一种用于血管钙化诊断的试剂、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于血管钙化诊断的试剂、试剂盒及应用。

背景技术

血管钙化(Vascular calcification)是糖尿病、高血压、动脉粥样硬化性血管病变及其他血管损伤等疾病普遍存在的病理改变，是心脑血管疾病高发病率及高死亡率的重要因素之一，甚至被认为是一个精确预测心血管不良事件的指标。以往认为血管钙化是钙盐在细胞内及细胞外基质的被动沉积。然而，近年发现血管钙化是一个主动的、高度可调的生物学过程，其过程类似于骨形成。血管平滑肌细胞作为心血管系统主要的构成细胞，其由收缩表型向成骨细胞样表型转变，是血管钙化发生、发展的关键病理过程。目前临床上对于血管钙化尚缺乏安全有效的治疗方法。通过冠脉造影术和双能源CT扫描技术等影像学检测方法确认血管钙化病灶时，患者的血管钙化情况一般已经较为严重，不易根治，且费用较为昂贵。即使新近发展起来的旋磨切除术或切割球囊血管成形术对已形成的钙化病灶进行治疗的效果也不甚理想。

现有技术CN 105177147 A公开了一种用于血管钙化诊断的血浆标志物、引物对、试剂盒及应用。公开了用于血管钙化诊断的血浆miRNA标志物miR-32-5p，可用于制备诊断试剂盒，用于血管钙化的临床诊断及预防检测。但检测用的的试剂常规，提取、逆转录、PCR检测的时间长、费用高、且准确性有限。

因此，寻找高效、快速、准确的检测血浆中miR-32方法，对临床及时预防和治疗血管钙化具有重要意义。

发明内容

本发明公开了一种用于血管钙化快速诊断的试剂，以及其在快速、准确的检测血浆中miR-32的含量中的应用。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种用于血管钙化诊断的试剂或试剂盒，包括：

一号试剂：rRNA PCR扩增试剂；

二号试剂：cDNA PCR扩增试剂；

三号试剂：样本释放剂。

优选的，所述三号试剂采用武汉明德生物科技股份有限公司的201101-A。

优选的，所述一号试剂和二号试剂均为Real time PCR试剂。

优选的，所述一号试剂为

优选的，所述二号试剂为TB

优选的，所述血管钙化诊断的试剂盒还包括常规PCR试剂。

优选的，所述血管钙化诊断的试剂盒包括6-10μl二号试剂和0.6-1.0μl一号试剂。

本发明的第二个目的是提供所述试剂在制备血管钙化诊断试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述试剂或试剂盒在制备血管钙化诊断制剂中的应用。

下面对本发明做进一步的解释：

常规的一步法检测试剂盒(如康为的UltraSYBR One Step RT-qPCR Kit货号：CW0659)，可有效完成细胞、组织等高表达miRNA样本中的miR-32的检测，但对血浆中弱表达的miR-32，难以完成有效检测。二号试剂是用作一步法探针检测的试剂盒，试剂盒的酶扩增活性高特异性强。然而，所检测的miR-32长度只有22bp，插入荧光探针的难度高。此外，miR-32在血浆中是以非游离状态存在的。因此，本申请人通过三号试剂释放血浆中的miR-32，并结合二号试剂和一号试剂，确保了对血浆中miR-32检测的敏感性、准确性的要求。

本发明的有益效果为：

通过三号试剂释放血浆中的miR-32，并结合二号试剂和一号试剂，确保了对血浆中miR-32检测的敏感性、准确性的要求。

在检测成本方面：旧检测方法需经提取、逆转录和qRT-PCR三个步骤，成本约100元；本发明优化后，仅需直接上样完成qRT-PCR检测，成本为30元/样本。在成本上具有明显的优势。

在检测时间方面：旧方法完成检测需经历三个步骤，需要时长约6h。优化后的检测方法，仅一个步骤，检测时长约1.5h。在检测的时效上具有明显的优势。

附图说明

图1为实施例1的miR-32的扩增曲线；

图2为实施例1的miR-32的溶解曲线；

图3为实施例2的miR-32的扩增曲线；

图4为实施例2的miR-32的溶解曲线；

图5为实施例1检测的数据和实施例2检测的数据的相关性分析结果；

图6为实施例3的内参基因的扩增曲线；

图7为实施例3的miR-32的扩增曲线；

图8为实施例3的内参基因溶解曲线；

图9为实施例3的miR-32溶解曲线；

图10为实施例4内参基因的扩增曲线；

图11为实施例4 miR-32的扩增曲线；

图12为实施例5内参基因的扩增曲线；

图13为实施例5 miR-32的扩增曲线；

图14为实施例5内参基因的溶解曲线；

图15为实施例5 miR-32的溶解曲线；

图16为实施例6内参基因的扩增曲线；

图17为实施例6 miR-32的扩增曲线；

图18为实施例6内参基因的溶解曲线；

图19为实施例6 miR-32的溶解曲线；

具体实施方式

实施例1

一、研究对象

选择2013年6月至2014年5月间南华大学附属第一医院行冠状动脉冠脉造影术和双源CTC检查确诊冠脉钙化的患者66例。排除既往有心肌梗死病史，冠状动脉或外周动脉血运重建病史者，肝肾功能不全、甲状腺或肾上腺功能紊乱，钙代谢异常，慢性感染(活动性结核、COPD迁延期)、结缔组织病、肿瘤、免疫系统疾病或精神病及其他疾病的终末期等。根据冠脉CTA的Agatston法积分(CACS)分为冠脉钙化组与对照组，其中冠状动脉钙化积分等于0分患者即非冠脉钙化组8例，而冠状动脉钙化积分大于0分患者8例。研究过程中所涉及的资料收集及血样采集均在研究对象知情同意下进行。

二、研究方法

1.血浆收集

所有纳入观察的患者均于术时抽动脉血约3ml置于10ml EDTA-K2抗凝管。标本采集后静置30分钟后，3000rpm离心10分钟取上清液血浆分装于EP管,置于-70℃低温保存血浆。

2.模板准备：将血清从冰箱拿出溶解后和三号试剂(武汉明德生物科技股份有限公司的样本释放剂；货号120030048-A)按合适比例混合均匀后静置10min，12000rpm离心5min，4℃待用。

3.配置qPCR反应体系：

其中，扩增miR-32-5p的正向引物序列如SEQ ID NO.1(GGCGGCGGTA TTGCACATTACTAA)所示，反向引物为通用反向引物，通用反向引物序列如SEQ ID NO.2(GCGCAATGCATCGCATAGCA ACTGT)所示。以U6作为内参基因，内参U6序列如SEQ ID NO.3

(GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTT)所示，内参U6的PCR正向引物序列如SEQ IDNO.4(TGGAACGCTTCACGAATTTGCG)所示，反向引物为SEQ ID NO.5(GGAACGATACAGAGAAGATAAGC)所示。

4.扩增反应程序(两步法)设置如下：

Stage 1：反转录50℃ 5min

Stage 2：预变性94℃ 30sec

Stage 3：PCR反应(40个循环)

变性 94℃ 5sec

退火 60℃ 30sec

5.研究结果与分析

如附图1和图2所示，5个临床样本的扩增曲线平滑、无杂峰，呈显著的S型特征，且Ct值处于可信度高的区间(<32)，说明此体系对血浆中miR-32的扩增效果好；溶解曲线呈单峰，说明此扩增体系中，引物与模板的结合特异性强。

实施例2常规方法

一.血浆miRNA提取

1.300μl血浆加入1ml Trizol，匀浆后，室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

2.加入300μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min

3.4℃12,000rpm(～13,400×g)离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液MZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作。

4.量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积0.43倍的无水乙醇(如：500μl的转移液加215μl无水乙醇)，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入向吸附柱miRspin中，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入向吸附柱miRspin中，分两次转入，离心后弃掉向吸附柱miRspin，保留流出液。

5.量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积0.75倍的无水乙醇(如：700μl的流出液加525μl无水乙醇)，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute中，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱miRelute中，请分两次转入，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。

6.向吸附柱miRelute中加入500μl去蛋白液MRD，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。

7.向吸附柱miRelute中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。

8.重复操作步骤6。

9.将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温12,000rpm(～13,400×g)离心1min，去除残余液体.

10.将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5ml离心管中，加15-30μlRNase-Free ddH2O，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心2min，收集得到纯净的miRNA。

二.miRNA逆转录

1. 0.2ml无酶EP管中，配置以下混合液：

2.反应程序如下：37℃反应1h后，85℃反应5min，在所得的反应液中加入90μl双蒸水，即得到所需cDNA。

3.加10μl稀释，-20度保存。

三.qRT-PCR检测

1.配置qPCR反应体系：

其中，扩增miR-32-5p的正向引物序列如SEQ ID NO.1(GGCGGCGGTA TTGCACATTACTAA)所示，反向引物为通用反向引物，通用反向引物序列如SEQ ID NO.2(GCGCAATGCATCGCATAGCA ACTGT)所示。以U6作为内参基因，内参U6序列如SEQ ID NO.3(GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTT)所示，内参U6的PCR正向引物序列如SEQ ID NO.4(TGGAACGCTTCACGAATTTGCG)所示，反向引物为SEQ ID NO.5(GGAACGATACAGAGAAGATAAGC)所示。

2.反应程序如下

Stage 1：预变性94℃ 30sec

Stage 2：PCR反应(40个循环)

变性 94℃ 5sec

退火 60℃ 30sec

三、研究结果与分析

如附图3和图4所示，5个临床样本(同图1和图2所用的5个临床样本)的扩增曲线平滑、无杂峰，呈显著的S型特征，然而Ct值处于30-36之间，可信度低于一步法结果。溶解曲线除一个主峰外，亦有一小峰出现，说明此扩增体系中，引物与模板的结合特异性较一步法低。

同时，将实施例1检测的数据和常规方法检测的数据做相关性分析，结果如图5所示。二者结果的相关系数为0.845，显示两组数据无显著性差异(P＝0.3704)。这说明，本发明的方法检测的敏感性、准确性可靠，可替换常规方法，但又在检测成本方面和检测时间方面具有明显的优势。常规方法需经提取、逆转录和qRT-PCR三个步骤，成本约100元；本发明优化后，仅需直接上样完成qRT-PCR检测，成本为30元/样本。在成本上具有明显的优势。常规方法完成检测需经历三个步骤，需要时长约6h。优化后的检测方法，仅一个步骤，检测时长约1.5h。在检测的时效上具有明显的优势。

实施例3

研究对象、血浆收集和模板准备与实施例1一致。

1.配置qPCR反应体系(康为)：

其中引物和内参同实施例1。

2.扩增反应程序(三步法)设置如下：

Stage 1 ：反转录 45℃ 10min

Stage 2：预变性 95℃ 5min

Stage 3：PCR反应(40个循环)

变性95℃ 15sec

退火60℃ 30sec

延伸72℃ 30ses

Stage 4：溶解曲线分析

3.结果分析

如附图6-9所示，内参扩增曲线欠清晰，但miR-32扩增曲线杂乱无章。从溶解曲线可知，两者的溶解曲线均非单峰且杂乱。说明此扩增体系对血浆中miR-32的扩增效果差，引物与模板的结合特异性差。

实施例4

研究对象、血浆收集和模板准备与实施例1一致。

1.配置qPCR反应体系(康为)：

其中引物和内参同实施例1。

2.扩增反应程序(三步法)设置如下：

Stage 1 ：反转录 45℃ 10min

Stage 2：预变性 95℃ 5min

Stage 3：PCR反应(40个循环)

变性95℃ 15sec

退火60℃ 30sec

延伸72℃ 30ses

Stage 4：溶解曲线分析

3.结果分析

如附图10-11所示，不同添加量的血清混合液的内参的扩增曲线尚可，但无梯度差异。miR-32的扩增曲线较杂乱，且扩增值偏高。

实施例5

只加一号试剂对检测效果的影响

研究对象、血浆收集和模板准备与实施例1一致。

1.配置qPCR反应体系：

其中引物和内参同实施例1。

2.扩增反应程序(两步法)设置如下：

Stage 1：反转录 50℃ 5min

Stage 2：预变性 94℃ 30sec

Stage 3：PCR反应(40个循环)

变性 94℃ 5sec

退火 60℃ 30sec

Stage 4：溶解曲线分析

3.结果分析

如附图12-13所示，内参和miR-32的扩增曲线较杂乱，且扩增值偏高。

如附图14-15所示，溶解曲线也同样杂乱无章。说明不加二号试剂的情况下，不能获得有效的扩增和检测结果。说明引物特异性不强。

实施例6

反应体系的影响

研究对象、血浆收集和模板准备与实施例1一致。

1.配置qPCR反应体系：

其中引物和内参同实施例1。

2.扩增反应程序(两步法)设置如下：

Stage 1：反转录 50℃ 5min

Stage 2：预变性 94℃ 30sec

Stage 3：PCR反应(40个循环)

变性 94℃ 5sec

退火 60℃ 30sec

Stage 4：溶解曲线分析

3.结果分析

如附图16-17所示，内参和miR-32的扩增曲线较杂乱。

如附图18-19所示，溶解曲线也较杂乱无章。10μl反应体系下，miR-32和内参均出现扩增，溶解曲线亦出现较规律的峰值。然而，两条曲线非峰值部分，仍显得杂乱。说明此扩增体系中，引物与模板的结合特异性较差。

SEQUENCE LISTING

<110> 南华大学附属第一医院

<120> 一种用于血管钙化诊断的试剂、试剂盒及应用

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggcggcggta ttgcacatta ctaa 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcgcaatgca tcgcatagca actgt 25

<210> 3

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gtgctcgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc 60

ccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tatttt 106

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tggaacgctt cacgaatttg cg 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ggaacgatac agagaagata agc 23