一种糖化血红蛋白检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于医疗器械技术领域，具体涉及一种糖化血红蛋白检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

糖尿病是一种内分泌代谢疾病，发病率仅次于心血管疾病和肿瘤，其病因和发病机制至今尚未完全阐明。最近几年糖尿病的发病率呈不断上升趋势，是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。传统的糖尿病诊断和治疗监测采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量试验等方法，但是血糖参数仅代表抽血时的瞬间血糖水平，测量不准确。近年来，糖化血红蛋白(HbA1c)的检测日益受到临床的高度重视。

糖化血红蛋白是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。总血红蛋白可以分为A，A2，F三种组分，其中F主要在胎儿期，而成人主要为A，是由两个α链和两个β链构成。A2由两个α链和两个δ链形成，F由两个α链和两个γ链形成。成人HbA占97％，又可分为HbA0和HbA1两种，HbA0为没有被糖基化部分，而HbA1为被糖基化部分。正常人平均HbA1c水平约为5％，总HbA1约占6％左右，而HbA1a和HbA1b总和尚低于1％。血糖和血红蛋白结合生成的糖化血红蛋白是不可逆反应，糖化血红蛋白与血糖浓度成正比，并且保持120天左右，所以，测试糖化血红蛋白可以观测到此前120天的血糖浓度，即患者近8～12周的血糖控制情况。因此，糖化血红蛋白作为糖尿病标志物，在临床检查中进行日常测定作为血糖控制的指标。

目前临床实验室所采用的糖化血红蛋白检测方法中，高效液相离子层析法测定HbA1c使其准确性和重复性得到很大的提高，被公认为金标准。但是，高效液相色谱在分析糖化血红蛋白时，往往需要经过较为复杂的前处理过程，从而导致检测周期较长，不能满足临床快速定量检测的要求。并且，如果前处理不当，会导致色谱柱寿命缩短，出现定性定量不准的问题。而另一种检测方法，亲和层析法对变异血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对其他方法不敏感，操作简便易行、结果可靠，比较适用于临床随时检测。但目前市面上亲和层析法的试剂参差不齐，其中专利CN104897907A中提出了一种亲和层析法的检测试剂盒，只需2种试剂就可在2-3min内实现HbA1c的检测，但其由于是液体试剂，虽然专利中未提及，该试剂实际是需要在2-8℃运输和储存的，需要额外耗费设备成本；专利CN107153121A提出了一种可以常温储存的层析法糖化血红蛋白试剂盒，但其测试需要使用4种试剂，操作相对繁琐，使用不便。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的亲和层析法糖化血红蛋白检测的缺点和问题，提出了一种糖化血红蛋白检测试剂盒及其检测方法，该检测试剂盒的试剂组成简单，特别的将R1-A试剂通过真空干燥的方法做成干粉，方便常温储存和运输，试剂性能稳定；采用该试剂盒进行检测时，操作简单、快速，准确性高。

本发明的技术方案是：

一种糖化血红蛋白检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：R1-A试剂，R1-B试剂，R2试剂和层析卡；

R1-A试剂的组成成分包括：0.1～0.3mg/L硼酸盐衍生物，0.3～0.45mg/L促溶剂，甲醇和二氯甲烷组合试剂1000mL/L；R1-B试剂的组成成分包括：1～5g/L甘氨酰胺盐酸盐，10～50g/L 3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐，0.1～10g/L表面活性剂，1～10g/L硫酸钠，0.1～1g/L氯化锌，1～25g/L氯化钠，3～15g/L硫酸镁；R2试剂的组成成分包括：0.5～5g/L吗啉乙磺酸，5～50g/L三羟甲基氨基甲烷，0.1～10g/L表面活性剂，1～25g/L氯化钠，0.1～0.2g/LProclin300，0.1～5g/L硫酸钠，0.01～10g/L乙二胺二乙酸二钠盐；所述层析卡包括用于保留血红蛋白沉淀的沉淀反应层，和用于吸收未反应液体的吸收层；

主要成分为硼酸盐衍生物的R1-A试剂以及用于复溶R1-A试剂的R1-B试剂组合使用，其作用为用于裂解红细胞、释放并结合糖化血红蛋白、沉淀总血红蛋白；R2试剂是用于洗脱未与糖化血红蛋白结合的多余的硼酸盐衍生物；

其中，所述R1-A试剂为干粉，该干粉的制备不能进行普通的冻干制备，因为冻干会影响该试剂的性能，使之不易复溶，影响测定结果。考虑到该试剂本身的性能，经过考察和筛选，我们发现使用易挥发的甲醇和二氯甲烷组合可以溶解R1-A的主要成分硼酸盐衍生物，并且易烘干、好复溶，不影响后期使用效果，为了增加该试剂的复溶效果，还加入了促溶剂，促溶剂优选为N-乙烯基酰胺类聚合物；

将硼酸盐衍生物及促溶剂充分溶解于甲醇和二氯甲烷混合试剂中，200μL/支分装于棕色圆底离心管，置于专用烘干试剂架上45℃真空干燥2～4h得到干粉，常温储存，备用。

进一步的，所述层析卡还包括塑料外壳，所述塑料外壳分为上壳和下壳，所述上壳中间部位设置有加样孔；所述塑料外壳内置所述沉淀反应层和吸收层。

进一步的，所述硼酸盐衍生物的含量为100～300mg/L，所述硼酸衍生物的结构式如下：

其中，R应满足具有磺酸基和氨基，其碳原子数为12～18。

进一步的，所述表面活性剂为Tween20、Tween80或Tween X-100中的一种或多种。

进一步的，所述沉淀反应层选用孔径小于1μm的玻璃纤维膜或聚丙烯纤维素膜；所述吸收层的材料为吸附性能好的材质。

层析卡主要包括塑料外壳和内置的沉淀反应层和吸收层，其中沉淀反应层在上，用于保留沉淀的总血红蛋白和与R1-A、R1-B试剂结合的糖化血红蛋白，选用孔径小于1μm的玻璃纤维膜或聚丙烯纤维素膜；吸收层在沉淀反应层之下，用于吸收未与沉淀反应层结合的试剂和水分；沉淀反应层和吸收层大小相同，吸收层选用吸附性能较好的材质即可，可以选用普通的吸水效果较好的滤纸或者吸水纸。

塑料外壳分上壳和下壳，上壳中间部位有圆形加样孔，滴加样本之后，检测时将层析卡加样孔对准仪器检测槽，进行检测。

进一步的，所述试剂盒还包括圆底棕色离心管、试剂瓶、铝箔袋和毛细采血管。圆底棕色离心管用于盛装R1-A试剂，棕色离心管和层析卡一起装在铝箔袋内，用以避光防潮。

其中，离心管需选用圆底离心管，可避免尖底造成的底部固体聚集复溶慢的问题，其材质为PP塑料；此外试剂盒还包括2个塑料透明试剂瓶，分别用于盛装R1-B试剂和R2试剂；毛细血管用于定量吸取样本加样。

一种基于权利要求1至6所述的糖化血红蛋白检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

(1)取一支R1-A试剂干粉，加入适量的R1-B试剂，上下颠倒10～15次左右，保证充分溶解，得到R1-A和R1-B的复合检测试剂；

(2)将待测全血样本加入上述充分溶解好的R1-A和R1-B的复合检测试剂中，上下颠倒10～15次，充分混匀，于室温下静置，得到反应液；

(3)移取上述反应液滴加到层析卡中间的加样孔内；待充分吸收后，再移取R2试剂滴加在层析卡中间的加样孔内；

(4)待步骤(3)充分吸收后，将层析卡置于糖化血红蛋白分析仪上进行检测。

本发明的有益效果：

本发明所提供的一种糖化血红蛋白检测试剂盒该检测试剂盒的试剂组成简单，特别的将R1-A试剂通过真空干燥的方法做成干粉，方便常温储存和运输，并通过添加促溶剂以及离心管形状、材质的选择等方式，优化解决了复溶不稳定和不易溶解的问题，试剂性能稳定；该试剂盒操作简单，准确性高；

基于采用该试剂盒所进行的检测方法，操作简单、快速：5μL全血，2-3min即可出结果；特异性强，不受异常血红蛋白的干扰，广泛适用于多种场景的临床快速检测；检测结果与HPLC法高度相关，R

附图说明

图1为本发明所提供的检测方法与高效液相色谱法的测值比对图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

检测试剂盒：

R1-A试剂：

上述硼酸盐衍生物的R包含有磺酸基和氨基，带有两个苯环，碳原子数为12；

充分溶解后按200Ul/支分装到圆底棕色离心管中，置于专用离心管架上，然后放入提前45℃预热好的真空干燥箱中，烘干3h，取出扣盖，做好标识，常温储存，备用；

R1-B试剂：

配制完成后，按5mL/瓶分装到预先准备好的试剂瓶中，做好标识，常温储存备用。

R2试剂：

层析卡：

将玻璃纤维膜或聚丙烯纤维素膜，以及吸水纸裁切成合适尺寸，按照纤维膜在上，吸水纸在下的顺序扣入塑料外壳下壳的卡槽内，其中膜中间需对准上壳中间的加样孔，上下壳紧扣即可得到层析卡。

检测方法：

(1)取一支R1-A试剂干粉，加入200μLR1-B试剂，上下颠倒10次左右，保证充分溶解，得到R1-A和R1-B的复合检测试剂；

(2)用毛细采血管吸取5μL全血样本，加入上述充分溶解好的R1-A、R1-B复合检测试剂中，上下颠倒10次，充分混匀，于室温下静置2min，得到反应液；

(3)用移液器吸取25μL上述反应液滴加到层析卡中间的加样孔内；待约5～10s充分吸收后，再吸取25μL R2试剂滴加在层析卡中间的加样孔内；

(4)待约5～10s后充分吸收，将层析卡置于糖化血红蛋白分析仪上进行检测，即可得到糖化血红蛋白的值。

实施例2

检测试剂盒：

R1-A试剂：

上述硼酸盐衍生物的R的结构为：含有一个氨基的苯环，连接两个碳链，其中一个碳链的碳原子数为9并连接一个磺酸基；

充分溶解后按200Ul/支分装到圆底棕色离心管中，置于专用离心管架上，然后放入提前45℃预热好的真空干燥箱中，烘干2h，取出扣盖，做好标识，常温储存，备用；

R1-B试剂：

配制完成后，按5mL/瓶分装到预先准备好的试剂瓶中，做好标识，常温储存备用。

R2试剂：

层析卡：

将玻璃纤维膜或聚丙烯纤维素膜，以及吸水纸裁切成合适尺寸，按照纤维膜在上，吸水纸在下的顺序扣入塑料外壳下壳的卡槽内，其中膜中间需对准上壳中间的加样孔，上下壳紧扣即可得到层析卡。

检测方法：

(1)取一支R1-A试剂干粉，加入200μLR1-B试剂，上下颠倒10次左右，保证充分溶解，得到R1-A和R1-B复合检测试剂；

(2)用毛细采血管吸取5μL全血样本，加入上述充分溶解好的R1-A和R1-B复合检测试剂中，上下颠倒10次，充分混匀，于室温下静置2min，得到反应液；

(3)用移液器吸取25μL上述反应液滴加到层析卡中间的加样孔内；待约5～10s充分吸收后，再吸取25μL R2试剂滴加在层析卡中间的加样孔内；

(4)待约5～10s后充分吸收，将层析卡置于糖化血红蛋白分析仪上进行检测，即可得到糖化血红蛋白的值。

试验例

将本发明试剂盒常温存放12个月的月末，将上述实施例1和2的检测结果与高效液相色谱法的测值进行比对，结果如下表1所示：

表1实施例1和2的检测结果与高效液相色谱法的测值比对数据

通过上述表格数据可得出，该试剂盒在常温放置的条件下，性能稳定，与高效液相色谱法测值一致性较高。

上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，凡在本发明的内容范围内所做出的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的专利保护范围之内。