一种农杆菌介导的苔藓的稳定遗传转化方法

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域，具体涉及一种以农杆菌介导的苔藓稳定遗传转化的方法。

背景技术

苔藓植物(bryophytes)是现存最早的陆生植物，是一类由水生向陆生过渡的高等植物类群，是高等植物中最低等的类群，他们植物体矮小，无维管组织，也没有花的结构，在分类学上界于藻类(algae)和蕨类(pteridophytes)之间，具有独特的进化地位。苔藓生长周期短，易于培养，可作为研究基因功能的重要材料。

小立碗藓(Physcomitrella patens)是葫芦藓目(Funariales)葫芦藓科(Funariaceae)小立碗藓属(Physcomitrium)的藓类。以小立碗藓为对象开展的基因组学和分子生物学研究发现，为适应陆地生活，小立碗藓获得耐干旱基因、耐高温基因、感光基因、紫外修复基因等陆地胁迫响应基因(Rensing,Lang et al.2008)。此外，还具有易培养、生活周期短、基因组与外源基因具有极高的同源重组率、生活史中单倍体的配子体阶段占优势、基因敲除后突变表型易于观察等独特的研究优势(Schaeferand1997)。而且由于其抗逆能力极强，能经历长期脱水而迅速恢复再生，对于研究植物抗逆性形成机制和进化意义非常有价值(Hiss,Laule et al.2014)。然而作为转基因材料的主要来源以PEG介导的原生质体转化。

银叶真藓(Bryum argenteum)作为真藓属的模式种，分布广泛，生长在有机质丰富及肥沃的土壤上和喜阴湿暗潮的环境，是高山冻原植被的重要组成部分也是有最高耐干旱等级的植物。它具有极强的抗旱、耐盐、抗高温等综合抗性，是植物抗逆尤其是耐干机制研究的理想材料。获得转基因植株是开展该种相关抗逆基因的筛选与深入挖掘,对于开发利用抗逆基因资源和深入理解该种的耐干机制均有重要的意义。但是目前关于银叶真藓的遗传转化方法还未见有任何报道。

农杆菌包括根癌农杆菌和引起发根病的发根农杆菌。在农杆菌介导的转化中，80％左右是由根癌农杆菌介目前已有许多双单子叶植物，如烟草、马铃薯、番茄、拟南芥、水稻，小麦，玉米等被成功转化，并得到转基因植株。植物常用的遗传转化方法PEG法、基因枪法、电击法都已有在苔藓植物中的应用的报导。其中关于农杆菌介导的小立碗藓与银叶真藓植株的遗传转化方法的应用在国内外还未见报道。Baur和schaefer曾认为苔藓不是农杆菌的寄主。施定基等也认为用农杆菌介导的转化技术并不能成功的应用于苔藓。冷泉港实验手册上已发表利用农杆菌介导法将外源基因导入苔藓的方法。但是目前还没有转化成功的实例。本文主要研究内容是利用农杆菌介导法将载体pCAMBIA1301-GUS导入苔藓中获得转基因植株。参考文献：

Nasu M,Tani K,Hattori C,et al.Effecient Transformation of Marchantiapolymorpha That is Haploid and Has Very Small Genome DNA[J].Journal ofFermentation&Bioengineering,1997,84(6):519-523.

Ishizaki K,Chiyoda S,Yamato K T,et al.Agrobacterium-mediatedtransformation of thehaploid liverwort Marchantia polymorpha L.an emergingmodel for plant biology.[J].Plant&Cell Physiology,2008,49(7):1084.

Baur A,Kaufmann F,Rolli H,et al.A fast and flexible PEG-mediatedtransient expressionsystem in plants for high level expression of secretedrecombinant proteins.[J].Journal ofBiotechnology,2005,119(4):332.

Schaefer D G,Bisztray G,Zrd J P.Genetic Transformation of the MossPhyscomitrellapatens[M]//Plant Protoplasts and Genetic Engineering V.SpringerBerlin Heidelberg,1994:245-52.

施定基,冉亮,宁叶,等.苔藓分子生物学的一些进展[J].贵州科学,2001(4):1-5.

Hiss,M.,et al.(2014)."Large-scale gene expression profiling data forthe model moss Physcomitrella patens aid understanding of developmentalprogression,culture and stress conditions."

Rensing,S.A.,et al.(2008)."The Physcomitrella genome revealsevolutionary insights into the conquest of land by plants."

发明内容

本发明目的在于，提供一种农杆菌介导的苔藓的稳定遗传转化方法，该方法涉及苔藓为小立碗藓Physcomitrella patens和银叶真藓Bryum argenteum的原丝体或配子体，采用苔藓原丝体及配子体的培养，遗传转化及共培养，筛选培养及鉴定。以苔藓原丝体及配子体作为侵染材料，用携带目标基因的农杆菌工程菌液灌入培养皿中进行遗传转化。将苔藓用农杆菌直接侵染，转化周期短，能够在短时间里获得大量的转基因材料。相比较原生质体转化方法，本方法操作简单易控，周期短，转化效率高，表达强度好，成本低，为基因功能研究打下了基础。

本发明所述的一种农杆菌介导的苔藓稳定遗传转化方法，按下列步骤进行：

苔藓原丝体及配子体的培养基的配置：

a、将苔藓小立碗藓Physcomitrella patens和银叶真藓Bryum argenteum的原丝体或配子体分别放入灭菌的50毫升离心管中，加无菌水，用研磨仪研磨1分钟，磨成匀浆状，将苔藓原丝体匀浆液加入常规的PPNH4固体培养基中，培养基上均铺有无菌玻璃纸，生长6天作为转化材料，将配子体加入常规的改良KNOP固体培养基中，培养基上均铺有无菌玻璃纸，生长30天作为转化材料；

农杆菌转化和共培养：

b、将含有目的基因的农杆菌单菌落放入农杆菌培养液中，于温度28℃，200rpm下震荡培养，待农杆菌菌液OD值为0.4-0.6时，以5500rpm，离心10分钟，收集菌体，再用以农杆菌培养液同体积的pH值为5.5的AB:MES重悬菌体，于温度28℃，200rpm的培养箱中培养12小时，以5500rpm，离心10分钟，收集重悬菌体，按体积比1:1的KNOP与AB:MES制成KNOP与AB:MES混合液，其中混合液中的乙酰丁香酮终浓度为200mM，再次重悬农杆菌菌液OD值至0.6作为侵染液；

侵染与共培养：

c、将步骤a培养好的苔藓原丝体或配子体培养皿中加入步骤b得到的侵染液，将侵染液浸没苔藓，放置30分钟后吸出菌液，用保鲜膜封口，将培养皿放置在温度24℃黑暗条件下处理3天，黑暗培养结束后正常光照下培养一周后筛选培养；

苔藓的筛选培养：

d、将正常培养条件下培养7天的原丝体或者配子体加入2毫升的含有75微克每升潮霉素的无菌水筛选15天后进行检测，筛选后存活的苔藓为转基因成功的材料。在此培养期间，若发现有农杆菌污染的苔藓，可用无菌水清洗后再加入筛选液；

抗性原丝体诱导分化成配子体：

e、经步骤d筛选后的抗性原丝体转入改良KNOP固体培养基中，正常条件下培养4至5周，至生长出苔藓配子体。

本发明所述的一种农杆菌介导的苔藓稳定遗传转化方法，该方法中的培养基及AB:MES配方为：

AB:MES：17.2mM K

改良Knop培养基：Ca(NO

Altemative TES(xl000)/L：CuSO

PpNH4培养基：

PPNH4培养基：1×溶液A，1×溶液B，1×溶液C，1×alternative TES,2.7mMC

(a)溶液A(100×):0.5M Ca(NO

(b)溶液B(100×):0.1M MgSO

(c)溶液C(100×):184mM KH

通过本发明所述方法获得的苔藓原丝体或配子体，经转基因植株分子检测：

取苔藓材料，用DNA和RNA提取试剂盒提取DNA和RNA通过PCR和qRT-PCR检测目的基因片段是否成功导入植株。

附图说明

图1为本发明筛选30天后的小立碗藓由原丝体长出的配子体；

图2为本发明筛选培养后的小立碗藓原丝体GUS染色；

图3为本发明筛选培养后的小立碗藓配子体的GUS染色；

图4为本发明筛选培养后的银叶真藓原丝体的GUS染色；

图5为本发明筛选培养后的银叶真藓配子体的GUS染色；

图6为本发明转化植株的PCR检测，其中泳道1表示Maker，泳道2表示的转基因小立碗藓原丝体，泳道3表示的是转基因小立碗藓配子体植株，泳道4表示的是转基因银叶真藓原丝体，泳道5表示的是转基因银叶真藓配子体植株，泳道6表示的是野生型小立碗藓，泳道7表示的是野生型银叶真藓；

图7为本发明转化小立碗藓的RT-qPCR检测，WT表示的野生型小立碗藓植株，Line表示转基因植株；

图8为本发明转化银叶真藓的RT-qPCR检测，WT表示的是野生型银叶真藓植株，Line表示转基因植株。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进一步说明，但不仅限于本发明的范围，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中的化学药品可市购。

实施例1

小立碗藓的遗传转化的方法，具体操作按下列步骤进行：

小立碗藓原丝体培养：

a、在实验室培养小立碗藓原丝体，采用研磨法，取小立碗藓原丝体放入灭菌的50毫升离心管中，加入20ml的无菌水，用研磨仪研磨1分钟，磨成匀浆状，吸取2ml的小立碗藓原丝体匀浆液加入常规的PPNH4固体培养基中，培养基上均铺有无菌玻璃纸，用3M透气膜封口，生长6天作为转化材料。

农杆菌的培养：

b、将含有目的基因的农杆菌单菌落放入农杆菌培养液中，于温度28℃，200rpm下震荡培养，待农杆菌菌液OD值为0.4-0.6时，以5500rpm，离心10分钟，收集菌体，再用以农杆菌培养液同体积的pH值为5.5的AB:MES重悬菌体，于温度28℃，200rpm的培养箱中培养12小时，以5500rpm，离心10分钟，收集重悬菌体，按体积比1:1的KNOP与AB:MES制成KNOP与AB:MES混合液，其中混合液中的乙酰丁香酮终浓度为200mM，再次重悬农杆菌菌液OD值至0.6作为侵染液；

侵染与共培养：

c、将步骤a培养好的小立碗藓原丝体培养皿中加入5ml步骤b得到的侵染液，将侵染液浸没苔藓，放置30分钟后吸出菌液，用保鲜膜封口，将培养皿放置在温度24℃黑暗条件下处理3天，黑暗培养结束后正常光照下培养一周后筛选培养；

小立碗藓原丝体的筛选培养：

d、将正常培养条件下培养7天的小立碗藓原丝体培养皿中加入2ml的含有75微克/L潮霉素的无菌水筛选液,筛选15天后进行检测，筛选后存活的苔藓为转基因成功的材料,在此培养期间，若发现有农杆菌污染的苔藓，可用无菌水清洗后再加入筛选液；

抗性原丝体诱导分化成配子体：

e、经步骤d筛选后的抗性原丝体可转入改良KNOP固体培养基中，正常条件下培养4至5周，至生长出抗性苔藓配子体。

转基因植株分子检测：

取步骤d或步骤e中的小立碗藓材料，用OMEGA DNA和RNA提取试剂盒提取DNA和RNA通过PCR及qPCR检测目的基因片段是否成功导入植株，最后又对转基因植株继代后进行了GUS基因检测，结果见图2。

实施例2

小立碗藓的遗传转化的方法，具体操作按下列步骤进行：

小立碗藓配子体的培养：

a、在实验室培养小立碗藓配子体，采用研磨法，取小立碗藓配子体0.1g放入灭菌的50ml离心管中，加入20ml的改良KNOP液体培养基，用研磨仪研磨1分钟，磨成匀浆状，吸取2ml的配子体匀浆液加入常规的改良KNOP固体培养基中，培养基上均铺有无菌玻璃纸，生长30天作为转化材料；

农杆菌的培养：

b、将含有目的基因的农杆菌单菌落放入农杆菌培养液中，于温度28℃，200rpm下震荡培养，待农杆菌菌液OD值为0.4-0.6时，以5500rpm，离心10分钟，收集菌体，再用以农杆菌培养液同体积的pH值为5.5的AB:MES重悬菌体，于温度28℃，200rpm的培养箱中培养12小时，以5500rpm，离心10分钟，收集重悬菌体，按体积比1:1的KNOP与AB:MES制成KNOP与AB:MES混合液，其中混合液中的乙酰丁香酮终浓度为200mM，再次重悬农杆菌菌液OD值至0.6作为侵染液；

侵染与共培养：

c、将步骤a培养好的小立碗藓配子体培养皿中加入5ml步骤b得到的侵染液，将侵染液浸没苔藓，放置30分钟后吸出菌液，用保鲜膜封口，将培养皿放置在温度24℃黑暗条件下处理3天，黑暗培养结束后正常光照下培养一周后筛选培养；

小立碗藓配子体的筛选培养：

d、将正常培养条件下培养7天的小立碗藓配子体培养皿中加入2ml的含有75微克/L潮霉素的无菌水筛选液,筛选15天后进行检测，筛选后存活的苔藓为转基因成功的材料,在此培养期间，若发现有农杆菌污染的苔藓，可用无菌水清洗后再加入筛选液；

转基因植株分子检测：

取d中的小立碗藓配子体材料，用OMEGA DNA和RNA提取试剂盒提取DNA和RNA通过PCR及qPCR检测目的基因片段是否成功导入植株，最后又对转基因植株继代后进行了GUS基因检测，结果见图3。

实施例3

银叶真藓的遗传转化的方法，具体操作按下列步骤进行：

银叶真藓原丝体培养：

a、在实验室培养银叶真藓原丝体，采用研磨法，取银叶真藓原丝体0.1g放入灭菌的50ml离心管中，加入20ml的改良KNOP液体培养基，用研磨仪研磨1分钟，磨成匀浆状，吸取2毫升的匀浆液加入PPNH4培养基上，用3M透气膜封口，培养6天用作转化材料；

农杆菌的培养：

b、将含有目的基因的农杆菌单菌落放入农杆菌培养液中，于温度28℃，200rpm下震荡培养，待农杆菌菌液OD值为0.4-0.6时，以5500rpm，离心10分钟，收集菌体，再用以农杆菌培养液同体积的pH值为5.5的AB:MES重悬菌体，于温度28℃，200rpm的培养箱中培养12小时，以5500rpm，离心10分钟，收集重悬菌体，按体积比1:1的KNOP与AB:MES制成KNOP与AB:MES混合液，其中混合液中的乙酰丁香酮终浓度为200mM，再次重悬农杆菌菌液OD值至0.6作为侵染液；

侵染与共培养：

c、将步骤a培养好的银叶真藓原丝体培养皿中加入5ml步骤b得到的侵染液，将侵染液浸没苔藓，放置30分钟后吸出菌液，用保鲜膜封口，将培养皿放置在温度24℃黑暗条件下处理3天，黑暗培养结束后正常光照下培养一周后筛选培养；

银叶真藓原丝体的筛选培养

d、将正常培养条件下培养7天的银叶真藓原丝体培养皿中加入2ml的含有75微克/L潮霉素的无菌水筛选液,筛选15天后进行检测，筛选后存活的苔藓为转基因成功的材料,在此培养期间，若发现有农杆菌污染的苔藓，可用无菌水清洗后再加入筛选液；

抗性原丝体诱导分化成配子体:

e、经步骤d筛选后的抗性原丝体转入改良KNOP固体培养基中，正常条件下培养4至5周，至生长出苔藓配子体；

转基因植株分子检测：

取步骤d或步骤e中的银叶真藓材料，用DNA和RNA提取试剂盒提取DNA和RNA通过PCR及对GUS基因进行RT-qPCR检测目的基因片段是否成功导入植株，最后又对转基因植株继代后进行了GUS基因检测，结果见图4。

实施例4

银叶真藓的遗传转化的方法，具体操作按下列步骤进行：

银叶真藓配子体培养：

a、在实验室培养银叶真藓配子体，是将生长状态好的银叶真藓配子体分成4-5份更小的组织，放置在改良固体KNOP培养基上，培养基上均铺有无菌玻璃纸，培养30天用作转化材料；

农杆菌的培养：

b、将含有目的基因的农杆菌单菌落放入农杆菌培养液中，于温度28℃，200rpm下震荡培养，待农杆菌菌液OD值为0.4-0.6时，以5500rpm，离心10分钟，收集菌体，再用以农杆菌培养液同体积的pH值为5.5的AB:MES重悬菌体，于温度28℃，200rpm的培养箱中培养12小时，以5500rpm，离心10分钟，收集重悬菌体，按体积比1:1的KNOP与AB:MES制成KNOP与AB:MES混合液，其中混合液中的乙酰丁香酮终浓度为200mM，再次重悬农杆菌菌液OD值至0.6作为侵染液；

侵染与共培养：

c、将步骤a培养好的银叶真藓配子体培养皿中加入5ml步骤b得到的侵染液，将侵染液浸没苔藓，放置30分钟后吸出菌液，用保鲜膜封口，将培养皿放置在温度24℃黑暗条件下处理3天，黑暗培养结束后正常光照下培养一周后筛选培养；

银叶真藓配子体的筛选培养

d、将正常培养条件下培养7天的银叶真藓配子体加入2ml的含有75微克/L潮霉素的无菌水筛选液,筛选15天后进行检测，筛选后存活的苔藓为转基因成功的材料,在此培养期间，若发现有农杆菌污染的苔藓，可用无菌水清洗后再加入筛选液；

转基因植株分子检测:

取步骤d的银叶真藓材料，用DNA和RNA提取试剂盒提取DNA和RNA通过PCR及对GUS基因进行RT-qPCR检测目的基因片段是否成功导入植株，最后又对转基因植株继代后进行了GUS基因检测，结果见图5。在统计各实施例中转基因苔藓遗传转化效率见表1；

转基因配子体遗传转化效率＝内含转基因数量/总植株数×100％；

转基因原丝体遗传转化效率＝筛选后原丝体面积/总面积×100％：

表1

从表中可以看出：在实施例1中，小立碗藓原丝体的平均转化效率是67.8％；在实施例2中小立碗藓配子体的转化效率是74.5％；而在实施例3中银叶真藓原丝体平均转化效率是86％；实施例4中银叶真藓配子体的平均转化效率是83.3％。由此说明此方法能够作为苔藓的有效的遗传转化方法。

本发明所述的农杆菌介导的苔藓的遗传转化方法相比于PEG介导的原生生质体转化方法，本发明农杆菌介导的苔藓转化方法可在短时间里获得大量转基因材料，省去繁琐的原生质体制备过程，操作简单。