抗猪伪狂犬病毒感染的中和性单克隆抗体及应用

技术领域

本发明涉及一种抗猪伪狂犬病毒感染的中和性单克隆抗体及应用，属于单克隆抗体技术领域。

背景技术

猪伪狂犬病(PorcinePseudorabies，PR)，是一种由猪疱疹病毒I型(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的以发热、流产、死胎等为主要临床症状的接触性、急性传染病。妊娠母猪主要症状为流产、产弱仔、死胎以及木乃伊胎等；新生仔猪多呈现急性致死性，表现为典型的神经症状、麻痹、死亡率近100％；成年猪多为隐性感染，影响猪的生产水平。PRV在世界范围内已广泛流行，给养猪业带来巨大的经济损失，是影响养猪业健康发展的重大传染病之一。

针对PRV的抗体评价主要包括如琼脂扩散试验、间接ELISA、乳胶凝集试验、血凝抑制试验等，以总的特异性抗体检测为主，并不能准确评价猪体内中和抗体水平，难以对猪的免疫保护水平进行准确判断。基于中和性单克隆抗体的竞争性ELISA检测方法，能够有效评估猪体内PRV中和抗体水平，并对免疫保护效果进行准确评价。

目前，针对PRV感染并没有特效药物。在抗病毒研究领域，单克隆抗体是一种良好的候选靶标，具有抗病毒起效快、治愈率高等优点。基于单克隆抗体特异性强、纯度高、均一性好的特点，建立血清学检测方法，使抗体在体内阻断病毒感染等方面具有良好的治疗效果。因此，研究中和性单克隆抗体在PRV病毒检测和治疗方面具有巨大的潜力，对于PR的预防和治疗具有十分重要的应用意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抗猪伪狂犬病毒感染的单克隆抗体及应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种抗猪伪狂犬病毒感染的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株7B6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C202192，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年5月27日。

所述的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体7B6。

所述单克隆抗体的重链为IgG1型，轻链为Kappa型。

所述的单克隆抗体在猪伪狂犬病毒中和性抗体检测中的应用。

所述的单克隆抗体在制备抗伪狂犬病感染的药物中的应用。

本发明有益效果：

本发明方法获得的抗猪伪狂犬病毒感染的单克隆抗体，产量高，稳定性好，生产成本低，中和活性高。其中，单抗7B6可以识别PRV病毒中和性抗原表位，能够高效中和PRV病毒在体外和体内的感染，可以用于PRV中和抗体的竞争性检测及抗病毒治疗，是一种潜在的治疗PRV感染的候选药物，在PRV病毒检测和治疗方面拥有巨大的潜力，对于PR的预防和防治具有十分重要的应用意义。

附图说明

图1为IPMAs分析PRV-gD的单克隆抗体与PRV的反应示意图；

其中，单克隆抗体4D6(A)、5B2(B)、6H7(C)、7D8(D)、8B9(E)、9C11(F)、7B6(G)、12F4(H)和13F8(I)；比例尺：100μm；

图2为PRV-gD单克隆抗体与PRV病毒的反应示意图；

其中，单克隆抗体3D3(A)、9C11(B)、7B6(C)、12F4(D)、4D6(E)、5B2(F)；比例尺：100μm；

图3为PRV-gD单克隆抗体与gD蛋白反应的示意图；

其中，单克隆抗体3D3(A)、9C11(B)、7B6(C)、12F4(D)；

图4为PRV-gD的单克隆抗体上清的中和效价示意图；

图5为单克隆抗体7B6(A)和12F4(B)IC

其中，圆点代表有补体，三角代表无补体；

图6为单克隆抗体7B6的抗病毒效果示意图；

其中，A，攻毒后小鼠体重变化；B，攻毒后小鼠的存活率；C，攻毒后7天小鼠脑部和肺部的PRV病毒载量；

图7为单克隆抗体7B6在攻毒之后的治愈效果示意图；

其中，A，攻毒后小鼠体重变化；B，攻毒后小鼠的存活率；C，攻毒后7天小鼠脑部和肺部的PRV病毒载量；

图8为单克隆抗体7B6抑制PRV对BHK-21细胞和Vero细胞的吸附的示意图；

其中，WesternBlot(A)、绝对定量PCR(B)和流式细胞仪(C)；

图9为单克隆抗体7B6在PRV吸附前后对病毒的中和作用示意图；

其中，A和C：吸附前，B和D：吸附后。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1 BALB/c小鼠免疫

免疫小鼠：取3只4-6周大小的雌性BALB/c小鼠，在实验室过度一周后，取杆状病毒重组表达的猪伪狂犬病毒gD蛋白(由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室制备、保存、提供)与弗氏完全佐剂(体积比1:1)乳化后，皮下多点注射，100ug/只，两周后用弗氏不完全佐剂乳化的猪伪狂犬病毒gD蛋白(体积比1:1)按同样方式加强免疫，再过两周后再次加强免疫。

超免：加强免疫后的小鼠血清IPMA效价升高至20000以上后，进行超免，取表达纯化的猪伪狂犬病毒gD蛋白，用无菌PBS缓冲液稀释至0.2μg/μL，然后直接进行腹腔注射500μL进行超免。

小鼠血清效价检测：免疫三次后的小鼠剪尾采血，每只采5μL加入195μLPBS缓冲液中，5000rpm离心6min分离血清；从1：1000开始，用PBS缓冲液连续倍比稀释，采用IPMA方法测定血清抗体效价。

IPMA方法如下：

提前一天用PK-15细胞铺板96孔板，等第二天细胞长至60-70％时，接入100TICD

实施例2单克隆抗体的细胞融合与亚克隆

单克隆细胞株融合过程如下：

(1)实施例1中小鼠超免后的第三天，再次用IPMA进行血清效价测定，第4天或第5天对效价最高的小鼠用无菌镊子摘除眼球，充分放血，收集血液后分离并保存血清，然后对小鼠进行脱颈处死并将尸体完全浸泡于体积分数为75％的乙醇中进行消毒；

(2)将消毒后的小鼠尸体放在超净台中，用高压处理过的手术剪和镊子剖开小鼠，摘出脾脏放在洁净的200目的滤网上，用灭菌过的另一双剪刀把脾脏充分剪成小碎块，用无血清的1640培养基冲刷，使单个分散的脾细胞穿透滤网流入洁净的玻璃烧杯内；

(3)收集2×10

(4)将步骤(2)得到的单个脾细胞加入洁净的离心管内，添加无血清的1640培养基到40mL，1100rpm离心10min；

(5)弃去上清，轻轻摇散细胞团，分别向步骤(4)得到脾细胞悬液和步骤(3)得到sp/20细胞悬液中各添加无血清的1640培养基10mL，轻轻混匀后，把脾细胞悬液和sp/20细胞悬液混在一起，添加无血清的1640培养基补充至40mL，1100rpm离心10min，吸尽上清；

(6)轻柔拍打离心管分散细胞团后，一滴一滴的添加1mL的50％(体积分数)的PEG1500融合剂，开始缓慢滴加，随后逐渐加快，1min加完，静止90s；接着缓慢逐滴加入15mL无血清的1640培养基终止融合，先慢后快：前30s内滴加1mL，接着的30s内滴加3mL，最后逐渐加快滴加剩余的11mL；把细胞悬液放在37℃水浴中固定5min，然后无菌条件下添加无血清的1640培养基至40mL，1100rpm离心10min；

(7)弃掉上清，轻轻摇散细胞团，加入含HAT的1640培养基，轻轻的混匀细胞悬液，不要过于使劲，避免融合细胞受到挫伤；

(8)添加含有HAT的1640培养基，把分散充分的悬浮细胞按照250μL/孔加入到20个左右的96孔板中，静置放入37℃培养箱中；

(9)3-4天后在显微镜下可以观察到小的细胞团，6-10天继续观察细胞团长大至占据60％的培养孔时，对杂交瘤细胞的上清用IPMA的方法进行检测，并对阳性孔进行记录。

单克隆细胞株亚克隆过程如下：

将筛选到的阳性孔，转至24孔板中继续扩大培养，并进行进一步的阳性筛选，等24孔板的细胞长成明显可见的细胞团后，对阳性孔进一步亚克隆。取饲养细胞铺板96孔板，将每一个阳性孔细胞吹散混匀后，进行计数，取100个细胞稀释至10mL的1640培养基中，然后100μL/孔添加到已经铺有饲养细胞的96孔板中，在37℃温箱中生长5天左右，每天观察并标记出只有一个克隆的孔，并且该克隆明显来源于一个细胞。

具体表现为：克隆呈现圆形，靠近孔边缘时会成半圆形，并且边缘光滑，明显呈现一条弧形线条；若克隆边缘明显是由两条弧线交叉或者不规则，则该克隆是来源于2个或者更多个细胞，非单克隆细胞；当克隆长至清晰可见，大小适宜时，对上清再次进行IPMA阳性鉴定，鉴定出阳性孔，然后把阳性孔的克隆转入24孔板继续亚克隆。重复三次亚克隆后的阳性单克隆细胞，即为单抗单克隆细胞系，标记并冻存于液氮中保存。

实施例3 PRV-gD单克隆抗体的筛选

经过亚克隆和IPMA再次鉴定之后，一共得到13株PRV-gD阳性单克隆抗体细胞，根据亚克隆的顺序和位置命名为：1C8、2B9、3D3、4D6、5B2、6H7、7D8、8B9、9C11、7B6、11C9、12F4和13F8。IPMA结果显示这些单克隆抗体都能在细胞病变部位，特异性的对细胞上的病毒染色，经过AEC显色以后呈红色(图1为其中9株单克隆抗体的反应情况)。

PRV-HeNLH/2017的扩毒：本发明所用毒株为PRV-HeNLH/2017(GenbankID:MT775883)。将PK-15细胞接种到5个T75瓶中，当细胞长到70％，于无菌条件下倒掉培养基，用无菌PBS缓冲液洗三遍后，添加12mL维持液(血清体积含量为2％的DMEM培养基)，然后按照千分之一接毒，在37℃温箱中培养24-48h至90％细胞病变后，连同T75细胞瓶一起反复冻融三次，然后转移到无菌的50mL离心管中，8000rpm、4℃、离心15min，取上清，用0.22μm过滤器过滤后，分装600μL/管至无菌的1.5mLEP管中，冻存于-80℃冰箱备用。

PRV-HeNLH/2017的TCID

培养48h以后，病变的孔数不再发生变化，根据显微镜下观察记录的病变情况(表1)：

表1 PRV-HeNLH/2017感染48h的病变情况

使用Karber法，通过公式：lgTCID

lgTCID

PRV-HeNLH/2017的TCID

实施例4 PRV-gD的单克隆抗体的鉴定

PRV-gD的单克隆抗体与病毒的IFA反应鉴定：由于PRV-gD的单克隆抗体报道较少，为了给PRV-gD的研究提供可视化的工具，随机挑选6株，验证了单克隆抗体(3D3、4D6、5B2、9C11、7B6和12F4)与PRV反应的IFA情况。以上结果证明，单克隆抗体可以很好的与感染细胞的病毒发生特异性反应(图2)。

PRV-gD的单克隆抗体与gD蛋白的反应鉴定：为了验证筛到单抗不仅可以和PRV病毒反应也可以和gD蛋白反应，随机选4个筛到的单克隆抗体上清作为一抗，通过Western-Blot的方法与gD蛋白进行反应，结果显示：在gD位置处，均有一条特异性黑色条带，表明他们都可以与gD特异性反应(图3)。

PRV-gD的单克隆抗体亚型的鉴定：用筛到的13株单克隆抗体细胞培养上清，通过Mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(proteintech)，根据说明书操作，鉴定单抗亚型。结果显示：13株单克隆抗体重链都是IgG1型，它们的轻链都是Kappa型。

实施例5 PRV-gD的单克隆抗体中和活性的检测

腹水的制备与纯化：提前10天在10周以上的雌性BALB/c小鼠的腹腔内接种500μL灭菌过的液体石蜡，然后将培养状态良好的单抗细胞，用无菌PBS洗三遍后重悬，按5×10

本发明腹水纯化均在Akta纯化仪上操作。

(1)配制PH2.7的0.1M的甘氨酸、PH9.0的1MTris-Hcl、20mMPH7.0的PB，然后所有的缓冲液均用0.22μm的滤膜除杂，用20mM的PB缓冲液对采集的腹水进行10-20倍稀释，并用0.22μm滤膜过滤；

(2)GE的ProteinG柱子首先用水清洗5-10个柱体积，然后用20mMPH7.0的PB缓冲液平衡5-10个柱体积；

(3)上样，将稀释并过滤过的腹水上样ProteinG进行富集；

(4)洗杂，用20mMPH7.0的PB缓冲液洗除杂蛋白10个柱体积以上直至UV指示线平衡；

(5)洗脱，用PH2.7的0.1M的甘氨酸进行洗脱，收集到IgG以后立刻用PH9.0的1MTris-Hcl按照1:10(V/V)进行中和；

(6)储存柱子，洗脱完以后用双蒸水洗涤10个以上柱体积，然后用20％的乙醇冲洗，最后将柱子内充满20％的乙醇并封存。

中和效价的检测：本发明所有的中和效价都是通过以下方法检测：提前一天用PK-15细胞铺板96孔板，第二天等到细胞长到60-70％时弃掉培养基，用无菌PBS缓冲液洗三遍后，加入维持液备用；把待检样品(血清或者单抗)在56℃水浴锅放置30min以灭活补体，然后12000rpm，15min，取50μL上清用维持液在96孔板中做倍比稀释，一般8个梯度，一个96孔板检测十个样品，留两排：一排作为阳性对照，另一排作为阴性对照，然后加入50μL(200TCID

对13株单克隆抗体上清的中和试验结果显示，4株单抗上清(3D3、8B9、7B6、12F4)具有中和活性，9株单抗上清不具有中和活性(图4)。单抗上清的中和效价最高可达到2

实施例6 7B6和12F4单克隆抗体IC

将纯化的腹水，用Nanodrop按照IgG的测量方法进行定量，然后按照以下方法测定7B6和12F4单克隆抗体的IC

(1)提前一天用PK-15铺96孔板，当细胞生长到60-70％时，倒掉上清，用高压灭菌的PBS缓冲液洗三遍后添加维持液备用；

(2)将单抗从100μg/mL开始倍比稀释，然后50μL/孔，8个孔/梯度，加入96孔板，然后在96孔板中加入50μL200TCID

(3)把在37℃温育过的抗体病毒混合物加入铺有PK-15细胞的96孔板中，每个96孔板检测11个梯度，最后一排4个孔只加维持液作为阴性对照，另外4个孔只加200TCID

中和实验表明单克隆抗体7B6和12F4，在有补体和无补体参与时都可以有效中和病毒，证明两株单抗的中和活性都是非补体依赖型的。无补体参与时7B6和12F4的IC

其中分泌单克隆抗体7B6的杂交瘤细胞株7B6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C202192，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年5月27日。

实施例7 PRV-HeNLH/2017毒株LD

为了准确衡量在模式动物小鼠上致死剂量，为后续的免疫攻毒保护试验提供参考，我们首先测定了PRV-HeNLH/2017毒株的LD

表2 PRV-HeNLH/2017不同剂量攻毒后7天的死亡情况

使用Karber法，通过公式：lgLD

lgLD

PRV-HeNLH/2017的LD

实施例8 7B6单克隆抗体预防PRV致死性剂量的攻毒实验

为了进一步检测7B6在体内的抗病毒效果，我们在小鼠模型上对PRV病毒进行了攻毒保护实验。如图6所示：7B6可以为PRV的致死性攻毒，提供保护作用，且呈现剂量依赖效应。7B6在低剂量(2.5mg/kg)时有62.5％的保护作用，且随着剂量的增加保护作用增强。剂量达到15mg/kg后，7B6提供100％的保护。正常小鼠IgG免疫的，无论免疫剂量的高低均未起到保护作用，小鼠在攻毒后体重快速降低，到第五天几乎全部死亡(图6A和B)。每组随机取四只小鼠测定其脑和肺的病毒含量，Q-PCR的结果表明：与对照比较，7B6接种剂量为2.5mg/kg和5mg/kg的小鼠，脑和肺的病毒载量大约减少了3倍，而当剂量为15mg/kg时，在脑和肺组织中未检到病毒(图6C)。以上结果说明，7B6作为预防性抗体，可以在小鼠体内保护PRV的致死性感染。

实施例9 7B6单克隆抗体在PRV致死性剂量攻毒实验后的治疗效果

为了进一步检测7B6在攻毒之后是否具有中和效果，在小鼠攻毒之后的6h、24h和48h分别通过腹腔注射15mg/kg剂量的7B6。结果显示经过三次不同时间点接种7B6的小鼠，全部存活。相反，所有用正常小鼠IgG注射的小鼠全部死亡(图7B)。此外，7B6处理的小鼠在攻毒后7天，没有观察到明显的体重减轻，相反体重略有增加，且在小鼠的肺和脑组织中未检测明显的病毒拷贝(图7A和图7C)。以上结果表明，PRV致死性剂量感染小鼠后，7B6作为治疗性抗体，可以快速发挥中和作用，保护小鼠免受病毒的感染。

实施例10 7B6单克隆抗体对PRV吸附Vero细胞的抑制作用

附着到易感细胞上是PRV入侵的第一步，同样是必不可少的一步。因此，阻断病毒吸附是单抗发挥中和活性的重要途径之一，本研究采用WesternBlot，Q-PCR和流式三种方法来验证7B6是否可以抑制PRV对Vero和BHK-21细胞的吸附作用。图8A显示，1μg和10μg的7B6可以有效抑制PRV病毒的吸附，而0.1μg7B6和各种不同浓度的正常小鼠IgG不能阻断PRV对于BHK-21细胞和Vero细胞的吸附。同样如图8B所示，绝对定量PCR的结果与WesternBlot的结果一致，表明1μg和10μg的7B6可以有效抑制PRV病毒对于两种细胞的吸附。为了进一步证明7B6可以阻断PRV病毒的吸附，我们采用流式细胞仪的方法进行进一步验证。结果显示：7B6处理的病毒的荧光相对于正常小鼠IgG的荧光峰值明显左移，这说明7B6可以有效抑制PRV病毒对于两种细胞的吸附(图8C)。

实施例11 PRV-HeNLH/2017毒株的噬斑计数

病毒的计数方法有很多种，噬斑计数(pfu/mL)对于能形成噬斑的病毒是最常用的技术方法，为了后续鉴定7B6的中和作用发生附着前还是附着后，我们首先对测定了PRV-HeNLH/2017的噬斑单位，方法如下：

(1)提前一天用Vero细胞铺板12孔板，等到第二天细胞长至95％左右即形成单层细胞时，倒净培养基，无菌PBS洗3次后添加血清体积含量为2％的维持液放入37℃培养箱中备用；

(2)将PRV-HeNLH/2017用维持液做10倍倍比梯度稀释(10

(3)甩净12孔板的维持液，加入500μL/孔的各个稀释梯度的PRV-HeNLH/2017毒株，每个梯度三个重复，留三个孔加入500μL/孔的维持液作为对照，37℃培养箱孵育1h；

(4)孵育结束后，用无菌PBS洗三遍，洗掉未吸附的病毒，然后将无菌的2％低熔点琼脂糖(提前85℃融化)，等体积加入2X的DMEM(含4％体积含量的血清)中，混匀后，在感觉不到明显烫手的时，迅速加入，12孔板，500μL/孔，然后在生物安全柜的通风口吹至完全凝固后，放入37℃培养箱中，倒置培养48h；

(5)培养结束之后，在12孔板中加入，单蒸水，室温放置5min，然后甩掉单蒸水的同时甩掉孔中的琼脂糖凝胶，添加体积含量为4％的多聚甲醛，反应15min后，弃掉并用PBS洗3次，然后添加结晶紫显色10min后，弃掉结晶紫，用单蒸水清洗三遍后，肉眼可见明显的白色噬斑，计数并分析。该实验重复三次，统计分析得到PRV-HeNLH/2017毒株的噬斑单位。

实施例12 7B6单克隆抗体在病毒吸附前后对PRV感染Vero细胞的中和作用

为了进一步验证7B6可以在PRV病毒吸附之前发挥中和作用，同时验证在PRV病毒吸附到细胞上之后，抗体能否发挥中和作用，采用噬斑中和的方法进一步确认。我们对比了7B6在Vero细胞上对于PRV病毒吸附前和吸附后的中和效果。结果显示，在PRV病毒吸附前和吸附后阶段，7B6浓度为100μg/mL时，PRV感染几乎完全被抑制(图9A和B)。为了进一步确认7B6的中和效果，我们检测了7B6在浓度为0.1、1和10μg/mL时的中和作用。结果表明，7B6浓度为1μg/mL时，在吸附前阶段可阻断80％的PRV感染，而在吸附后阶段仅抑制40％的PRV感染(图9C和D)。同时阴性对照，DMEM组和正常小鼠IgG在病毒孵育前后均无中和能力。以上结果表明：7B6在PRV吸附细胞前和后都能中和病毒，并且具有剂量依赖效应。