一种复合载药核壳微载体的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种复合载药核壳微载体的制备方法及应用。

背景技术

纤维素作为一种几乎取之不尽用之不竭的物质，是最关键的天然材料，在医学、生命科学等领域发挥着举足轻重的作用。目前，纳米纤维素作为纤维素的代表产品，因其具有高长径比、生物相容性、低毒性和生物降解性等超强性能，引起了人们的极大关注。纳米纤维素晶体是纳米纤维素家族的一员，是由天然纤维素硫酸水解制备的纳米纤维素晶体。目前，纳米纤维素晶体在细胞支架、修复皮肤或骨组织等方面有许多重要的发现。然而，大多数研究都通过调整其物理化学特征，或将其作为补强添加剂来开发基于纳米纤维素晶体的生物材料。本身纳米纤维素晶体水凝胶在调控活性物质（如促进伤口愈合的生长因子）递送方面的价值很少被研究。

鉴于鸡尾酒疗法和联合给药处理的显著优势，我们提出了一种具有可持续释放活性分子能力的基于纳米纤维素晶体/海藻酸盐的一种复合载药核壳微载体，并将其用于促进伤口愈合。核壳微载体在细胞生化反应、组织工程和活性物的共同递送方面表现出突出的潜力。然而，以往的研究大多是生产具有相同成分和不可改变结构的核壳微载体，限制了其在药物缓释方向的发挥。值得注意的是，微流控技术作为一种先进的技术，可以精确控制和操纵微通道内的微量流体，是生成具有可调节尺寸和结构的功能性微载体的有力工具。

因此，在本发明中，我们通过微流控电喷制造了复合载药核壳微载体，并研究了它们在伤口愈合中的实际效果。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种复合载药核壳微载体的制备方法及应用。

本发明采用以下技术方案：

一种复合载药核壳微载体的制备方法，包括以下步骤：

S1、纳米纤维素晶体微球的制备

将纳米纤维素晶体分散在去离子水中，并加入药物，搅拌均匀得到澄清的预凝胶溶液；将预凝胶溶液装入注射器中，通过单通道装置流出，在电场的作用下，单通道装置流出的液滴变形，形成泰勒锥体；通过氯化钙溶液收集上述液滴，使液滴凝胶固化，获得纳米纤维素晶体微球；

S2、复合载药核壳微载体的制备

配制海藻酸钠溶液，将抗生素溶解于海藻酸钠溶液中，将S1中得到的纳米纤维素晶体微球与海藻酸钠溶液混合并搅拌均匀；将上述混合溶液装入注射器中，通过单通道装置流出，在电场的作用下，单通道装置流出的液滴变形，形成泰勒锥体；通过氯化钙溶液收集上述液滴，使液滴凝胶固化，最终获得复合载药核壳微载体。

进一步的，S1中，所述纳米纤维素晶体分散在去离子水中的浓度为2mg/ml；所述氯化钙溶液的浓度为0.01mg/ml，电场强度在7 KV以上。

进一步的，S2中，所述海藻酸钠溶液的浓度为2mg/ml；所述氯化钙的浓度为2mg/ml，电场强度在7 KV以上。

进一步的，S1中，可通过改变电场强度或预凝胶溶液流出速度来调整纳米纤维素晶体微球的尺寸。

进一步的，纳米纤维素晶体微球的尺寸随着电场强度的增大而减小，随着预凝胶溶液流出速度的增大而增大。

进一步的，S2中，可通过改变电场强度或预凝胶溶液流出速度来调整复合载药核壳微载体的尺寸。

进一步的，复合载药核壳微载体的尺寸随着电场强度的增大而减小，随着混合溶液流出速度的增大而增大。

进一步的，所述复合载药核壳微载体内包裹的纳米纤维素晶体微球数量为一个或者多个。

本发明还提供一种复合载药核壳微载体，是通过上述制备方法制备而成。

本发明还提供一种复合载药核壳微载体在促进创面愈合技术领域中的应用。

本发明的有益效果：

（1）本发明以电喷微流控制备核壳微载体，方法简单，操作方便，价格低廉，可重复利用，无需要很高的技术要求，且易对微载体的结构和大小进行控制，实现内核与外壳的复合载药；

（2）本发明设计了分级缓释抗生素和生长因子的核壳微载体，实现了长时间给药和药物缓释，实用性强；

（3）本发明制备的核壳微载体生物相容性好，具有良好的抗菌、促血管生成的功能，可用于促进创面修复。

附图说明

图1为本发明复合载药核壳微载体制备过程示意图；图A从左向右依次为从天然木材来源的微晶纤维素通过硫酸水解获得纳米纤维素晶体，再将纳米纤维素晶体分散液与生长因子混合置于电喷微流控装置中制备搭载生长因子的纳米纤维素晶体微球，随后将载药微球与混有抗生素的海藻酸钠溶液混合，再通过电喷微流控制备复合载药的核壳微球；图B从左向右依次为遭受损伤的创面，将分级缓释抗生素和生长因子的核壳微载体覆盖于创面，微载体可被降解从而释放搭载的活性分子发挥抗菌和促血管生成的作用，从而促进创面的修复；

图2本发明制备的纳米纤维素晶体微球；其中，图a为尺寸均一的微球实物图，插图为微球整体外观的电镜图，图b为微球表面多孔结构的电镜图，图c为微球内部多孔结构的电镜图，图d为微球尺寸大小与微流体流速的关系，图e为微球尺寸大小与电场强度的关系，图f为微球的单分散性统计；

图3为本发明所制备的复合载药核壳微载体；其中，图a到c分别为包裹单核、双核和多核的核壳微载体实物图；图d到f为不同微载体对应的内核和外壳的尺寸大小；图g到i为包裹单核、异型双核和异型多核的不同内核的核壳微载体实物图；

图4为生物相容性测试结果；其中，图a到c分别为空白组、试验组和对照组与细胞共培养1到3天的染色图；图d到f分别空白组、试验组和对照组与细胞共培养1到3天的明场图；图g为空白组、试验组和对照组与细胞共培养1-3天的OD值分析；

图5为核壳微载体的缓释效果；其中，图a从左向右依次为空白组、对照组和试验组对大肠杆菌的杀菌作用；图b从左向右依次为空白组、对照组和试验组对金黄色葡萄球菌的杀菌作用；图c从左向右依次为空白组、对照组和试验组对人脐静脉内皮细胞的促血管生成作用；

图6复合载药核壳微载体促创面修复效果；其中，图a从上到下依次为空白组、对照组1、对照组2、对照组3、试验组从造模至第7天创面愈合的情况；图b为每组第7天对应的创面取材的HE染色结果。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

本发明提供一种复合载药核壳微载体的制备方法，包括以下步骤：

S1、搭载生长因子纳米纤维素晶体微球的制备

将纳米纤维素晶体分散在去离子水中，并加入促血管生成生长因子VEGF，搅拌均匀得到澄清的预凝胶溶液；将预凝胶溶液装入注射器中，通过单通道装置流出，在电场的作用下，单通道装置流出的液滴变形，形成泰勒锥体；通过氯化钙溶液收集上述液滴，使液滴凝胶固化，获得纳米纤维素晶体微球；所述纳米纤维素晶体分散在去离子水中的浓度为2mg/ml；所述氯化钙溶液的浓度为0.01mg/ml，便于后续洗净残留的氯化钙，防止纳米纤维素微球表面残余的氯化钙与海藻酸钠溶液反应成胶。可通过改变电场强度或预凝胶溶液流出速度来调整纳米纤维素晶体微球的尺寸，在同一参数下，获得的纳米纤维素晶体微球尺寸、形状基本一致。纳米纤维素晶体微球的尺寸随着电场强度的增大而减小，随着预凝胶溶液流出速度的增大而增大，具体的，电场强度设置在7 KV以上。

S2、复合载药核壳微载体的制备

配制海藻酸钠溶液，将药物溶解于海藻酸钠溶液中，将S1中得到的纳米纤维素晶体微球与海藻酸钠溶液混合并搅拌均匀；将上述混合溶液装入注射器中，通过单通道装置流出，在电场的作用下，单通道装置流出的液滴变形，形成泰勒锥体；通过氯化钙溶液收集上述液滴，使液滴凝胶固化，最终获得复合载药核壳微载体；所述海藻酸钠溶液的浓度为2mg/ml；所述氯化钙的浓度为2mg/ml；通过改变电场强度或预凝胶溶液流出速度来调整复合载药核壳微载体的尺寸，在同一参数下，获得的微载体尺寸、形状基本一致；复合载药核壳微载体的尺寸随着电场强度的增大而减小，随着混合溶液流出速度的增大而增大，电场强度在7 KV以上。

需要说明的是，随着复合载药核壳微载体的尺寸的增加，复合载药核壳微载体内包裹的内核（纳米纤维素晶体微球）的数量也随之增加，可以获得包裹单核、双核、多核的不同内核数量的核壳微载体。

除此之外，本发明可通过将不同种类的药物与纳米纤维素晶体混合制备形成不同种类的纳米纤维素晶体微球；将海藻酸钠溶液与不同种类的纳米纤维素晶体微球进行混合，可获得包裹单核、异型双核和异型多核的不同内核的复合载药核壳微载体，从而可以调控复合载药核壳微载体的结构和成分。

实施例1

S1、搭载生长因子纳米纤维素晶体微球的制备

如图1所示，将制备好的纳米纤维素晶体分散在去离子水中，纳米纤维素晶体在去离子水中的浓度为2mg/ml；随后将促血管生成生长因子VEGF(1ml*0.1ug/ml) 溶解于分散好的纳米纤维素晶体溶液中，将混合物剧烈搅拌30分钟，得到澄清无浑浊的预凝胶溶液；将预凝胶溶液装入注射器中，通过单通道装置流出；采用电压发生器提供不同的电压并形成电场，在电场的作用下，单通道装置流出的液滴变形，形成泰勒锥体；通过0.01mg/ml的氯化钙溶液收集上述液滴，可立即发生纳米纤维素晶体的凝胶化，获得纳米纤维素晶体微球，实物如图2所示。

S2、复合载药核壳微载体的制备

配制2%（w/v）海藻酸钠溶液，将盐酸多西环素 (1ml*0.1mg/ml)溶解于海藻酸钠溶液中，将S1中得到的纳米纤维素晶体微球与海藻酸钠溶液混合，剧烈搅拌3小时，使纳米纤维素微球均匀分散在海藻酸钠溶液中；将上述混合溶液装入注射器中，通过单通道装置流出，在电场的作用下，单通道装置流出的液滴变形，形成泰勒锥体；通过2% (wt)的氯化钙溶液收集上述液滴，使液滴凝胶固化，最终获得复合载药核壳微载体，如图3所示。

对比例1

海藻酸钠微载体的制备：

配制2%（w/v）海藻酸钠溶液，装入注射器中，通过单通道装置流出，在电场的作用下，单通道装置流出的液滴变形，形成泰勒锥体，通过2% (wt)的氯化钙溶液收集上述液滴，使液滴凝胶固化，最终获得海藻酸钠凝胶微载体。

试验例1——复合载药核壳微载体的生物学作用的研究

为了验证本发明所制备的复合载药核壳微载体的生物学作用，进行分组研究测定。

试验组：实施例1所制备的复合载药核壳微载体；

对照组：对比例1所制备的海藻酸钠凝胶微载体；

空白组：空白处理。

（1）复合载药核壳微载体的生物相容性

将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在M199(Gibco, US)中用10% (w/v)胎牛血清培养，周围为5%的CO

（2）复合载药核壳微载体的抗菌性

根据McFarland标准，制备浊度为0.5左右的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌悬浮液。随后，将100 𝜇L细菌悬浮液加入到24孔板中，共分为三组，分别对应本发明试验组、对照组和空白组。与细菌共培养24小时之后，取出菌液，用SYTO和碘化丙啶(PI)染色，结果如图5所示。其中，图a从左向右依次为空白组、对照组和试验组对大肠杆菌的杀菌作用；图b从左向右依次为空白组、对照组和试验组对金黄色葡萄球菌的杀菌作用。

（3）复合载药核壳微载体的促血管生成性

用M199(Gibco，美国)与10%(w/v)胎牛血清作为培养基。经过2到3次传代后，往24孔板内每孔播种4×105个细胞/ml，共分为三组，分别对应本发明空白组、对照组和试验组。培养24h后，用钙黄绿素(Calcein-AM(Molecular Probes Co.))染色，结果如图5所示，图c从左向右依次为空白组、对照组和试验组对人脐静脉内皮细胞的促血管生成作用。

试验例2——复合载药核壳微载体的促创面修复效果的研究

为了验证本发明所制备的复合载药核壳微载体的促创面修复效果，进行分组研究测定。

试验组：实施例1所制备的复合载药核壳微载体干预；

空白组：磷酸盐缓冲液干预；

对照组1：对比例1所制备的海藻酸钠凝胶微载体干预；

对照组2：盐酸多西环素 (1ml)和促血管生成生长因子VEGF (1ml)干预；

对照组3：抗生素载药的海藻酸钠凝胶微载体干预。

（1）动物造模

大鼠经腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉（0.5ml/100g），然后在大鼠背部减去直径为1cm的圆形皮肤全层，并在皮肤缺损部位注射100μl金黄色葡萄球菌悬浮液（0.5麦氏浊度）。

（2）创面干预

雄性SD 大鼠15只，体重200～250g，随机分为5 组，按照上述造模方法进行造模。随后分别进行5组干预（试验组、空白组、对照组1~3），外面贴上医用透明敷料保护，于7天取标本进行HE染色。结果见图6，其中，图a从上到下依次为空白组、对照组1、对照组2、对照组3、试验组从造模至第7天创面愈合的情况；图b为每组第7天对应的创面取材的HE染色结果。结果显示，本发明所制备的复合载药核壳微载体组创面愈合最佳，肉芽厚度最厚。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。