一种马传染性贫血病毒快速检测方法

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体公开一种马传染性贫血病毒快速检测方法。

背景技术

马传贫(马传染性贫血病)实验室检测主要方法为琼脂扩散试验，琼脂扩散试验是比例适当的可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的半固体琼脂糖中进行的沉淀试验，抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散相遇而形成抗原抗体复合物，复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带，包括琼脂板制备、打孔、封板编号、加样、扩散5个主要技术环节。

现有的琼脂扩散试验中使用的打孔和封板技术，在每次/板可检测的数量和结果判定上有一定局限性，如常规的打孔法是在制备的琼脂板上打孔径为5mm，孔距为3mm，有7孔型和40孔型，该方法的缺陷是每次/板可检测的样品数量少、耗时长，不能满足大批量的实验室检测要求；另外，通常的方法在加样时，抗原及血清的添加以加至孔满为止，但在实际操作中经常会出现制板时厚薄不均、反应孔深浅不一的现象，特别是在当前消灭马传贫时间紧、实验室检测任务重的情况下，需要临时增加大量的实验室技术人员，在新增的技术人员经验不足、手法不太熟练的情况下，此缺陷尤为明显；同时封板时常规的方法是酒精灯封板，酒精灯封板在应用中有两个缺点：一是在打孔过程中常因人工操作不当，导致孔底松动有缝隙。因此只适用于少孔型、少量检测；二是因受热不均会导致漏板现象的发生。漏板后在培养过程中可造成抗原孔、血清孔及标准阳性血清孔之间发生液体对流现象，使试验结果产生假阳性、假阴性而导致误判。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供一种马传染性贫血病毒快速检测方法，不但减少了检测时间及人力、物力的投入，而且能够使试验结果更加准确可靠，同时能够满足大批量的实验室检测要求。

本发明提供的马传染性贫血病毒快速检测方法，包括以下步骤：

制备琼脂板；

打孔：采用多排多孔型方式打孔，并在琼脂板最薄处打孔作为衡量孔，用来衡量所述琼脂板每孔所需加液量；

封板：将打孔后的所述琼脂板放入沸水中封板；

加样：在所述衡量孔内加满液体但不溢出，得到所述琼脂板上每孔的加液量，在所述琼脂板上的其它孔内分别加入与所述衡量孔内的加液量相同的被检血清、阳性血清及抗原；

扩散：使加好的样品充分反应，观察结果。

优选地，所述沸水中封板时间为10-15s。

优选地，所述打孔直径为4-5mm，孔距为3-4mm。

更优选地，所述打孔直径为4-5mm，孔距为3mm。

优选地，所述琼脂板是按照以下步骤进行制备：

上述物质混合，得到PBS液；

制板：将所述PBS液煮沸10-12min，待琼脂完全融化后，倒板，琼脂板的厚度为4-5mm。

更优选地，所述PBS液煮沸10min。

优选地，所述充分反应是将所述琼脂板置于18-25℃下进行反应12-72h。

优选地，所述观察结果是分别在24、48、72h进行观察。

对比现有技术，本发明的有益效果为：

1、根据平皿大小和实际检测任务量将孔型改为多排多孔型，减少了抗原和阳性血清的用量、缩短了检测时间，从而加快了马传贫检测工作进程；

2、打孔时在琼脂板最薄处打一个孔作为衡量孔，用来衡量该琼脂板每孔所需加液量，使加液量均等，抗原抗体反应更充分，沉淀线更整齐，从而避免因沉淀线偏移而影响结果判定，使试验结果更准确可靠；

3、采用沸水封板：一是能使琼脂板底部均匀受热，避免了常规酒精灯封板受热不均而导致漏板现象的发生，使试验结果更加准确可靠；二是能满足大批量的实验室检测要求，减少了检测时间提高了工作效率；三是减少了人力和物力的投入，节约了成本。

附图说明

图1是实施例1提供的平皿打孔图；

图2是实施例2提供的平皿打孔图；

图3是实施例3提供的平皿打孔图；

图4是实施例4提供的平皿打孔图；

图5是对比例1及对比例2中传统的7孔型平皿打孔图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明，但是本发明不受这些实施例的限制。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

需要说明的是，本发明提供的检测方法的检测原理与传统马传贫实验室检测方法的原理相同，具体为：在不同孔内分别加入抗原、阳性血清及被检血清，所加样品在琼脂板上逐渐扩散，抗原与抗体结合会产生沉淀线，根据沉淀线的有无或者弯曲位置判定检测结果，判定方法如下：

阳性：

当检测用阳性血清孔与抗原孔之间有一条明显致密的沉淀线时，被检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线；或者阳性血清的沉淀线末端在相邻的被检血清孔处向抗原孔侧偏弯者，此种被检血清判为阳性；

阴性：

被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，或者阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线向相邻的被检血清孔直伸或向被检血清孔侧偏弯者，此种被检血清为阴性；

疑似：

阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端，似乎向相邻被检血清孔内侧偏弯，但不易判断时，可将抗原稀释2倍、4倍、6倍、8倍进行复试。最后判定结果观察时间可延至5d。

实施例1

一种马传染性贫血病毒快速检测方法，包括以下步骤：

S1、制备琼脂板：

加热后煮沸10分钟，待琼脂完全融化后，倒板，琼脂板的厚度为4-5mm，得到琼脂板；

S2、打孔：在琼脂板上采用多排多孔型方式打孔，在直径12cm的平皿上打126个孔，孔直径4mm，孔距3mm，如图1所示；并在琼脂板最薄处打孔作为衡量孔，用来衡量琼脂板每孔所需加液量；

S3、封板：将打孔后的琼脂板放入沸水中封板10s；

S4、加样：在衡量孔内加满生理盐水但不溢出，得到琼脂板上每孔的加液量，在所述琼脂板上的其它孔内加入与衡量孔内的加液量相同的被检血清、阳性血清及抗原；

S5、扩散：将加好样的所述琼脂板置于18-25℃下反应，24、48、72小时观察结果，并记录结果。

实施例2

一种马传染性贫血病毒快速检测方法，与实施例1的不同在于：打孔方式不同，具体为：在琼脂板上采用多排多孔型方式打孔，在直径12cm的平皿上打90个孔，孔直径5mm，孔距3mm，如图2所示，检测60份样品。

实施例3

一种马传染性贫血病毒快速检测方法，与实施例1的不同在于：打孔方式不同，具体为：在琼脂板上采用多排多孔型方式打孔，在直径15cm的平皿上打154个孔，孔直径5mm，孔距3mm，如图3所示，检测100份样品。

实施例4

一种马传染性贫血病毒快速检测方法，与实施例1的不同在于：打孔方式不同，具体为：在琼脂板上采用多排多孔型方式打孔，在直径15cm的平皿上打208个孔，孔直径4mm，孔距3mm，如图4所示。

需要说明的是，以上实施例1-4仅列举了实验室检测常用的规格为120mm、150mm的平皿进行打孔，但应理解为本发明提供的技术方案并不仅仅限于使用120mm、150mm的平皿，还可以根据实验要求选择100mm、180mm等规格的平皿，只需采用本发明中的多排多孔型方式进行打孔即可。

实施例5

一种马传染性贫血病毒快速检测方法，与实施例1的不同在于：打孔孔距为4mm。

实施例6

一种马传染性贫血病毒快速检测方法，与实施例1的不同在于：沸水封板时间为15s。

对比例1

一种马传染性贫血病毒快速检测方法，与实施例1的不同在于：采用传统7孔型打孔方式，并采用酒精灯封板。

对比例2

一种马传染性贫血病毒快速检测方法，与实施例1的不同在于：采用7孔型打孔方式，并采用沸水封板10s。

以上对比例1-2中7孔型打孔方式参考图5所示。

对比例3

一种马传染性贫血病毒快速检测方法，与实施例1的不同在于：在琼脂板上不打衡量孔，以加至孔满为止。

由于实施例1-6提供的检测方法的检测结果基本相同，故以下仅以实施例1为例与对比例1-3作比较进行效果说明。

通过实施例1与对比例1的比较可知：酒精灯封板会出现漏液现象，反应时间到后观察结果，发现有的反应沉淀线没出现，孔里的液体全部渗到了平皿底部；而实施例1中的沸水封板不会出现漏液现象，沉淀线整齐、清晰可见，不影响结果判定。

通过比较实施例1及对比例2可知：完成相同数量的样品检测时，实施例1的打孔方式比对比例2的用时更短，且抗原和标准阳性血清用量更少。

通过比较实施例1及对比例3可知：不打衡量孔时，会出现每孔实际加液量不均等，沉淀线向加液量少的一侧偏移的现象，影响结果判定；而打衡量孔后，衡量出该琼脂板所需加液量，每孔加液量均等，沉淀线较整齐，更易于判定结果。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。