一种水产养殖中爱德华氏菌病噬菌体疗法的安全性评价方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种水产养殖中爱德华氏菌病噬菌体疗法的安全性评价方法。

背景技术

杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiellapiscicida)隶属于肠杆菌科、爱德华氏菌属，是一种臭名昭著的鱼类病原菌，能够导致危害严重的爱德华氏菌病，给世界范围内的水产养殖业造成了巨大的经济损失。鱼类一旦被杀鱼爱德华氏菌感染，往往会在多个器官中出现严重的免疫功能障碍，从而引起器官肿大、瘀斑、皮肤糜烂、鳃炎、腹水和行为异常等典型的爱德华氏菌病临床症状。美国食品和药物管理局(FDA)建议每公斤鱼服用10-15毫克氟苯尼考，连续服用时间不超过10天，以控制水产养殖中的爱德华氏菌病。但即使是环境浓度的抗生素暴露也会引起鱼类不同生长时期、不同器官中的非正常氧化应激反应和免疫失调，这对鱼类的健康生长极为不利。除此之外，在水产养殖中广泛使用抗生素还会使抗生素残留随养殖水体进入环境，加重环境风险，这无疑给水产养殖业的可持续健康发展蒙上了阴影，尤其是在倡导“One Health”的全球背景下。因此，迫切需要新的治疗药剂在缓解爱德华氏菌病的基础上尽可能避免对鱼类本身的副作用。

噬菌体是地球上最丰富的生物体，能够特异性裂解病原宿主，基于噬菌体的生物控制方法(噬菌体疗法)具有效率高、特异性强和环境友好的特点，已逐渐成为后抗生素时代的主角。噬菌体疗法在医疗上主要用于防治耐药细菌引起的感染，在水产养殖中有着更广泛的应用前景。目前噬菌体疗法在水产养殖中主要用于弧菌、气单胞菌、假单胞菌和黄杆菌引起的水产病害的防控。一方面由于获取的爱德华氏菌噬菌体纯培养数量有限，另一方面由于噬菌体疗法还没有得到足够的重视，其在防控由爱德华氏菌引起的爱德华氏菌病中的应用还相对匮乏，其对鱼类安全性(如抗氧化能力和免疫系统)的影响更是缺乏全面的认识。

因此，提供一种水产养殖中爱德华氏菌病噬菌体疗法的安全性评价方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种水产养殖中爱德华氏菌病噬菌体疗法的安全性评价方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种水产养殖中爱德华氏菌病噬菌体疗法的安全性评价方法，能够比较噬菌体EPP-1与氟苯尼考在腹腔注射时对斑马鱼的安全性；所述EPP-1的保藏编号为CGMCCNo.45078，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2022年01月10日，分类命名为杀鱼爱德华氏菌噬菌体。

进一步，一种水产养殖中爱德华氏菌病噬菌体疗法的安全性评价方法，其具体实施方案为，分为4组，分别为对照组(PBS+SM)、病原菌感染组(E.p.+SM)、抗生素治疗组(E.p.+FLO)和噬菌体治疗组(E.p.+EPP-1)，每组30尾鱼，采用腹腔注射的方式给药，连续监测7天，每天记录斑马鱼的死亡率，绘制生存曲线。

进一步，所述的一种水产养殖中爱德华氏菌病噬菌体疗法的安全性评价方法在使用时对斑马鱼个体存活率的影响。

进一步，所述的一种水产养殖中爱德华氏菌病噬菌体疗法的安全性评价方法在斑马鱼肠道和肝脏中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种水产养殖中爱德华氏菌病噬菌体疗法的安全性评价方法，为水产养殖中基于噬菌体的生物药剂开发提供了技术支撑；通过与传统抗生素氟苯尼考的疗效比较，表征其在水产养殖中防控爱德华氏菌病的效果；通过对斑马鱼肠道和肝脏中酶活性和炎症细胞因子的测定，表征其对生物体抗氧化能力和免疫系统的影响，进一步探究其对斑马鱼的微观影响；噬菌体EPP-1与氟苯尼考二者疗效相当，但噬菌体EPP-1对斑马鱼不同器官中抗氧化能力和免疫系统的影响更小，意味着其用于水产养殖中爱德华氏菌病的防治相对安全。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明安全性评价方法的实施方案图；

图2附图为本发明安全性评价方法实施过程第3天斑马鱼感染症状比较；

图3附图为本发明安全性评价方法生存曲线；

图4附图为本发明安全性评价方法对斑马鱼肠道和肝脏中酶活性的影响；

图5附图为本发明安全性评价方法对斑马鱼肠道和肝脏中免疫系统的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

噬菌体EPP-1由本实验室分离并保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(保藏编号：CGMCC No.45078)，其对应宿主MCCC 1K00246获取自中国海洋微生物菌种保藏中心，二者均保存于本实验室。

PBS缓冲液购自北京索莱宝生物科技有限公司；SM缓冲液购自上海源叶生物科技有限公司；氟苯尼考(Florfenicol)购自上海麦克林生化科技有限公司；标准模式种斑马鱼购自无锡中科水质环境技术有限公司；玻璃鱼缸为实验室自行设计定制。

实施例1斑马鱼感染症状比较

设置四组鱼缸，分别为对照组(PBS+SM)、病原菌感染组(E.p.+SM)、抗生素治疗组(E.p.+FLO)和噬菌体治疗组(E.p.+EPP-1)，每组30尾鱼，采用腹腔注射的方式给药，具体如图1所示。除对照组外其余各组感染剂量均为10

在实验周期的第1、3、7天随机取出未死亡的斑马鱼，在体视镜下观察斑马鱼的患病特征。第3天时，斑马鱼在不同治疗方案下的体表特征如图2所示，对照组与噬菌体治疗组中的斑马鱼均无明显病变，而病原菌感染组中的斑马鱼则出现游动异常，肛门红肿出血，伴有严重腹水的典型爱德华氏菌病症状，抗生素治疗组中的斑马鱼肛门处也出现了轻微的红肿出血。这意味着噬菌体EPP-1能够有效缓解爱德华氏菌感染所引起的症状，具有作为潜在生物药剂的可能性。

实施例2噬菌体EPP-1与氟苯尼考疗效比较

不同治疗方案下斑马鱼的生存曲线如图3所示，对照组(PBS+SM)在7天的养殖周期内，斑马鱼存活率为100％，意味着PBS和SM缓冲液对斑马鱼无害且注射的物理操作不会造成斑马鱼死亡；病原菌感染组(E.p.+SM)在7天的养殖周期内，斑马鱼的存活率仅为13.33％；抗生素治疗组(E.p.+FLO)在7天的养殖周期内，斑马鱼的存活率为33.33％，与病原菌感染组相比提升了20％，达到极显著的水平(p＜0.0001，Mantel-Cox test)；噬菌体治疗组(E.p.+EPP-1)在7天的养殖周期内，斑马鱼的存活率为30％，与病原菌感染组相比提升了16.7％，达到了极显著的水平(p＝0.0035，Mantel-Cox test)。噬菌体治疗组与抗生素治疗组相比并无显著差异(p＝0.2304，Mantel-Cox test)，这意味着噬菌体疗法与抗生素疗法的效果是相当的，并且抗生素还是在最优的条件下使用的。

实施例3噬菌体EPP-1与氟苯尼考对机体的微观影响

在养殖周期中的第1、3、7天随机取出斑马鱼，解剖后留存肠道和肝脏用于抗氧化能力和免疫因子的测定。具体的实验设置与生存曲线测定时一致，每次实验随机挑选3尾斑马鱼作为3次生物学重复，分别测定每尾鱼肠道和肝脏中的GSH、TNF-α和IL-6。在体视镜下解剖斑马鱼，肠道和肝脏组织解剖后置于无菌离心管中，-20℃保存，24h内测定酶活性和免疫因子。酶活性测定试剂盒购自南京建成生物有限公司，测定方法参照试剂盒说明书进行。免疫因子测定采用酶联免疫吸附法(ELISA)，鱼组织有特异性的ELISA试剂盒购自南京建成生物有限公司，测定方法参照试剂盒说明书进行，测定标准曲线采用四参数的Logistic回归，回归系数＞0.99方用于计算数据。不同组别中免疫因子含量的比较采用SidakANOVA分析。

养殖周期中不同组织的酶活性如图4所示，杀鱼爱德华氏菌的感染使肠道中的GSH含量显著降低，但经抗生素或噬菌体治疗后，在第三天，GSH含量得到显著提升，并且在实验的第7天达到与对照组相当的水平(p＝0.026，ANOVA analysis by Sidak)，同时，噬菌体治疗组与抗生素治疗组也是无差异的(p＝0.79，ANOVA analysis by Sidak)。相比之下，杀鱼爱德华氏菌感染的斑马鱼，其肝脏中的GSH含量则先升高再降低后趋于正常，这也表明斑马鱼本身具有强大的自我修复能力，能够在一定程度上抵御外界损伤。而治疗组，无论是抗生素治疗组还是噬菌体治疗组，其肝脏中的GSH含量均与对照组无异。

养殖周期中不同组织的免疫因子表达如图5所示，病原菌感染组在感染第1天时，肠道中的TNF-α含量与对照组相比显著降低。在得到氟苯尼考治疗后，TNF-α含量得到显著提高，达到与对照组相当的水平，反观噬菌体治疗组，其TNF-α含量并没有恢复到对照组的水平，但相对于杀鱼爱德华氏菌感染组而言仍然有了不少改善。在实验的第3天，抗生素由于药代动力学的损失，已经疗效甚微，肠道中TNF-α的含量与病原菌感染组相比已无显著差异(p＝0.993，ANOVA analysis by Sidak)。此时，噬菌体治疗组的免疫因子含量更接近对照组，这也表明噬菌体治疗组在给药前期可能疗效不如抗生素，但噬菌体能够利用宿主进行增殖进而持续发挥作用。在实验的末期，即感染第7天时，由于斑马鱼排便和耐受性的出现，大多数病原菌已随粪便排出或鱼体已对杀鱼爱德华氏菌耐受，肠道中的TNF-α正逐步恢复，但尚未恢复至正常水平，与对照组相比还有显著差异。而肝脏中的免疫因子表达，只有在第七天时，抗生素治疗组肝脏中的IL-6与对照组和噬菌体治疗组相比显著升高(ANOVAanalysis by Sidak)，其余均无显著差异，表明爱德华氏菌病对肝脏的影响相对较小。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。