一种大黄粉指纹图谱的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于中药成分检测的技术领域，涉及一种大黄粉指纹图谱的检测方法及其应用，具体涉及一种大黄粉指纹图谱的检测方法及其大黄粉中14种有效成分的含量测定方法。

背景技术

大黄为我国传统常用中药材，始载于《神农本草经》列为下品，并收录于历版《中国药典》中，其中2015版《中国药典》收载的正品大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄的干燥根及根茎，具有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄的功效。用于实热积滞便秘，血热吐衄，目赤咽肿，痈肿疔疮，肠痈腹痛，瘀血经闭，产后瘀阻，跌打损伤，湿热痢疾，黄疸尿赤，淋证，水肿；外治烧烫伤。

公司重点产品胆宁片在制剂过程中以大黄药材粉碎后的大黄粉作为中间体进行生产加工。但中成药的药材原料粉及制作工艺较复杂，生产过程中容易受各种微生物的污染，影响制剂成品的质量。因此需要对胆宁片中间体大黄粉进行生产灭菌。

中药指纹图谱具有整体、宏观、模糊分析等特点，可通过对中药整体特征的描述，采用适当模糊处理方式，能较全面地反映出其内含化学成分的种类及数量，达到整体质量控制的目的，因此成为中药质量控制的有效手段，已广泛应用于中药质量监测和评价领域。其中色谱指纹图谱分析可以使中药所含多种化学组分的整体特征可视化，从而披露出常规检验难以发现的质量问题。指纹图谱是根据中药多组分、多靶点的整体综合作用的特点，从“全成分”的角度出发的一种现代中药质量控制方法，对非单一成分药物的质量控制更加全面。

大黄药材中化学成分复杂，因此，有必要建立大黄粉的指纹图谱与多成分含量测定，能够完成对大黄粉中成分的定性定量分析，以便对大黄粉进行有效的质量控制。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种大黄粉指纹图谱的检测方法及其应用，采用优化条件的前处理及高效液相色谱方法(UPLC-PDA)，建立了大黄粉的高效液相指纹图谱，从不同侧面突出反映不同类别化学成分对大黄粉指纹图谱系统的贡献。同时，对大黄粉中14种有效成分进行检测，较全面的反映大黄粉中各成分的现状，并控制大黄粉中的微生物水平，为整体控制和评价大黄粉质量提供参考依据。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种大黄粉指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：将大黄粉样品加入有机溶剂溶解，超声提取后冷却，取上清液过滤，取续滤液即得供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：提供对照品溶液，所述对照品溶液包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、番泻苷A对照品和有机溶剂；

3)测定：采用相同色谱条件的高效液相色谱(HPLC)法分别测定供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得大黄粉指纹图谱。

优选地，步骤1)中，所述大黄粉样品为将大黄生药粉碎后获得的粉末样品。

优选地，步骤1)中，所述大黄粉样品在制备供试品溶液前要进行

更优选地，所述

进一步优选地，所述

最优选地，所述

所述

优选地，步骤1)中，所述大黄粉样品加入的重量(g)与所述有机溶剂加入的体积(mL)之比为0.2：20-30。

更优选地，所述大黄粉样品加入的重量(g)与所述有机溶剂加入的体积(mL)之比为0.2∶25。

优选地，步骤1)中，所述有机溶剂为甲醇。

优选地，步骤1)中，所述大黄粉样品加入有机溶剂后需要进行精密称重。

优选地，步骤1)中，所述超声提取时间为40-50min。更优选地，所述超声提取时间为45min。

优选地，步骤1)中，所述超声提取的功率为200-300W，所述超声提取的频率为30-50kHz。更优选地，所述超声提取的功率为250W，所述超声提取的频率为40kHz。

优选地，步骤1)中，所述冷却后需要再称重，并用有机溶剂补足失重。

优选地，步骤1)中，所述上清液取用前要摇匀后静置。

优选地，步骤1)中，所述过滤的方式为滤膜过滤方式。更优选地，所述滤膜的孔径为0.22μm。

优选地，步骤1)中，所述续滤液为过滤液放弃初滤液后所得。

优选地，步骤2)中，所述芦荟大黄素的CAS号为481-72-1，所述大黄酸的CAS号为478-43-3，所述大黄素的CAS号为518-82-1，所述大黄酚的CAS号为481-74-3，所述大黄素甲醚的CAS号为521-61-9，所述芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷的CAS号为33037-46-6，所述芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷的CAS号为50488-89-6，所述大黄酸-8-O-葡萄糖苷的CAS号为113443-70-2，所述大黄素-8-O-葡萄糖苷的CAS号为23313-21-5，所述大黄素-1-O-葡萄糖苷的CAS号为38840-23-2，所述大黄酚-8-O-葡萄糖苷的CAS号为13241-28-6，所述大黄酚-1-O-葡萄糖苷的CAS号为4839-60-5，所述大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷的CAS号为26296-54-8，所述番泻苷A的CAS号为81-27-6。

优选地，步骤2)中，所述对照品溶液中各成分的含量范围为：芦荟大黄素为0.30-75.15μg/ml、大黄酸为0.08-20.06μg/ml、大黄素为0.16-41.22μg/ml、大黄酚为0.99-248.98μg/ml、大黄素甲醚为0.34-84.54μg/ml、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷为0.71-178.39μg/ml、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷为0.12-28.91μg/ml、大黄酸-8-O-葡萄糖苷为0.15-37.85μg/ml、大黄素-8-O-葡萄糖苷为0.13-32.56μg/ml、大黄素-1-O-葡萄糖苷为0.10-25.72μg/ml、大黄酚-8-O-葡萄糖苷为0.60-149.39μg/ml、大黄酚-1-O-葡萄糖苷为0.33-83.27μg/ml、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷为0.26-66.12μg/ml、番泻苷A为0.76-37.94μg/ml。

优选地，步骤2)中，所述有机溶剂为甲醇。

优选地，步骤3)中，所述供试品溶液的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，是根据对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出供试品溶液的指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位。

优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的色谱柱为T3色谱柱。更优选地，所述高效液相色谱法中的色谱柱为ACQUITY UPLC

优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的检测器为光电二极管阵列检测器(PDA)。

优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的柱温为25-35℃。更优选地，所述高效液相色谱法中的柱温为30℃。

优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的进样量为0.5-10μL。更优选地，所述高效液相色谱法中的进样量为1μL。

优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中，流速为0.1-1.0mL/min。更优选地，所述高效液相色谱法中，流速为0.2mL/min。

优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中，检测波长为400-420nm。更优选地，所述高效液相色谱法中，检测波长为410nm。

优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中，流动相为甲醇-0.05-0.2％磷酸水溶液，其中，A相为甲醇，B相为0.05-0.2％磷酸水溶液；分析时间为31min；梯度洗脱。

更优选地，所述高效液相色谱法中，流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液，其中，A相为甲醇，B相为0.1％磷酸水溶液；分析时间为31min；梯度洗脱。

所述0.05-0.2％磷酸水溶液为体积百分数为0.05-0.2％的磷酸水溶液。所述0.1％磷酸水溶液为体积百分数为0.1％的磷酸水溶液。

更优选地，如表1所示，所述梯度洗脱的具体程序为：

0-6min，A相：B相体积比为41：59-45：55；

6-8min，A相：B相体积比为45：55-52：48；

8-14min，A相：B相体积比为52：48-54：46；

14-19min，A相：B相体积比为54：46-69：31；

19-23min，A相：B相体积比为69：31-79：21；

23-25min，A相：B相体积比为79：21-99：1；

25-30min，A相：B相体积比为99：1-100：0；

30-31min，A相：B相体积比为100：0-41：59。

本发明第二方面提供一种大黄粉指纹图谱的检测方法在大黄粉中成分的质量检测中的用途。

本发明第三方面提供一种大黄粉的质量检测方法，包括采用前述大黄粉指纹图谱的检测方法获得大黄粉指纹图谱，将得到的大黄粉指纹图谱与相同指纹图谱检测条件下获得的大黄粉的标准指纹图谱进行相似度比较。

优选地，本发明将测得的大黄粉指纹图谱与大黄粉的标准指纹图谱进行相似度的比较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版软件进行比较。更优选地，本发明测得的大黄粉指纹图谱与大黄粉标准指纹图谱的相似度≥0.99。

更优选地，所述大黄粉指纹图谱与大黄粉的标准指纹图谱进行指纹共有峰的匹配时，对照图谱生成法采用平均数法，时间窗宽度为0.20。

优选地，采用与前述大黄粉指纹图谱的检测方法相同的条件得到大黄粉的标准指纹图谱，所述大黄粉的标准指纹图谱如表1、图1B所示，包括23个共有指纹峰，以10号峰为参照峰(S峰，保留时间为1.0000)，其他22个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰(0.2981±0.0004)、2号峰(0.4762±0.0007)、3号峰(0.5289±0.0008)、4号峰(0.5979±0.0006)、5号峰(0.6571±0.0003)、6号峰(0.7397±0.0005)、7号峰(0.7922±0.0006)、8号峰(0.8770±0.0007)、9号峰(0.9604±0.0005)、11号峰(1.0515±0.0010)、12号峰(1.0826±0.0009)、13号峰(1.1170±0.0009)、14号峰(1.2510±0.0010)、15号峰(1.2770±0.0011)、16号峰(1.3136±0.0012)、17号峰(1.3810±0.0011)、18号峰(1.4387±0.0016)、19号峰(1.5656±0.0015)、20号峰(1.6725±0.0023)、21号峰(1.7415±0.0022)、22号峰(1.7747±0.0022)、23号峰(1.8376±0.0023)。所述23个共有指纹峰占总峰面积的比例达到95％以上。

表1

注：10号峰为定位峰(S峰)

更优选地，所述大黄粉的标准指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，如图1A、图1B所示，定位确定14个指纹峰：所述1号峰为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述2号峰为大黄酸-8-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述5号峰为番泻苷A的指纹峰，所述6号峰为大黄素-1-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述9号峰为大黄酚-1-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述10号峰为大黄酚-8-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述11号峰为芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述12号峰为大黄素-8-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述16号峰为大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述17号峰为芦荟大黄素的指纹峰，所述19号峰为大黄酸的指纹峰，所述21号峰为大黄素的指纹峰，所述22号峰为大黄酚的指纹峰，所述23号峰为大黄素甲醚的指纹峰。

本发明第四方面提供一种大黄粉中14种成分含量的测定方法，包括以下步骤：

a)供试品溶液的制备：与大黄粉指纹图谱的检测方法的步骤1)相同；

b)对照品溶液的制备：与大黄粉指纹图谱的检测方法的步骤2)相同；

c)测定：采用与大黄粉指纹图谱的检测方法中相同色谱条件的高效液相色谱法，分别测定步骤a)的供试品溶液和步骤b)的对照品溶液，并采用外标法计算供试品溶液中14种成分的含量。

优选地，所述外标法是指：分别移取一系列不同体积的步骤b)所述对照品溶液，配成一系列不同浓度的溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，获得对照品溶液中14种成分含量与峰面积的线性关系，以每一种成分色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液采用高效液相色谱仪检测，将获得的供试品溶液中14种成分的色谱峰面积，分别代入所述各标准工作曲线的回归方程中，可得到相应成分的含量。

更优选地，所述标准工作曲线中，以峰面积为纵坐标，以各对照品溶液的含量为横坐标。

本发明中的用水均为纯净水。

如上所述，本发明提供的一种大黄粉指纹图谱的检测方法及其应用，采用优化反应条件的前处理及高效液相色谱方法，建立了大黄粉的高效液相指纹图谱，从不同侧面突出反映不同类别化学成分对大黄粉指纹图谱系统的贡献。同时，对大黄粉中14种有效成分进行检测，较全面的反映大黄粉中各成分的现状，并控制大黄粉中的微生物水平，为整体控制和评价大黄粉质量提供参考依据。本发明首次建立的大黄粉指纹图谱的检测方法，其精密度和重复性良好，确定了23个共有峰，多批次大黄粉样品的相似度评价结果均大于0.99，并能保持供试品溶液在24h内稳定性良好。

本发明提供的方法还能够对大黄粉中14种化学成分(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、番泻苷A)进行了定量分析，实现一次样品分析，同时完成定性和定量分析。

本发明提供的方法还能够对大黄粉进行

本发明建立的高效液相指纹图谱方法首次实现了对大黄粉全方的质量控制，方法简单，稳定、可靠，精密度、重复性好，便于质量控制，为更好地建立大黄粉整体质量控制评价体系提供科学试验依据。

附图说明

图1A显示为本发明中大黄粉对照品的色谱图，其中，1：芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷；2：大黄酸-8-O-葡萄糖苷；5：番泻苷A；6：大黄素-1-O-葡萄糖苷；9：大黄酚-1-O-葡萄糖苷；10(S)：大黄酚-8-O-葡萄糖苷；11：芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷；12：大黄素-8-O-葡萄糖苷；16：大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷；17：芦荟大黄素；19：大黄酸；21：大黄素；22：大黄酚；23：大黄素甲醚。

图1B显示为本发明中大黄粉的指纹图谱。

图2显示为本发明的大黄粉样品的叠加指纹图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例使用的试剂和仪器如下：

1、试剂

芦荟大黄素(批号110795-201710，纯度98.3％)、大黄酸(批号110757-201607，纯度99.3％)、大黄素(批号110756-201512，纯度98.7％)、大黄酚(批号110796-201621，纯度99.2％)、大黄素甲醚(批号110758-201616，纯度99.0％)均购自中国食品药品检定研究院；芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷(批号17103003，纯度≥98％)、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(批号18080601，纯度≥98％)、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷(批号17092502，纯度≥98％)购自成都普菲德生物技术有限公司；芦荟大黄素-3-羟甲基-O-β-D-葡萄糖苷(批号CX0058，纯度≥98％)、大黄素-1-O-β-D-葡萄糖苷(批号CX0055，纯度≥98％)、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷(批号CX0053，纯度≥98％)、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷(批号CX0054，纯度≥98％)、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷(批号CX0056，纯度≥98％)购自江苏永健医药科技有限公司；番泻苷A(批号140807，纯度≥98％)购自上海古朵生物科技有限公司。

大黄粉，由上海和黄药业有限公司提供，批号分别为191101、T2019120301、T2019120302、T2019120303、T2019120304、T2019120305。

有机溶剂：甲醇(分析纯AR，国药集团化学试剂有限公司)，流动相：甲醇(色谱纯，德国Merck公司)，磷酸(色谱纯，德国CNW公司)，超纯水(Milli-Q超纯水处理系统制备)。

2、仪器

Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱仪(配有Empower 3色谱工作站，四元超高压溶剂管理器，自动进样样品管理器，柱温箱，PDAeλ检测器，美国Waters公司)；SB-5200DTD型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；AL204和XS205型分析电子天平(梅特勒-托利多METTLER TOLEDO仪器上海有限公司)；Milli-Q Advantage A10超纯水系统(德国默克密理博公司)。

实施例1

1、样品前处理

供试品溶液的制备：将191101批号的大黄生药粉碎后获得的大黄粉样品。取大黄粉0.2g，置于50mL的具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，密塞封闭后用超声波仪在功率为250W、频率为40kHz下超声提取45min，冷却、再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置片刻，取上清液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。

对照品溶液的制备：分别精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、番泻苷A对照品，置于容量瓶中加入甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，得到对照品溶液。对照品溶液中各成分的含量范围为：芦荟大黄素为0.30-75.15μg/ml、大黄酸为0.08-20.06μg/ml、大黄素为0.16-41.22μg/ml、大黄酚为0.99-248.98μg/ml、大黄素甲醚为0.34-84.54μg/ml、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷为0.71-178.39μg/ml、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷为0.12-28.91μg/ml、大黄酸-8-O-葡萄糖苷为0.15-37.85μg/ml、大黄素-8-O-葡萄糖苷为0.13-32.56μg/ml、大黄素-1-O-葡萄糖苷为0.10-25.72μg/ml、大黄酚-8-O-葡萄糖苷为0.60-149.39μg/ml、大黄酚-1-O-葡萄糖苷为0.33-83.27μg/ml、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷为0.26-66.12μg/ml、番泻苷A为0.76-37.94μg/ml。

2、色谱条件

所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC

所述梯度洗脱的具体程序为：

0-6min，A相：B相体积比为41：59-45：55；

6-8min，A相：B相体积比为45：55-52：48；

8-14min，A相：B相体积比为52：48-54：46；

14-19min，A相：B相体积比为54：46-69：31；

19-23min，A相：B相体积比为69：31-79：21；

23-25min，A相：B相体积比为79：21-99：1；

25-30min，A相：B相体积比为99：1-100：0；

30-31min，A相：B相体积比为100：0-41：59。

3、测定

采用上述步骤2中的色谱条件的高效液相色谱法分别测定上述步骤1中供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱。其中，所述供试品溶液的指纹图谱，要与对照品溶液的指纹图谱进行比较，根据对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出供试品溶液的指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，获得大黄粉指纹图谱。

实施例2

采用上述实施例1中建立的大黄粉指纹图谱的检测方法对多批次大黄粉进行检测，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，得到的供试品的指纹图谱数据导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版软件中，与相同指纹图谱检测条件下获得的大黄粉的标准指纹图谱进行相似度比较，以大黄粉的指纹图谱与大黄粉的标准指纹图谱的相似度≥0.99为标准，对照图谱生成法采用的，时间窗宽度为0.20。共标定出大黄粉的标准指纹图谱包括23个共有指纹峰，其中10号为参照峰(S峰)。

具体的大黄粉的标准指纹图谱见图1B，由图1B可知，以10号峰为参照峰(S峰，保留时间为1.0000)，其他22个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰(0.2981±0.0004)、2号峰(0.4762±0.0007)、3号峰(0.5289±0.0008)、4号峰(0.5979±0.0006)、5号峰(0.6571±0.0003)、6号峰(0.7397±0.0005)、7号峰(0.7922±0.0006)、8号峰(0.8770±0.0007)、9号峰(0.9604±0.0005)、11号峰(1.0515±0.0010)、12号峰(1.0826±0.0009)、13号峰(1.1170±0.0009)、14号峰(1.2510±0.0010)、15号峰(1.2770±0.0011)、16号峰(1.3136±0.0012)、17号峰(1.3810±0.0011)、18号峰(1.4387±0.0016)、19号峰(1.5656±0.0015)、20号峰(1.6725±0.0023)、21号峰(1.7415±0.0022)、22号峰(1.7747±0.0022)、23号峰(1.8376±0.0023)。

将上述的大黄粉的标准指纹图谱，与对照品溶液的指纹图谱进行比较，根据图1A中的对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出大黄粉的标准指纹图谱中的相应特征峰，定位确定14个指纹峰：所述1号峰为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述2号峰为大黄酸-8-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述5号峰为番泻苷A的指纹峰，所述6号峰为大黄素-1-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述9号峰为大黄酚-1-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述10号峰为大黄酚-8-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述11号峰为芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述12号峰为大黄素-8-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述16号峰为大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷的指纹峰，所述17号峰为芦荟大黄素的指纹峰，所述19号峰为大黄酸的指纹峰，所述21号峰为大黄素的指纹峰，所述22号峰为大黄酚的指纹峰，所述23号峰为大黄素甲醚的指纹峰。

实施例3

对本发明中的大黄粉指纹图谱的检测方法进行方法学验证，其性能指标结果如下。

1、精密度

取批号191101的大黄粉样品1份，按上述实施例1中大黄粉指纹图谱的检测方法进行检测，连续进样6次，记录色谱图，以10号峰(大黄酚-8-O-葡萄糖苷)为参照峰，考察指纹图谱中规定的共有峰的相对保留时间，计算各共有峰相对保留时间的RSD<1.0％，相对峰面积的RSD<3.0％。结果表明，方法精密度良好。

2、稳定性

取批号191101的大黄粉样品1份，按上述实施例1中大黄粉指纹图谱的检测方法，制备供试品溶液后分别放置0h、2h、4h、8h、12h、24h进行检测，以10号峰(大黄酚-8-O-葡萄糖苷)为参照峰，计算得出各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果指纹图谱规定的共有峰的相对保留时间的RSD<1.0％，相对保留峰面积的RSD<3.0％，表明本发明中样品在24h内检测稳定性良好。

3、重复性

取批号191101的大黄粉样品6份，按上述实施例1中大黄粉指纹图谱的检测方法进行检测，以10号峰(大黄酚-8-O-葡萄糖苷)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果指纹图谱规定的共有峰的相对保留时间的RSD<1.0％，相对保留峰面积的RSD<3.0％，表明本发明中方法的重复性良好。

实施例4

1、样品前处理

供试品溶液的制备：与实施例1中的步骤1中供试品溶液的制备过程相同。

对照品溶液的制备：与实施例1中的步骤1中对照品溶液的制备过程相同。

2、色谱条件

所述高效液相色谱法的色谱条件与实施例1中的步骤2中高效液相色谱法的色谱条件相同。

3、测定

采用外标法，分别移取一系列不同体积的对照品溶液，配成一系列不同浓度的溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，绘制标准工作曲线。再将获得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，并将分析结果代入标准工作曲线，即得供试品溶液中14种成分的含量。

具体来说，分别移取一系列不同体积的对照品溶液，配成一系列不同浓度的溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，获得对照品溶液中14种成分含量与峰面积的线性关系，以每一种成分色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液采用高效液相色谱仪检测，将获得的供试品溶液中14种成分的色谱峰面积，分别代入所述各标准工作曲线的回归方程中，可得到相应成分的含量。

实施例5

分别配制上述14种对照品不同浓度的系列溶液，精密吸取1μL，采用实施例4的HPLC检测条件，进行高效液相色谱仪分析，以各对照品浓度(μg/mL)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得到回归方程、相关系数和线性范围，具体结果见表2。由表2可知，上述回归方程的在相应浓度范围内进样时线性关系良好，相关系数R

表2

实施例6

1、精密度

取批号191101的大黄粉样品1份，按上述实施例4的色谱条件进样，重复进样6次，记录色谱图，以峰面积计，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、番泻苷A峰面积的RSD(n＝6)均小于5.0％，表明仪器精密度良好。

2、稳定性

取批号191101的大黄粉样品的供试品溶液1份，按上述实施例4的色谱条件分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h进样测定，记录色谱图，测定峰面积，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、番泻苷A峰面积的RSD均小于5.0％，表明供试品溶液在48h内稳定。

3、重复性

取批号191101的大黄粉样品，精密称定6份，按上述实施例4的供试品溶液的制备方法制备样品，按上述实施例4的色谱条件进样，记录色谱图。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、番泻苷A峰面积的RSD均小于5.0％，表明重复性良好。

4、加样回收率

取批号191101的大黄粉样品9份，精密称定0.1g，分别按三个不同浓度水平分别加芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、番泻苷A对照品，按上述实施例4的供试品溶液的制备方法制备样品，按上述实施例4的色谱条件进样，记录色谱图。计算14种有效成分在不同加入比例下的回收率。结果14种有效成分的加样回收率范围为98.01～99.91％，结果见表3。表明方法的准确度良好。

表3

实施例7

取辐照后的大黄粉10g作辐照后供试品，未经辐照的大黄粉10g作辐照前对照品，分别加入含中和剂(中和剂比例：3％吐温80、0.3％卵磷脂、0.1％组氨酸)的胰酪大豆胨液体培养基，混匀，作为1:10供试液，并用含中和剂的胰酪大豆胨液体培养基稀释成1:10

表4辐照前后大黄粉含菌量测定结果(cfu·g

注：TAMC为需氧菌总数，TYMC为霉菌和酵母菌总数。

我司的《大黄粉质量标准》规定，需氧菌总数不得超过10

实施例8

采用上述实施例1中建立的大黄粉指纹图谱的检测方法对五批未辐照的大黄粉的指纹图谱导入国家药典委员会开发的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)软件进行分析，以样品T2019120301为参照图谱，以平均数法，时间窗宽度设定为0.20，采用全谱匹配指纹图谱，生成大黄粉对照指纹图谱。

计算每批辐照前后的大黄粉指纹图谱的相似度，结果五批大黄粉指纹图谱的相似度均大于0.99，表明

表5大黄粉辐照前后指纹图谱相似度变化表

由表5可以看出，辐照后的大黄粉的指纹图谱相似度与辐照前的指纹图谱相似度较高(均≥0.99)，相似度无显著性差异(P＞0.05)，说明现有辐照剂量下，对大黄粉的指纹图谱相似度影响极小。

实施例9

取五批大黄粉(批号：T2019120301、T2019120302、T2019120303、T2019120304、T2019120305)，分别以剂量0、3、6、10kGy辐照处理后，按上述实施例4的供试品溶液的制备方法制备样品，按上述实施例4的色谱条件进样，记录色谱图，按实施例5的回归方程分别计算辐照前后大黄粉中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、番泻苷A的含量，结果见表6。

表6五批大黄粉中14个成分含量测定结果(mg·g

由表6可知，采用SPSS 16.0软件对

同时，本发明中针对大黄粉中14种成分含量的测定方法，能有效测定大黄粉样品中14种成分的含量，方法操作简便、适用性好，结果准确、可靠。

综上所述，本发明提供的一种大黄粉指纹图谱的检测方法及其应用，建立了大黄粉的高效液相指纹图谱，能够对大黄粉中14种化学成分进行了定量分析，并有效降低大黄粉生药粉中的微生物含量，保证临床用药的安全有效，为更好地建立大黄粉整体质量控制评价体系提供科学试验依据。所以，本发明克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。