一种RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统及其制备方法

技术领域

本发明属于抗癌药物传递系统领域，具体地，涉及RGD-紫杉醇-金属有机骨架ZIF-90(RGD/PTX@ZIF-90)新型抗癌药物传递系统及其制备方法。

背景技术

随着社会发展人们生活方式的改变，癌症已成为危害人类健康的主要疾病。如何有效控制和治疗癌症已成为亟待解决的重要公共卫生问题。尽管传统的抗肿瘤药物可以延长某些患者的寿命，但它们也面临许多挑战，例如半衰期短，生物利用度低，耐药性高，非特异性分布以及难以跨越生理障碍等。

紫杉醇(PTX)是一种常见的抗肿瘤药物，广泛用于多种形式晚期和难治性癌症的治疗，是治疗乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等的广谱抗肿瘤药物，并且疗效显著。然而紫杉醇的溶解性较差，现有临床常用制剂的紫杉醇注射液是以聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇混合液作为溶剂的，但这种非水溶媒的使用会导致严重的过敏反应；此外，紫杉醇缺乏靶向性，极易引起嗜中性白血球减少症、神经性疾病等全身性不良反应。它的低生物利用度和毒副作用极大地限制了其在医学中的应用，因此需要借助高效安全的药物传递系统。

近年来纳米技术发展迅速，特别是新型纳米材料的出现为许多重大疾病治疗提供了新思路和新方法。在肿瘤治疗方面纳米药物载展现出巨大潜力，受到了广泛的关注，越来越多的纳米药物载体被用于各种肿瘤治疗。如Lei Zhang等人使用纳米介孔二氧化硅负载阿霉素用于治疗肝癌；Yang Liu等人采用纳米蛋白装载紫杉醇用于治疗肺癌。与传统药物递送系统相比，纳米药物递送系统因其尺寸、形状、材料等特殊性质，可有效改善药物的药代动力学和药效学性能，从而提高疗效。传统的纳米药物载体包括脂质体、聚合物纳米颗粒、蛋白质纳米颗粒、金属纳米颗粒等。但作为药物载体这些载体仍存在稳定性欠佳、载药量不高和生物相容性较差等缺点。金属有机骨架(MOFs)是一类由金属离子(或金属簇)和有机配体组成的多孔材料，由于其具有特殊的周期性结构、高比表面积、高吸附性高孔隙率等特性，已经在吸附、电化学、催化等方面显示了广泛的应用前景。与传统的纳米药物载体相比，MOFs具有多重优势，如具有较高的载药量；具有良好的生物降解性，避免了药物载体累积所引起的毒副作用；运用修饰手段可使其带有多种功能基团等。沸石咪唑酯骨架(ZIFs)结构与无机沸石相似，具有沸石和MOFs的优点，如超高表面积，永久性微孔，高结晶度和良好的稳定性。

RGD肽是精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)和天冬氨酸(Asp)形成的三肽，多种亚型的整合素受体均能识别相同的核心氨基酸序列Arg-Gly-Asp(RGD)，因此RGD肽是整合素受体最重要的底物分子，是公认的具备较好靶向性的多肽，但是实际使用中，RGD肽需要通过连接分子与载体或者药物进行连接，如公布号为CN111450252A公开的一种用于靶向堵塞肿瘤血管的药物及其制备方法与应用，该药物包括生物膜、MOFs、内源性蛋白以及靶向分子，其中RGD肽作为靶向分子中的一种，但RGD肽需要通过磷脂-聚乙二醇与药物分子连接；如公布号为CN110368501A公开的一种RGD肽修饰的硼载药体系及其制备和应用，该药物中的RGD肽与硼纳米片仍需要通过聚乙二醇来连接；如公布号为CN111068068A公开的一种RGD多肽-喜树碱多肽药物偶联及其应用，该药物是以RGD肽为靶向肽，喜树碱为抗癌药物，但是RCD与喜树碱仍需要通过丁二酸干进行连接。这些方法都引入了外源有机试剂，进入人体后存在一定的负面影响，同时制备过程中引入有机试剂，也使得整个过程不太环保与安全。

发明内容

1.要解决的问题

针对目前作为临床常用制剂的紫杉醇注射液的低生物利用度和毒副作用、RCD肽的靶向需要连接剂等问题，本发明提供了一种新型RGD-紫杉醇-金属有机骨架ZIF-90(RGD/PTX@ZIF-90)药物传递系统及其制备方法，该传递系统是利用ZIF-90作为载体，并使用RGD通过席夫碱反应的方式进行修饰，形成RGD@ZIF-90后进而通过反应吸附抗肿瘤药物PTX，使其形成RGD/PTX@ZIF-90，降低了其毒副作用并增强了其生物利用度和靶向性，提高了药物的治疗效果，且制备方法简单。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

步骤(1)：RGD/ZIF-90的制备

取ZIF-90粒子和RGD溶于无水甲醇中，溶解，搅拌使其发生席夫碱反应形成RGD/ZIF-90。

优选地，相对于0.1g ZIF-90，RGD的用量为50-100mg。

优选地，上述溶解采用超声溶解，超声时间为25-40min，也可根据实际情况调整，使材料充分溶解即可。

优选地，上述搅拌使其发生席夫碱反应条件为：搅拌速度100-200rpm/min，反应温度25-30℃，反应时间为36-48h。

优选地，上述反应结束后将溶液离心，取下层沉淀并洗涤，再冷冻干燥，得到RGD/ZIF-90。

优选地，ZIF-90粒子的制备方法，包括如下步骤：

(1)将咪唑-2-甲醛溶于纯水中，溶解，加入聚乙烯吡咯烷酮，溶解，记为溶液A；

(2)将六水合硝酸锌溶于叔丁醇中，溶解，记为溶液B；该步骤与步骤(1)无先后顺序。

(3)将溶液A和B混合搅拌反应，反应结束后，将溶液离心并洗涤沉淀物，烘干获得ZIF-90纳米粒子。

优选地，相对于0.24g咪唑-2-甲醛，纯水的用量为10-20mL，聚乙烯吡咯烷酮的用量为0.05-0.1g，六水合硝酸锌的用量为0.02-0.05g，叔丁醇的用量为10-20mL。

优选地，步骤(1)和(2)中的溶解均可采用超声溶解，超声时间为30-50min。

优选地，步骤(3)中搅拌反应的条件为：搅拌速度为700-1000rpm/min，反应时间为15-30min。

步骤(2)：RGD/PTX@ZIF-90的制备

取步骤(1)中所制备的RGD/ZIF-90与PTX共同溶于无水甲醇中，溶解，25-30℃下避光搅拌过夜反应，生成RGD/PTX@ZIF-90。

优选地，相对于0.1g RGD/ZIF-90，PTX的用量为50-100mg，进一步地，PTX的用量为100mg。

优选地，上述溶解采用超声溶解，超声时间为30-50min，也可根据实际情况调整，使材料充分溶解即可。

优选地，上述避光搅拌过夜反应条件为：搅拌速度为100-200rpm/min，反应时间为12-24h。

优选地，上述反应结束后将溶液离心，取下层沉淀并洗涤，再冷冻干燥，得到RGD/PTX@ZIF-90。

优选地，上述反应在氮气保护下进行。

本发明还提供了一种RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统，由上述方法制备而得，该系统以RGD肽修饰的ZIF-90为载体，吸附抗肿瘤药物PTX。其中，RGD肽修饰是通过RGD肽的氨基与ZIF-90中的醛基之间发生席夫碱反应相连接，即醛基与RGD肽的氨基之间进行亲核加成反应，RGD肽为亲核试剂，其结构中带有孤电子对的氮原子进攻羰基基团上带有正电荷的碳原子，完成亲核加成反应。

优选地，上述RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统使用荧光素标记纳米粒子，使该材料具有荧光特性可以在药物的临床治疗上更直观的观察。进一步地，上述荧光素为FITC。

本发明还提供了一种上述RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统在制备癌症治疗的药物中的应用。

本发明还提供了一种上述RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统的制备方法在制备癌症治疗的药物中的应用。

3.有益效果

本发明与现有技术相比，其有益效果在于：

(1)本发明的RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统，是在金属有机骨架ZIF-90的基础上，将ZIF-90的醛基和RGD肽的氨基通过席夫碱反应相连接，如图2所示，形成RGD@ZIF-90后再通过包载PTX。ZIF-90材料具有良好的生物相容性，进入人体后作为药物载体不会影响正常的体内环境，ZIF-90材料也是一种pH响应型MOF材料，当它进入肿瘤区域时，其骨架将由于酸性肿瘤微环境而崩溃，因此RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统在作用时不仅提高了药物的释放速率，而且塌陷的骨架也将被生物体利用，从而大大减少了对生物体的损害；RGD肽则是公认的具备较好靶向性的多肽，用它对ZIF-90进行修饰，可以使其靶向肿瘤细胞，不仅降低了给药过程中对正常细胞的毒副作用，同时也提高了药物的治疗效果，且整个过程无额外化学试剂的引入，更加安全环保。

(2)本发明的RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统，其整体结构中含有RGD肽和ZIF-90，所具有的对正常细胞的低毒作用及良好的靶向性特点，克服现有临床上直接采用紫杉醇注射液会导致严重的过敏反应、缺乏靶向性而极易引起嗜中性白血球减少症等全身性不良反应问题，提高了其在医学中的应用。

(3)本发明的RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统，针对肿瘤细胞特异性地高表达α

(4)本发明的RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统的制备方法，该方法步骤简单、反应条件温和，ZIF-90与RGD肽搅拌得到RGD/ZIF-90，再将其与PTX一起搅拌，得到RGD/PTX@ZIF-90的复合材料，整个过程无额外化学试剂的引入，更加安全环保。

附图说明

图1是图1是实施例1制备的ZIF-90的扫描电镜图；

图2是实施例1制备的ZIF-90，PTX@ZIF-90,RGD/PTX@ZIF-90的傅里叶红外光谱图；

图3是实施例1制备的ZIF-90的氮吸附表征图；

图4是实施例1制备的ZIF-90，RGD/PTX@ZIF-90的细胞毒性结果分析图；

图5是在共聚焦荧光显微镜下观察的RGD/PTX@ZIF-90在细胞内的分布情况图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。

如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。

浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。

实施例1

本实施例通过本发明的RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统的制备方法制备RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统。

RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统的制备，具体包括如下步骤：

(1)ZIF-90纳米粒子的制备

将0.24g咪唑-2-甲醛溶于12.5mL纯水中，溶解，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮，超声溶解，超声时间为30min，记为溶液A；

将0.0282g六水合硝酸锌溶于12.5mL叔丁醇中，超声溶解，超声时间为30min，记为溶液B；

将溶液A和B混合搅拌，搅拌反应的条件为：搅拌速度为1000rpm/min，反应时间为15min。反应结束后，将溶液离心并洗涤沉淀物，烘干获得ZIF-90纳米粒子。

图1是ZIF-90的扫描电镜图，如图所示，呈现六面体状，粒径在400纳米左右；图2是ZIF-90的傅里叶红外表征图，由各个特征峰出现的位置可以判断，已经成功合成出ZIF-90材料。

(2)RGD/ZIF-90的制备

取步骤(1)中所制备的0.1g ZIF-90和100mg RGD肽溶于20mL无水甲醇中，超声溶解30min，200rpm/min搅拌反应，反应温度为25℃，反应时间为48h。反应结束后将溶液离心，取下层沉淀并洗涤，之后再冷冻干燥获得RGD/ZIF-90。

(3)RGD/PTX@ZIF-90的制备

取步骤(2)中所制备的0.1g RGD/ZIF-90和100mg PTX溶于甲醇中，超声溶解30min，200rpm/min搅拌，避光过夜反应24h，反应温度为25℃，将溶液离心，取下层沉淀并洗涤，之后再冷冻干燥，获得RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统。

图2是ZIF-90、PTX@ZIF-90、RGD/PTX@ZIF-90的傅里叶红外表征图，由各个特征峰出现的位置可以判断，已经成功合成出RGD/PTX@ZIF-90材料，且材料中的醛基没有破坏。本发明使用氮气吸附法表征比表面积和粒径，结果见图3，材料呈现典型的typeⅣ类型曲线。

实施例2

本实施例通过本发明的RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统的制备方法制备RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统。

RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统的制备，具体包括如下步骤：

(1)ZIF-90纳米粒子的制备

将0.24g咪唑-2-甲醛溶于10mL纯水中，溶解，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮，超声溶解，超声时间为30min，记为溶液A；

将0.02g六水合硝酸锌溶于10mL叔丁醇中，超声溶解，超声时间为30min，记为溶液B；

将溶液A和B混合搅拌，搅拌反应的条件为：搅拌速度为700rpm/min，反应时间为15min。反应结束后，将溶液离心并洗涤沉淀物，烘干获得ZIF-90纳米粒子。

(2)RGD/ZIF-90的制备

取步骤(1)中所制备的0.1g ZIF-90和50mg RGD肽溶于20mL无水甲醇中，超声溶解25min，100rpm/min搅拌反应，反应温度为25℃，反应时间为36h。反应结束后将溶液离心，取下层沉淀并洗涤，之后再冷冻干燥获得RGD/ZIF-90。

(3)RGD/PTX@ZIF-90的制备

取步骤(2)中所制备的RGD/ZIF-90 0.1g和50mg PTX溶于甲醇中，超声溶解30min，100rpm/min搅拌，避光过夜反应12h，反应温度为25℃，将溶液离心，取下层沉淀并洗涤，之后再冷冻干燥，获得RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统。

经过检测，RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统制备成功。

实施例3

本实施例通过本发明的RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统的制备方法制备RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统。

RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统的制备，具体包括如下步骤：

(1)ZIF-90纳米粒子的制备

将0.24g咪唑-2-甲醛溶于20mL纯水中，溶解，加入0.1g聚乙烯吡咯烷酮，超声溶解，超声时间为50min，记为溶液A；

将0.05g六水合硝酸锌溶于20mL叔丁醇中，超声溶解，超声时间为50min，记为溶液B；

将溶液A和B混合搅拌，搅拌反应的条件为：搅拌速度为1000rpm/min，反应时间为30min。反应结束后，将溶液离心并洗涤沉淀物，烘干获得ZIF-90纳米粒子。

(2)RGD/ZIF-90的制备

取步骤(1)中所制备的0.1g ZIF-90和100mg RGD肽溶于20mL无水甲醇中，超声溶解40min，200rpm/min搅拌反应，反应温度为30℃，反应时间为48h。反应结束后将溶液离心，取下层沉淀并洗涤，之后再冷冻干燥获得RGD/ZIF-90。

(3)RGD/PTX@ZIF-90的制备

取步骤(2)中所制备的RGD/ZIF-90 0.1g和100mg PTX溶于甲醇中，超声溶解50min，200rpm/min搅拌，避光过夜反应24h，反应温度为25℃，将溶液离心，取下层沉淀并洗涤，之后再冷冻干燥，获得RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统。

经过检测，RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统制备成功。

实施例4

本实施例提供RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统对细胞毒性的研究。

RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统的制备方法同实施例1。

使用MCF-7肿瘤细胞为实验细胞进行体外毒性实验，每个浓度进行三次平行实验，毒性实验步骤包括：

首先，将MCF-7细胞培养至对数生长期，并用PBS洗涤3次。然后用胰蛋白酶消化细胞，并将细胞溶液稀释至1×10

结果如图4所示，材料本身对细胞无毒，吸附紫杉醇后细胞致死率大幅度上升且与浓度正线性相关。当药物浓度分别为400、200、100、50、25μg/mL时，PTX组细胞存活率分别为42％、44％、54％、67％、70％，RGD/PTX@ZIF-90组的细胞存活率为35％、41％、52％、54％、62％。结果表明本材料抗肿瘤效果良好。说明本发明的RGD/PTX@ZIF-90相比直接加入PTX提高了抗肿瘤活性，针对肿瘤细胞具有更好的靶向性。

实施例5

本实施例提供RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统在细胞内的分布观察。

RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统的制备方法同实施例1，不同之处在于使用FITC标记纳米粒子。

使用DAPI标记的MCF-7肿瘤细胞为实验细胞进行实验，在共聚焦荧光显微镜下观察RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统在细胞内的释放分布情况。实验步骤包括：将MCF-7细胞以每毫升含1×10

结果如图5所示。PTX集中的在肿瘤细胞附近释放，说明发明的RGD/PTX@ZIF-90药物传递系统提高了抗肿瘤活性并且可以降低药物的副作用，稳定性高。