶解在PBST缓冲液(300μL)中，与生物素溶液(10mM，～27μL)在室温下涡旋混合30分钟。最后将混合物放入透析袋中以除去过量的生物素。整个透析期持续48小时，应定期更换透析液。其他抗体的生物素化过程与上述步骤类似。

(2)免疫反应与磁分离

聚苯乙烯微球-链霉亲和素偶联物(PS-SA)的制备策略与实施例1相同。具体反应流程如下：首先，将纳米磁颗粒-降钙素原捕获抗体偶联物(各10μL，250μg/mL)、生物素-降钙素原检测抗体偶联物(各10μL，250μg/mL)，和不同浓度的PCT(各10μL，10-10

对于深度学习网络训练与图像处理操作流程与实施例1相同，实施例1中训练完成的卷积神经网络CNN模型会迁移保存至计算机，可用于相同种类尺寸微球信号探针的检测识别，图像中微球检测识别与实施例1一致，最终计算机输出微球信号探针的数量完成目标识别检测。按照上述操作流程对降钙素原PCT检测原理、标准曲线和线性范围如图11所示，结果表明本发明方法在10

实施例5定量检测小分子氯霉素CAP

对于小分子氯霉素CAP的定量检测，其中聚苯乙烯微球-链霉亲和素偶联物(PS-SA)、的制备策略与实施例1相同，纳米磁颗粒-氯霉素BSA完全抗原偶联物和生物素化氯霉素抗体偶联物的制备策略与实施例4相同，区别在于需要将实施例4中的降钙素原对应的双抗夹心免疫反应替换成了竞争免疫反应，降钙素原捕获抗体替换成了氯霉素完全抗原，生物化的检测抗体替换成了氯霉素抗体。其他具体检测流程与全息图像捕获流程与实施例4一致，大部分试剂均可实现通用替换。对于全息图像处理，实施例1中训练完成的卷积神经网络CNN模型会迁移保存至计算机，可用于相同种类尺寸微球信号探针的检测识别，图像中微球检测识别与实施例1一致，最终计算机输出微球信号探针的数量完成目标识别检测。按照上述操作流程对氯霉素CAP检测原理、标准曲线和线性范围如图12所示，结果表明本发明方法在10

本发明实施例中的部分步骤，可以利用软件实现，相应的软件程序可以存储在可读取的存储介质中，如光盘或硬盘等。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。