一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株、构建方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌、构建方法及应用。

背景技术

木质纤维素是一类分布广泛、数量庞大、处理困难的可再生资源，将其转化成可再生能源具有重要意义。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，纤维素是一种高度有序、结合紧密的晶体结构，它与半纤维素紧密相连，外周由木质素包围，要将纤维素直接水解成可利用的葡萄糖相当困难。目前，木质纤维素的酶水解大多使用来源于丝状真菌的纤维素酶，比较典型的有木霉属、曲霉属和青霉属等，但酶解过程中耗酶量高、活性极易受到产物的抑制，且这些酶蛋白不耐高温，不耐酸碱，制约了其大规模应用。

嗜热纤维梭菌是目前自然界中已知的降解纤维素最高效的微生物之一，分泌的纤维小体具有极强的纤维素降解能力。纤维小体降解纤维素的能力大约是木霉属的50倍，这种高效性取决于纤维小体的特殊结构。热纤梭菌本身是一种严格厌氧的嗜热微生物，特殊的生长条件，使得分泌的木质纤维素水解酶具有较好的耐热性、杂菌污染的风险极小。

纤维膨胀蛋白是一类没有糖苷键水解活性的蛋白，它可以促使植物细胞壁中的纤维素中的纤维发生滑动从而改变纤维素的结晶结构，做到破坏纤维素结构而不产生还原糖。由于纤维膨胀蛋白可以使天然纤维材料的纤维结构变得膨胀疏松，因此可以与纤维素酶协同作用以提高木质纤维素的水解效率。但是作为有活性的重组蛋白，完整的纤维膨胀蛋白的异源表达还比较少。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌、构建方法及应用，通过纤维膨胀蛋白的协同作用增强了热纤梭菌的酶水解效率，在相同酶解条件下，相比传统的纤维素酶水解，水解效率更高。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明一方面提供了一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株，所述菌株为重组表达纤维膨胀蛋白基因Clocl-1298得到的热纤梭菌工程菌。

所述菌株为将热纤梭菌cel9K基因中SEQ ID No:1的核苷酸序列替换为纤维膨胀蛋白基因Clocl-1298的核苷酸序列重组得到的工程菌。

所述纤维膨胀蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。得到的所述热纤梭菌工程菌包括如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。

所述纤维膨胀蛋白基因Clocl-1298来源于克莱弗雷梭菌

本发明另一方面提供了一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株的构建方法，将纤维膨胀蛋白基因Clocl

优选的，以热纤梭菌为出发菌株，将热纤梭菌基因组上cel9K基因的部分序列（如SEQ ID No:1所示）替换为纤维膨胀蛋白基因Clocl-1298的基因序列，得到重组热纤梭菌工程菌株，替换后的纤维膨胀蛋白基因Clocl-1298具有如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。

所述热纤梭菌为热纤梭菌（

本发明的可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株的构建方法，具体步骤为：（1）设计及构建纤维膨胀蛋白基因插入的重组质粒PUC-Clocl-1298；（2）将纤维膨胀蛋白基因与线性化的模板质粒组成的重组质粒PUC-Clocl-1298转入热纤梭菌；（3）挑选及PCR验证阳性单克隆并培养，获得阳性转化菌株。

本发明还提供了上述可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株在木质纤维素水解中的应用，通过将热纤梭菌工程菌的厌氧发酵发酵液复配纤维素酶对秸秆纤维进行水解进行应用，包括如下步骤：

（1）木质纤维素的预处理：以常见农业秸秆为原料进行预处理，脱除木质素并提取秸秆纤维；（2）热纤梭菌的厌氧发酵：将热纤梭菌工程菌依次进行种子培养、厌氧发酵，得到发酵液；（3）纤维水解：将步骤（2）所得发酵液复配其它纤维素酶对步骤（1）处理得到的秸秆纤维进行水解。

优选的，所述步骤（1）中，木质纤维素的预处理具体过程为：将秸秆原料洗净切碎，在碱性条件下进行水热反应，充分脱除木质素后，提取秸秆纤维，脱水并充分洗去残留碱液；所述碱为氢氧化钠与亚硫酸钠；所述氢氧化钠的重量：秸秆原料绝干重为1:（4-6），所述亚硫酸钠：氢氧化钠的重量比为1:（3-5）；处理条件为：反应温度为150-160℃，时间为1-3h。

优选的，所述步骤（2）中，种子培养和厌氧发酵的过程为：A.种子培养：将从-80℃保藏的热纤梭菌工程菌的菌种置于4℃冰箱解冻，无菌条件下吸取1 mL菌种注入种子培养基中，55℃、200 rpm条件下培养16-24 h；B.厌氧发酵：随后以5%-10%（v/v）的接种量接入发酵培养基中，55℃、200 rpm下培养16-24 h。

优选的，所述步骤（2）的培养基包括体积比为40:2:1:1:1的A液、B液、C液、D液和E液，其中，A液为5 g/L碳源与10.00 g/L MOPS；B液为50.00 g/L柠檬酸三钾、31.25 g/L一水合柠檬酸、25.00 g/L Na

更进一步优选的，种子培养基中A液的碳源为5.00 g/L微晶纤维素，发酵培养基中的碳源为5.00 g/L的秸秆纤维，更优选为步骤（1）制得的秸秆纤维。

优选的，所述步骤（3）中，纤维水解的具体步骤为：pH 4.5-5.5，固液比1:(10-30)，反应温度45-55℃，单位质量秸秆纤维投加上述热纤梭菌发酵液10-20 mL、纤维素酶0-10FPU、木聚糖酶4 mg；水解时间12-48 h，搅拌速率为200 rpm。

本发明的有益效果为：本发明提供的热纤梭菌工程菌，可以高效应用在木质纤维素的水解中。经过基因工程改造，将热纤梭菌基因组上cel9K基因的部分序列替换为来自克莱弗雷梭菌

附图说明

图1为插入纤维膨胀蛋白基因Clocl-1298的重组质粒PUC-Clocl-1298图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003) 中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

实施例所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明中CTFUD培养基各组分及含量为（g/L）：3.00 二水柠檬酸钠、1.30 (NH

本发明的出发菌株热纤梭菌（

实施例1 热纤梭菌工程菌株的构建

通过替换热纤梭菌基因组上cel9K基因的部分序列构建融合蛋白来表达Clocl-1298。热纤梭菌基因组上cel9K基因中替换前的部分基因序列如SEQ ID No:1所示：

AGAACCGGAGGTTATTTATGGTGACTGCAATGGCGACGGAAAAGTTAATTCAACTGACGCTGTGGCATTGAAGAGATATATCTTGAGATCAGGTATAAGCATCAACACTGATAATGCTGATGTAAATGCTGATGGCAGAGTTA

用克莱弗雷梭菌（

ATGAATTTTAAAAAAATCAGGCTTTTCACTGCCATTTTAATTATAGCTGCTCAAGTTTTATCCTATAATTTTATCTCTTCCGCCCAACTTCAAGTTGGAGATGTCAATGGAGACAATAATGTGGATAGTATTGACTTTGCATTGATGAAAAGCTTTATATTGAAAATTATCAATACTCTTCCTGCCGAAGATTCCCTTTTGGCAGGTGACTTGGACGGAGACGGTTCTATAAACAGCATTGACTGTGCTTTAATGAAACAATATCTTCTCGGAATGATCAAAGTTTTTCCCAAAACTCAATCTCCAGCACCTACACCGACAAATACACCATTGCCTGAATACAGCGAGCCATATCCCGGATGGGATAAAATACGCTCAGGGTATGCCACTTATACCGGTTCAGGATATGTAGGCGGAATTGCCCTTTTAGATCCAATTCCTGAAGATATGGAAATTGTGGCCGTTAACAAACCCGATTTTAATTGTTACGGTGTACAGGCCGCTCTAGCCGGTGCATATTTGGAGGTAACAGGGCCTAAAGGTACCACAGTTGTCTATGTAACCGATTGCTATACGGAAGCCCCGGAAGGTGCTTTGGACCTTTGCGGAATTTCCTGTGATAAAATAGGCGATACAAATGTTCCCGGAGGTAAAATTGATGTAACATGGCGTATTATACCTGCTCCCATCACCGGAAATTTTATATACCGAATCTTGCCGGCCAGTTCAAAATGGTGGTTTGCCATACAAGTAAGAAATCACAAATATCCTGTAATGAAAATGGAATACTTTAAAGACGGCGAATGGGTCGACATTCCCAAGGACCGCTGCAACTATTTTGTGATAAATAATTTGGATACTTCCAACCTTAAAATCAGAATTACCGATATCCGCGGCAAGGTTGTAACCGATATTATAGACCCTATTCCCGACAATCTCATGAATGGCTGTTTTATCCAGGGCAATGTTCAATTTCCGGATTAA

具体实施方法步骤为：

（1）重组质粒PUC-Clocl-1298的设计及构建

PUC-Clocl-1298重组质粒的构建通过Gibson Assembly连接基因Clocl-1298片段与线性化的模板质粒pPN01，然后转入BL21并在含氨苄的胶板上涂布筛选确认。

纤维膨胀蛋白基因Clocl-1298来源于克莱弗雷梭菌（

构建重组质粒的表达载体为pPN01模板质粒，可由市售购买或由基因设计公司合成后实验室保存。模板质粒包含gapDH启动子、甲砜霉素抗性基因、

1）PCR基因扩增

以pPN01为模板质粒，在启动子P-gapD前端插入被替换DNA（SEQ ID No:1）的上游重组片段1（US），在hpt基因后端插入被替换DNA（SEQ ID No:1）的上游重组片段2（DS）、Clocl-1298基因和被替换DNA（SEQ ID No:1）的下游重组片段（INS）。

用于基因插入质粒pPN01构建的被替换DNA的三段重组片段由下面三对引物加上20-25bp模板质粒首尾连接片段经PCR获得。

上游片段1引物1：GCGGCTCAATGTTTGGAA，

上游片段1引物2：TCTGGGTCTACTCCTCCT；

上游片段2引物1：ATCTTGACGGAATGCAGG，

上游片段2引物2：TCTGGGTCTACTCCTCCT；

下游片段引物1：ACTCTACAGACTTGGCAAT，

下游片段引物2：TCCATCTGTTTTGCCCTTT。

PCR反应体系为：上、中、下游片段引物1用量各 0.4 µL，上、中、下游片段引物2用量各 0.4 µL，菌液或质粒用量1 µL，prime star 用量5 µL (效率10 s/kb)，无菌水用量3.2 µL。其中各引物浓度均为10 μM。

PCR反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。

2）pPN01模板质粒的线性化及载体片段的回收：

将pPN01模板质粒线性化，使用的引物及PCR条件如下：

引物1：CTTACTCTAGCAGACTTGGCAATG，

引物2：TCCATCTGTTTCGTTTGCCCTTTCC。

PCR反应体系为：引物1用量 0.4 µL，引物2用量 0.4 µL，菌液或质粒用量1 µL，prime star 用量5 µL (效率10 s/kb)，无菌水用量3.2 µL。其中各引物浓度均为10 μM。

PCR反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。

将三段重组片段和Clocl_1298与线性化后的模板质粒pPN01用Gibson Assembly（三段重组片段和Clocl_1298各30 ng，线性化后的模板质粒pPN01 30 ng，GibsonAssembly 5 µL，无菌水补足至10 µL，50℃保温1 h）连接，然后转入大肠杆菌感受态细胞BL21并在含氨苄的胶板上涂布，长出菌落后用下面一对引物做PCR筛选确认。得到插入Clocl-1298基因的重组质粒PUC-Clocl-1298。

引物1：AGCGGTAAAAGTGAAGAAC，引物2：TGGGCCCCTACTAAAATGA。PCR反应体系为：引物1用量0.4 µL，引物2用量0.4 µL，菌液或质粒用量1 µL，prime star 用量5 µL (效率10s/kb)，无菌水用量3.2 µL，其中各引物浓度均为10 μM。PCR反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。

将PCR扩增之后的反应液进行琼脂糖凝胶电泳实验（2%琼脂糖，110 V，30 min），阳性验证胶图条带大小为473 bp，说明Clocl-1298基因成功插入模板质粒pPN01。

图1为插入Clocl-1298基因的重组质粒PUC-Clocl-1298图谱，其中上游片段1为923 bp，上游片段2为370 bp，下游片段为877 bp。

（2）重组质粒PUC-Clocl-1298的转入

利用电转化将重组质粒PUC-Clocl-1298转入热纤梭菌PN2102，经过同源重组和抗性筛选将目的基因序列插入热纤梭菌基因组。其操作步骤如下：

1）细胞生长

将50 mL的菌液培养至OD600=0.6-1后，将其置于冰上放置20分钟。

2）细胞收集与洗涤

在6500 g、4℃条件下离心10分钟收集热纤梭菌细胞，离心完成后小心倒掉上清液，再向离心管或离心瓶中小心加入洗涤缓冲液（经蒸汽灭菌过的反渗透纯化水），加的过程中不要搅动沉淀，然后再次在6500 g、4℃条件下离心10分钟，小心倒掉上清液，重复上述步骤两次。

3）电转化

将收集到的细胞放进厌氧室中，用100 μL 厌氧的洗涤缓冲液将其轻轻重悬。随后在标准的 1 mm 电转杯中，加入 20 μL 细胞悬液和1 μg DNA，充分混匀。设置电转条件为电压1500 V、持续时间1.5 ms 进行电转化。

4）孵育电转化细胞

用1 mL CTFUD培养基将电转后热纤梭菌PN2102感受态细胞重新混合，在51℃下孵育16小时。

（3）阳性单克隆挑选及验证

1）筛选转化细胞

CTFUD 固体培养基融化并冷却至55℃，将6 mg/mL 的甲砜霉素1 mL与50 μL 孵育后的电转化细胞加入到20 mL CTFUD 固体培养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基凝固30分钟，随后将平板放置在55℃下培养3-5天。

2）挑选单克隆菌落，用下面一对引物做PCR验证PUC-Clocl-1298重组质粒是否已经转入热纤梭菌PN2102感受态细胞。

引物1：AGCGGTAAAAGTGAAGAAC；引物2：TGGGCCCCTACTAAAATGA。

PCR反应体系为：引物1用量 0.4 µL，引物2用量 0.4 µL，菌液或质粒用量1 µL，prime star 用量5 µL (效率10 s/kb)，无菌水用量3.2 µL。其中各引物浓度均为10 μM。

PCR反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。

将PCR扩增之后的反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳（110 V，30 min）实验。阳性验证胶图条带大小为473 bp，说明重组质粒PUC-Clocl-1298成功转入热纤梭菌感受态细胞中。

把经过验证的单克隆细胞菌落接入含有甲砜霉素（6 mg/mL）的CTFUD 液体培养基在55℃培养1-2天。

3）取10 μL到1 mL培养液加入到20 mL 含有甲砜霉素（6 mg/L）和FUDR（10 mg/L）的CTFUD固体培养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基凝固30分钟，随后将平板放置在55℃下培养2-5天。

4）挑选单克隆菌落，用下面一对引物做PCR验证质粒PUC-Clocl-1298中的上游片段1和下游片段是否已重组到热纤梭菌PN2102基因组上。

引物1：GCGGCTCAATGTTTGGAA；

引物2：TCCATCTGTTTTGCCCTTT。

PCR反应体系为：引物1用量 0.4 µL，引物2用量 0.4 µL，菌液或质粒用量1 µL，prime star 用量5 µL (效率10 s/kb)，无菌水用量3.2 µL。其中各引物浓度均为10 μM。

PCR反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。

将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳（110 V，30 min）实验。阳性验证胶图条带大小为5014 bp，说明重组质粒中的上游片段1和下游片段已重组到热纤梭菌基因组上。

把经过验证的单克隆细胞菌落加入到20 mL 含有8AZH（500 mg/L）的CTFUD固体培养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基凝固30分钟，随后将平板放置在55℃下培养2-5天。

5）挑选单克隆菌落，用下面一对引物做PCR验证重组热纤梭菌基因组上两个上游片段2是否已重组。

引物1：GCGGCTCAATGTTTGGAA；

引物2：TCCATCTGTTTTGCCCTTT。

PCR反应体系为：引物1用量 0.4 µL，引物2用量 0.4 µL，菌液或质粒用量1 µL，prime star 用量5 µL (效率10 s/kb)，无菌水用量3.2 µL。其中各引物浓度均为10 μM。

PCR反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。

将PCR扩增产物跑胶（2%琼脂糖凝胶电泳，110 V，30 min），阳性验证胶图条带大小为2784 bp，说明两个上游片段2已重组到热纤梭菌基因组上。

把经过验证的单克隆细胞菌落加入5 mL培养基培养1-2天后保存。

实施例2 热纤梭菌工程菌的发酵培养

（1）培养基的配制

本实施例的培养基采用MTC培养基，按照表1配制。A液配制结束后，121℃、20 min灭菌处理；B、C、D、E液按表配制完成，装于厌氧瓶中，加胶塞铝盖密封后反复抽真空充入高纯氮气3次，最后保持厌氧瓶内为正压。5种培养液按照40:2:1:1:1（v/v）在超净台内使用一次性无菌注射器和0.22 μm无菌滤膜注入已灭菌装有A液的厌氧瓶中，总体积不超过厌氧瓶体积的40%。其中，A液中的碳源（微晶纤维素或者秸秆纤维），种子培养基中使用微晶纤维素Avicel PH105，浓度为5 g/L；发酵产酶时使用秸秆纤维，浓度为5 g/L。

表1 培养基配方

（2）种子液的制备：将从-80℃保藏的热纤梭菌工程菌菌种置于4℃冰箱解冻，无菌条件下吸取1 mL注入种子培养基中，55℃、200 rpm条件下培养24 h；其中种子培养基的配方如表1所示，A液中的碳源为5.00 g/L的微晶纤维素（Avicel PH 105）。

（3）发酵：将上述种子液以10%（v/v）的接种量接入发酵培养基中，55℃、200 rpm下培养16 h，得到发酵液。发酵培养基的配方如表1所示，碳源为5.00 g/L的秸秆纤维，秸秆纤维可通过对农业秸秆预处理提取得到，参见实施例4步骤（1）。

实施例4 热纤梭菌工程菌在木质纤维素水解中的应用

（1）小麦秸秆纤维的制备：

将小麦秸秆原料洗净切碎，采用氢氧化钠和亚硫酸钠进行处理，氢氧化钠重量：小麦秸秆原料绝干重为1:6，亚硫酸钠：氢氧化钠重量比为1:3，处理条件为：反应温度为150℃，时间为2 h。充分脱除木质素后，提取小麦秸秆纤维，脱水并充分洗去残留碱液；

（2）小麦秸秆纤维的水解：

将秸秆纤维浸泡在乙酸-乙酸钠（或同类具备缓冲效应的缓冲对）缓冲液中，投加热纤梭菌发酵液，进行秸秆纤维的水解，得到水解液。水解条件如下：pH 5，固液比1:10，单位质量秸秆纤维的热纤梭菌发酵液投加量为20 mL、纤维素酶10 FPU、木聚糖酶为4 mg，反应温度为50℃、反应时间24 h，震荡速率为200转/分钟。

水解结束时，水解液中的木糖浓度约为8.00 g/L，葡萄糖浓度为64.50 g/L。相同条件下，使用热纤梭菌

以上对本发明的实例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州聚维元创生物科技有限公司

<120> 一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株、构建方法及应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 143

<212> DNA

<213> 热纤梭菌基因组上cel9K基因

<400> 1

agaaccggag gttatttatg gtgactgcaa tggcgacgga aaagttaatt caactgacgc 60

tgtggcattg aagagatata tcttgagatc aggtataagc atcaacactg ataatgctga 120

tgtaaatgct gatggcagag tta 143

<210> 2

<211> 984

<212> DNA

<213> 纤维膨胀蛋白基因Clocl-1298的核苷酸

<400> 2

atgaatttta aaaaaatcag gcttttcact gccattttaa ttatagctgc tcaagtttta 60

tcctataatt ttatctcttc cgcccaactt caagttggag atgtcaatgg agacaataat 120

gtggatagta ttgactttgc attgatgaaa agctttatat tgaaaattat caatactctt 180

cctgccgaag attccctttt ggcaggtgac ttggacggag acggttctat aaacagcatt 240

gactgtgctt taatgaaaca atatcttctc ggaatgatca aagtttttcc caaaactcaa 300

tctccagcac ctacaccgac aaatacacca ttgcctgaat acagcgagcc atatcccgga 360

tgggataaaa tacgctcagg gtatgccact tataccggtt caggatatgt aggcggaatt 420

gcccttttag atccaattcc tgaagatatg gaaattgtgg ccgttaacaa acccgatttt 480

aattgttacg gtgtacaggc cgctctagcc ggtgcatatt tggaggtaac agggcctaaa 540

ggtaccacag ttgtctatgt aaccgattgc tatacggaag ccccggaagg tgctttggac 600

ctttgcggaa tttcctgtga taaaataggc gatacaaatg ttcccggagg taaaattgat 660

gtaacatggc gtattatacc tgctcccatc accggaaatt ttatataccg aatcttgccg 720

gccagttcaa aatggtggtt tgccatacaa gtaagaaatc acaaatatcc tgtaatgaaa 780

atggaatact ttaaagacgg cgaatgggtc gacattccca aggaccgctg caactatttt 840

gtgataaata atttggatac ttccaacctt aaaatcagaa ttaccgatat ccgcggcaag 900

gttgtaaccg atattataga ccctattccc gacaatctca tgaatggctg ttttatccag 960

ggcaatgttc aatttccgga ttaa 984