紫菀酮作为制备治疗缺血性脑卒中药物的应用

技术领域

本发明涉及药物治疗学领域，具体涉及紫菀酮作为制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。

背景技术

脑血管疾病在全球范围内已成为头号杀手，可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中，缺血性脑卒中在临床中极为常见，约占80％，属于急性脑血管类疾病的一种，不仅有着极高的发病率、致死率和致残率，而且预后并不理想，使患者的生命安全、生活质量受到严重威胁。现阶段，临床方面对于这一病症的治疗还未寻找到特效药物或方法。基础性的治疗主要包括抗凝、溶栓、抗血小板聚集、取栓、神经保护治疗和基因治疗等。近年来，随着不断加快的生活节奏以及不断提高的生活水平，再加上运动量不足，精神负担重，致使缺血性脑卒中的患病数量逐年升高。对缺血性脑卒中患者而言，该病不仅会对患者的生活质量产生影响，还会让其家庭、社会负担加重。

既往研究显示，神经炎症反应在缺血性脑卒中的发病和治疗过程中扮演着重要角色，抑制小胶质细胞免疫炎症可以有效改善缺血性卒中的预后。过度激活的小胶质细胞介导的神经炎症在缺血性中风中起重要作用。过度激活的小胶质细胞分泌大量炎症细胞因子，引起过度炎症反应，最终加重缺血性脑损伤。因此，减轻神经炎症的化合物可能成为缺血性疾病的候选药物。

紫菀酮(Shionone)是从菊科植物紫菀的干燥根及根茎中提取的有效成分，有研究报道，紫菀酮对许多炎症性疾病有抗炎作用，但在治疗缺血性脑卒中方面还未见报道，因此，本发明提供紫菀酮作为制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提供紫菀酮作为制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

紫菀酮作为制备治疗缺血性脑卒中药物的应用，紫菀酮的结构式如下：

优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

进一步地，所述治疗是通过在细胞水平和蛋白水平减轻LPS诱导的小胶质细胞的炎症反应实现的。

进一步地，所述治疗是通过在细胞水平和蛋白水平减轻MCAO小鼠大脑缺血半暗带的炎症反应实现的。

进一步地，导致炎症反应的炎症因子是IL1β、iNOS和TNF-α。

进一步地，所述治疗是通过调节AKT-mTOR-STAT3信号通路实现的。

进一步地，紫菀酮降低了LPS处理的小胶质细胞中STAT3、AKT和mTOR的磷酸化。

进一步地，紫菀酮降低了MCAO小鼠大脑缺血半暗带中STAT3、AKT和mTOR的磷酸化。

进一步地，所述药物的剂型为注射剂。

本发明的有益效果是：紫菀酮(Shionone)是从菊科植物紫菀的干燥根及根茎中提取的有效成分，紫菀酮对许多炎症性疾病有抗炎作用，本发明首次提供紫菀酮作为制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。紫菀酮作用于缺血性脑损伤的病理过程，可以改善缺血后脑功能，在体内体外均可以改善小胶质细胞的炎症反应，其机制与调节AKT-mTOR-STAT3信号通路有关。

本发明证明了紫菀酮对缺血性脑卒中具有治疗作用，紫菀酮在基因水平和蛋白水平抑制LPS激活的小胶质细胞中促炎细胞因子的产生，缓解MCAO模型小鼠的症状，并在基因水平和蛋白水平减少MCAO小鼠缺血半暗带中促炎细胞因子的产生。

本发明从整体到细胞、分子水平系统探讨了紫菀酮对缺血后脑损伤、炎症反应的影响及其分子机制，以证明紫菀酮是一种保护缺血性脑损伤的新型药物。首先从整体角度，验证了紫菀酮可以改善缺血后脑功能，降低脑梗死体积，证实了紫菀酮对缺血性脑损伤的保护作用；其次在分子生物学水平证明紫菀酮可以调控小胶质细胞的活化状态而减轻炎症反应；最后，从整体水平，用分子生物学的方法证实紫菀酮对AKT-mTOR-STAT3通路的调控作用，证实了紫菀酮可以作为治疗缺血性脑卒中的药物应用。

附图说明

图1：紫菀酮的化学结构式；

图2：qRT-PCR检测紫菀酮在细胞水平降低LPS诱导的小胶质细胞的炎症因子水平；

A：iNOS mRNA表达水平图；

B：IL-1βmRNA表达水平图；

C：TNF-αmRNΑ表达水平图；

图3：免疫印迹法检测紫菀酮在蛋白水平降低LPS诱导的小胶质细胞的炎症因子水平；

Α：WB结果；

B：IL-1β灰度值统计结果；

C：TNF-α灰度值统计结果；

D：iNOS灰度值统计结果；

图4：紫菀酮对MCAO小鼠的治疗作用，图中wt表示对照组，Sh表示给药组；PN表示缺血半暗带；

A：MCAO术后3天小鼠脑梗死体积的TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)染色结果；

B：MCAO术后梗死体积对比；

C：爪抓力对比；

D：mNSS评分对比；

E：错步对比；

F：疲劳转棒时间对比；

G：缺血半暗带(PN)IL-1βmRNA表达水平图；

H：缺血半暗带(PN)TNF-αmRNA表达水平图；

I：缺血半暗带(PN)iNOS mRNA表达水平图；

J：缺血半暗带(PN)的WB结果；

图5：紫菀酮对AKT-mTOR-STAT3信号通路的调节；

A：紫菀酮干预LPS刺激小胶质细胞的WB结果；

B：A条带的p-mTOR的灰度值统计结果；

C：A条带的p-AKT灰度值统计结果；

D：A条带的p-STAT3灰度值统计结果；

E：紫菀酮干预MCAO小鼠缺血半暗带组织的WB结果；

F：E条带的p-AKT的灰度值统计结果；

G：E条带的p-mTOR灰度值统计结果；

H：E条带的p-STAT3灰度值统计结果。

具体实施方式

紫菀酮结构式如图1所示，分子式为C

实施例1

体外研究证明紫菀酮可以减轻LPS诱导的小胶质细胞的炎症反应：

1)材料和方法

原代小胶质细胞从C57BL/6小鼠获得，在37℃的加湿培养箱中培养10天，然后分离原代小胶质细胞，重新培养在6孔板或者12孔板中，细胞培养基使用的是DMEM培养基(Thermo Fisher，USA)，含有10％的FBS(fetal bovineserum Biological Industries，Israel)以及100μ/ml的青霉素和链霉素。

将原代小胶质细胞按照相同密度分组：对照组、LPS刺激组、药物和LPS组。处理后的原代小胶质细胞弃掉上清，接着用PBS清洗，用Trizol试剂(Invitrogen)提取原代小胶质细胞和组织的总RNA。然后，用PrimeScript RT试剂盒(Vazyme Biotech)转录cDNA。qRT-PCR在ABI 7500PCR仪(Applied Biosystems)上进行，并用SYBR green Kit(Vazyme Biotech)进行。基因表达量定量归一化为GAPDH。

使用了以下引物：TNF-αForward primer(5′to 3′)：CCAAGGGACAAGGCTGCCCCG；Reverse primer(5′to 3′)：GCAGGGGCTCTTGACGGCAG；IL-1βForward primer(5′to 3′)：AAGCCTCGTGCTGTCGGACC；Reverse primer(5′to 3′)：TGAGGCCCAAGGCCACAGG；iNOS Forwardprimer(5′to 3′)：CAGCTGGGCTGTACAAACCTT；Reverse primer(5′to 3′)：CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG；GAPDH Forward primer(5′to 3′)：GCCAAGGCTGTGGGCAAGGT；Reverse primer(5′to 3′)：TCTCCAGGCGGCACGTCAGA。

2)结果

如图2所示，紫菀酮以剂量依赖的方式降低经LPS刺激诱导的原代小胶质细胞iNOS、IL-1β、TNF-α炎症因子的表达水平。

实施例2

体外研究证明紫菀酮在蛋白水平减少了促炎因子的产生：

1)材料和方法

使用免疫印迹(Western blot)测定炎症因子的表达水平，将实施例1中的不同方式处理过的原代小胶质细胞弃去上清，接着用PBS缓冲液将细胞清洗后，加入RIPA蛋白裂解液(RIPA Lysis Buffer)，刮取蛋白至离心管中，再1300rpm离心30min后吸取上清，使用BCA法进行蛋白定量，然后溶解在5x的Loading buffer中，煮沸5min。在4-20％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，将蛋白转移到PVDF膜，以5％脱脂牛奶室温封闭1小时，分别加入第一抗体(IL1β，RampD Systems，TNF-α，ab215188，Abcam，USA iNOS，610328，BD Biosciences，USA)，4℃过夜，辣根过氧化物标记二抗(1：5000)结合2小时，用增强的化学发光法测定其蛋白的表达量，β-Tubulin为内参。

2)结果

图3A展示了免疫印迹(Western blot)；图3B、C、D分别为IL1β、TNF-α、iNOS条带的灰度统计值，和CON组相比，LPS组(DMSO组)刺激的小胶质细胞中IL1β、TNF-α和iNOS均升高，而紫菀酮(SH20组、SH40组)处理后呈剂量依赖式的降低。

实施例3

体内研究证明紫菀酮对MCAO模型小鼠的治疗作用：

使用线栓法制备MCAO模型，通过口服或者腹腔注射给药，给药量为20mg/kg/天，通过行为学证明紫菀酮对缺血性脑损伤具有保护作用。

1)材料和方法

神经功能缺损程度评分(NSS)：采用改良神经功能缺损评分量表(The ModifiedNeurol ogical Severity Score，mNSS)，对小鼠神经功能缺损程度进行评分，总分18分，1-6分为轻度损伤，7-12分为中度损伤，13-18为重度损伤；

脑梗死体积计算：灌注后，快速取出脑组织，放入-80℃冰箱冷冻5～10min，自额极向后冠状切面切成2mm的厚片，放入2％TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)溶液中，37℃避光孵育30min，白色部分即为梗死区域，其他部分为正常组织，使用Imaje J软件计算梗死体积；

提取脑缺血半暗带(PN)的组织，按照实施例1和实施例2中的RNA提取方法提取RNA和蛋白，并分别通过qRT-PCR法和WB测定其炎症因子水平。

2)结果

如图4A、B所示，给药组梗死体积明显小于MCAO组，表明给药后能降低MCAO小鼠的脑梗死体积；

如图4C、D所示，给药组的爪抓力大于MCAO模型组，给药组的mNSS评分低于MCAO组，表明给药组的神经功能缺损低于MCAO组；

如图4E、F所示，给药组的错步率降低，疲劳转棒的跑步时间延长，给药后改善了MCAO小鼠的运动功能；

上述结果表明，MCAO后小鼠出现明显的脑功能障碍，而给药后能明显改善小鼠神经功能缺损。

如图4G-I所示，给药后IL-1β、TNF-α、iNOS的蛋白表达水平降低；

如图4J所示，与sham(假手术组)相比，CON组IL-1β、TNF-α、iNOS的蛋白表达水平更高，而SH给药组明显降低了IL-1β、TNF-α、iNOS的蛋白表达水平。

实施例4

紫菀酮调节AKT-mTOR-STAT3信号通路：

1)材料和方法

分别使用实施例2中提取的蛋白和实施例3中缺血半暗带组织的蛋白，使用免疫印迹(W estern blot)测定Akt、mTOR和STAT3的蛋白表达水平(Akt、mTOR和STAT3的第一抗体购自Cell Signaling Biotechnology Hertfordshire，England，β-actin、β-Dublin、mTOR购自B ioworld Biotechnology)。

2)结果

如图5所示，STAT3、AKT和mTOR的磷酸化(p-STAT3、p-AKT、p-mTOR)在LPS处理后显著增加，而紫菀酮降低了LPS处理的小胶质细胞中STAT3、AKT和mTOR的磷酸化。因此紫菀酮抑制脂多糖诱导的小胶质细胞中的AKT-mTOR-STAT3信号通路从而起到抗炎作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。