一种配方奶粉中低聚异麦芽糖含量的检测方法

技术领域

本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种配方奶粉中低聚异麦芽糖含量的检测方法。

背景技术

低聚异麦芽糖(Isomaltooligosaccharide，IMO)是以淀粉或淀粉质为原料，经酶法转化、精制、浓缩等工艺制得的一种淀粉糖产品。主要成分为α-1,6-糖苷键结合的异麦芽糖(IG

目前，我国在食品中低聚异麦芽糖的检测方面尚未有标准文件，仅有GB/T 20881-2017《低聚异麦芽糖》，而该标准仅适用于低聚异麦芽糖纯品(低聚异麦芽糖浆或糖粉)的检测，对于配料较复杂的食品，暂未有相关国家标准检测方法。因低聚异麦芽糖的主要成分有异麦芽糖，其是由两个葡萄糖分子以α-1,6糖苷键连接起来的双糖，若待测样品中含有除异麦芽糖以外的双糖，如乳糖，因其出峰时间与异麦芽糖重叠，无法用高效液相色谱法对低聚异麦芽糖进行定性和定量测定，相应的异麦芽糖、乳糖高效液相色谱图如图1、图2所示，异麦芽糖、乳糖出峰时间一致，无法准确定性、定量。

配方奶粉及其相关产品中大部分均含有乳糖，因此现有的检测方法无法对配方奶粉进行准确的定性和定量测定。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种配方奶粉中低聚异麦芽糖含量的检测方法，用于解决现有的检测方法无法针对配方奶粉进行准确的定性和定量测定的技术问题，从而达到准确检测配方奶粉中低聚异麦芽糖含量的目的。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种配方奶粉中低聚异麦芽糖含量的检测方法，包括以下步骤：

步骤S1：配制盐酸溶液、氢氧化钠溶液、PBS缓冲液以及β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶溶液；

步骤S2：分别称取异麦芽糖标准品、潘糖标准品以及异麦芽三糖标准品，配置成不同浓度的异麦芽糖标准工作液、潘糖标准工作液以及异麦芽三糖标准工作液；

步骤S3：采用高效液相色谱法，并按照一定的色谱条件，得到不同浓度的标准工作液中异麦芽糖、潘糖以及异麦芽三糖在色谱图中的峰面积值，并以所述峰面积值为纵坐标，以对应的标准工作液的浓度值为横坐标，建立异麦芽糖标准曲线、潘糖标准曲线以及异麦芽三糖标准曲线；

步骤S4：称取待测样品，加入所述β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶溶液配置成待测液；

步骤S5：用高效液相色谱法得到所述待测液中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖在色谱图中的峰面积值，根据所述峰面积值在对应的标准曲线中查得所述待测液中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的浓度，再通过换算公式得到所述待测样品中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的含量。

作为本发明优选的实施方式，在所述步骤S4中，所述待测液的配置过程为：

精密称取待测样品2～5g；

向所述待测样品中加入45℃～50℃的水20ml，混合均匀，静置10min，冷却至室温；

利用所述盐酸溶液调节pH值至1.7±0.1，放置1min；

利用所述氢氧化钠溶液调节pH值至4.5±0.1；

加入5mL所述β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶溶液，摇匀，置于60℃恒温水浴锅中振荡60min，迅速冷却后，并用水定容至50mL，摇匀，过滤膜至样品瓶中，作为待测液。

作为本发明优选的实施方式，所述色谱条件包括：氨基色谱柱、流动相、检测器温度、柱温、流速以及进样量；

其中，所述氨基色谱柱的柱长为250mm，内径为4.6mm，膜厚为5μm；按重量百分比计，所述流动相由73％的乙腈和27％的水组成；所述检测器温度为35℃，所述柱温为35℃，所述流速为1.0mL/min，所述进样量为10μL。

作为本发明优选的实施方式，所述盐酸溶液的浓度为5.0mol/L或0.1mol/L。

作为本发明优选的实施方式，所述氢氧化钠溶液的浓度为5.0mol/L和/或0.1mol/L。

作为本发明优选的实施方式，所述PBS缓冲液的pH值为6.0，制备过程为：称取1.1g的磷酸二氢钾和0.3g的磷酸氢二钾，用水定容至50mL。

作为本发明优选的实施方式，所述β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶溶液的制备过程为：称取0.8g的β-半乳糖苷酶和0.5g的葡萄糖氧化酶于同一比色管中，用10mL的所述PBS缓冲液溶解，混合均匀，现配现用。

作为本发明优选的实施方式，所述β-半乳糖苷酶的活力≥240U/mg，所述葡萄糖氧化酶的活力≥15U/mg。

作为本发明优选的实施方式，所述异麦芽糖标准品、所述潘糖标准品以及所述异麦芽三糖标准品的纯度均大于95％。

作为本发明优选的实施方式，所述水、所述盐酸溶液中的水以及所述氢氧化钠溶液中的水均为GB/T 6682规定的一级水。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明所提供的检测方法，利用β-半乳糖苷酶对配方奶粉中的乳糖进行酶解，从而除去乳糖的干扰，并利用高效液相色谱法实现对配方奶粉中的低聚异麦芽糖进行准确的定性和定量检测；

(2)本发明对配方奶粉原料及其产品建立统一的样品前处理方法，为配方奶粉中低聚异麦芽糖含量的检测提供技术支撑，弥补现有分析技术的空白，助力行业发展与监管。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1-是本发明异麦芽糖工作液的色谱图；

图2-是本发明乳糖工作液的色谱图；

图3-是本发明实施例的标准工作液浓度5的色谱图；

图4-是本发明实施例1的第一待测液色谱图；

图5-是本发明实施例2的第二待测液色谱图；

图6-是本发明实施例3的第三待测液色谱图；

图7-是本发明对比例的不含有低聚异麦芽糖的配方奶粉待测液色谱图；

图8-是本发明对比例的含有低聚异麦芽糖且加入β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶溶液的配方奶粉待测液色谱图。

具体实施方式

本发明所提供的配方奶粉中低聚异麦芽糖含量的检测方法，包括以下步骤：

步骤S1：配制盐酸溶液、氢氧化钠溶液、PBS缓冲液以及β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶溶液。

进一步地，盐酸溶液的浓度包括5.0mol/L和0.1mol/L，制备过程具体如下：

量取45mL的盐酸(分析纯)，并用GB/T 6682规定的一级水稀释并定容至100mL，获得浓度为5.0mol/L的盐酸溶液；

量取9mL的盐酸(分析纯)，并用GB/T 6682规定的一级水稀释并定容至1000mL，获得浓度为0.1mol/L的盐酸溶液。

一个高浓度盐酸溶液(5.0mol/L)，一个低浓度盐酸溶液(0.1mol/L)，2种浓度的盐酸溶液用于调节溶液pH值。

进一步地，氢氧化钠溶液的浓度包括5.0mol/L和0.1mol/L，制备过程具体如下：

称取20g的氢氧化钠(分析纯)，加入50ml的GB/T 6682规定的一级水，冷却后，用GB/T 6682规定的一级水定容至100mL，获得浓度为5.0mol/L的氢氧化钠溶液；

称取0.4g的氢氧化钠(分析纯)，加入50ml的GB/T 6682规定的一级水，冷却后，用GB/T 6682规定的一级水定容至100mL，获得浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液。

一个高浓度氢氧化钠溶液(5.0mol/L)，一个低浓度氢氧化钠溶液(0.1mol/L)，2种浓度的氢氧化钠溶液可用于调节溶液pH值。

进一步地，PBS缓冲液的pH值为6.0，制备过程为：称取1.1g的磷酸二氢钾(分析纯)和0.3g的磷酸氢二钾(分析纯)，用GB/T 6682规定的一级水定容至50mL。

进一步地，β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶溶液的制备过程为：称取0.8g的β-半乳糖苷酶和0.5g的葡萄糖氧化酶于同一比色管中，并用10mL的PBS缓冲液溶解，混合均匀，现配现用。

更进一步地，β-半乳糖苷酶的活力≥240U/mg，葡萄糖氧化酶的活力≥15U/mg。

步骤S2：分别称取异麦芽糖标准品、潘糖标准品以及异麦芽三糖标准品，配置成不同浓度的异麦芽糖标准工作液、潘糖标准工作液以及异麦芽三糖标准工作液。

进一步地，异麦芽糖标准品、潘糖标准品以及异麦芽三糖标准品的纯度均＞95％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

步骤S3：采用高效液相色谱法，并按照一定的色谱条件，得到不同浓度的标准工作液中异麦芽糖、潘糖以及异麦芽三糖在色谱图中的峰面积值，并以峰面积值为纵坐标，以对应的标准工作液的浓度值为横坐标，建立异麦芽糖标准曲线、潘糖标准曲线以及异麦芽三糖标准曲线。

进一步地，高效液相色谱法所采用的仪器包括：高效液相色谱仪、流动相真空抽滤脱气装置、微孔滤膜以及分析天平。

更进一步地，高效液相色谱仪配有示差折光检测器和柱恒温系统，分析天平的精度为0.1mg。

进一步地，上述色谱条件包括：氨基色谱柱、流动相、检测器温度、柱温、流速以及进样量。

更进一步地，氨基色谱柱的柱长为250mm，内径为4.6mm，膜厚为5μm，或具有同等性能的色谱柱。

更进一步地，流动相由73％的乙腈和27％的水组成，乙腈为色谱纯。

更进一步地，检测器温度为35℃，柱温为35℃，流速为1.0mL/min，进样量为10μL。

步骤S4：称取待测样品，加入所述β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶溶液配置成待测液。

进一步地，待测液的配置过程具体如下：

精密称取试样2～5g(精确至0.0001g，应使各种糖的含量在标准曲线线性范围内，否则可适当增加、减少称样量或稀释处理)于100mL烧杯中，加入20ml的45℃～50℃水(GB/T6682规定的一级水)，混合均匀，静置10min，冷却至室温；

用盐酸溶液调节上述溶液的pH值至1.7±0.1，放置1min，再用氢氧化钠溶液调节pH值至4.5±0.1；

将承载有试样的烧杯放入超声振荡器中超声10min后，将烧杯中的溶液转移至50mL离心管中，用水(GB/T 6682规定的一级水)冲洗烧杯，将洗液合并至50mL离心管中，加入5mLβ-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶，摇匀，置于60℃恒温水浴锅中振荡60min，迅速冷却后，转移至50mL容量瓶中，并用水(GB/T 6682规定的一级水)定容至50mL，摇匀，过滤膜至样品瓶中，作为待测液。

步骤S5：用高效液相色谱法得到待测液中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖在色谱图中的峰面积值，根据峰面积值在对应的标准曲线中查得待测液中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的浓度，再通过换算公式得到待测样品中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的含量。

更进一步地，待测样品中各糖含量按以下换算公式进行计算：

式中，X为待测样品中各糖(异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖)的含量，单位为克每百克(g/100g)；c为待测液中各糖的浓度，单位为亳克每毫升(mg/mL)；V为定容体积，单位为毫升(mL)；d为稀释倍数，m为试样的质量，单位为克(g)；100为换算系数，1000为换算系数。

本发明基于的原理如下：

乳糖为D-葡萄糖与D-半乳糖以β-1,4键结合的二糖，又称为1,4-半乳糖苷葡萄糖。乳糖酶是人体中的一种消化酶，是以母乳/奶粉为主要营养来源的婴幼儿体内最重要的消化酶，广泛存在于各种动植物及微生物中，包括β-半乳糖苷酶、酸性β-半乳糖苷酶和异β-半乳糖苷酶，后两种酶很少对乳糖起作用。乳糖酶的主要功能是消化乳糖，将乳糖水解成能够被人体吸收的半乳糖和葡萄糖。因此，本发明利用β-半乳糖苷酶定向酶解配方奶粉中的乳糖，以除去乳糖的干扰，再配合高效液相色谱法等其他技术手段，从而实现配方奶粉中低聚异麦芽糖含量的准确测定。

以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的范围并不限制于此。

配制标准溶液

利用分析天平(精度为0.1mg)分别称取适量的异麦芽糖标准品、潘糖标准品以及异麦芽三糖标准品，配置成六种不同浓度的标准工作液，具体如表1所示：

表1标准工作液浓度表

利用高效液相色谱仪检测上述六种不同浓度的标准工作液，色谱条件具体如下：

a)氨基色谱柱：柱长250mm，内径4.6mm，膜厚5μm；

b)流动相：乙腈：水＝73：27(按重量比计)；

c)检测器温度：35℃；

d)柱温：35℃；

e)流速：1.0mL/min；

f)进样量：10μL。

测试结果具体如表2所示：

表2标准工作液峰面积表

其中，浓度5的标准工作液的色谱图，如图3所示。

以上述六种浓度的标准工作液的浓度值为横坐标，峰面积值为纵坐标，建立线性方程，并获得对应的相关系数，具体如表3所示：

表3异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的线性方程、相关系数

由表3中的相关系数可看出，异麦芽糖、异麦芽三糖以及潘糖线性关系良好。

实施例1

称取2g配方奶粉于100ml烧杯中，加45℃水20ml，混合均匀，静置10min，冷却至室温；用盐酸溶液调节pH值至1.6，放置1min；用氢氧化钠溶液调节pH值至4.4；将烧杯放入超声振荡器超声10min后，将烧杯中的溶液转移至50mL离心管中，用水(GB/T 6682规定的一级水)冲洗烧杯，将洗液合并至50mL离心管中，加入5mLβ-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶，摇匀，置于60℃恒温水浴锅中振荡60min，迅速冷却后，转移至50mL容量瓶中，并用水(GB/T 6682规定的一级水)定容至50mL，摇匀，过滤膜至样品瓶中，作为第一待测液。将第一待测液上高效液相色谱仪进行色谱分析，得到第一待测液的色谱图，如图4所示。

实施例2

称取3g配方奶粉于100ml烧杯中，加47℃水20ml，混合均匀，静置10min，冷却至室温；用盐酸溶液调节pH值至1.7，放置1min；用氢氧化钠溶液调节pH值至4.5；将烧杯放入超声振荡器超声10min后，将烧杯中的溶液转移至50mL离心管中，用水(GB/T 6682规定的一级水)冲洗烧杯，将洗液合并至50mL离心管中，加入5mLβ-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶，摇匀，置于60℃恒温水浴锅中振荡60min，迅速冷却后，转移至50mL容量瓶中，并用水(GB/T 6682规定的一级水)定容至50mL，摇匀，过滤膜至样品瓶中，作为第二待测液。将第二待测液上高效液相色谱仪进行色谱分析，得到第二待测液的色谱图，如图5所示。

实施例3

称取5g配方奶粉于100ml烧杯中，加50℃水20ml，混合均匀，静置10min，冷却至室温；用盐酸溶液调节pH值至1.8，放置1min；用氢氧化钠溶液调节pH值至4.6；将烧杯放入超声振荡器超声10min后，将烧杯中的溶液转移至50mL离心管中，用水(GB/T 6682规定的一级水)冲洗烧杯，将洗液合并至50mL离心管中，加入5mLβ-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶，摇匀，置于60℃恒温水浴锅中振荡60min，迅速冷却后，转移至50mL容量瓶中，并用水(GB/T 6682规定的一级水)定容至50mL，摇匀，过滤膜至样品瓶中，作为第三待测液。将第三待测液上高效液相色谱仪进行色谱分析，得到第三待测液的色谱图，如图6所示。

对比例

为验证权利中所述β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶溶液的添加量可完全除去乳糖的干扰，取不含低聚异麦芽糖的配方奶粉，加入β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶溶液，其他与实施例1保持一致，得到的色谱图如图7所示。通过对比图2和图7可看出，在乳糖出峰时间处，图7没有色谱峰，说明待测液中的乳糖已经被完全除去。

另取含有低聚异麦芽糖的配方奶粉，不加入β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶溶液进行处理，其他与实施例1保持一致，得到的色谱图如图8所示。通过图4和图8可看出，出峰顺序依次为异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖，通过对比含量可看出，图8中异麦芽糖的峰面积值明显小于图4中异麦芽糖的峰面积值，说明β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶能有效除去配方奶粉中的乳糖。

由图4至图6可得到实施例1至实施例3的峰面积值，具体如表4所示：

表4实施例1至实施例3的峰面积值

根据异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的线性方程得到实施例1至实施例3的待测液中异麦芽糖峰、潘糖以及异麦芽三糖的浓度，具体如表5所示：

表5实施例1至实施例3中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的浓度

根据异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的浓度通过上述换算公式进行换算，得到实施例1至实施例3配方奶粉中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的含量，如表6所示：

表6实施例1至实施例3配方奶粉中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的含量

为了验证本发明的可行性与准确性，以实施例3为基础分别加入3个浓度梯度的标液，每个浓度分别做6次重复实验，按上述方法进行加标回收率的实验，结果如表7所示，方法检测限的结果如表8所示：

表7加标回收率

表8方法检出限

注：方法检出限为一个给定的分析方法在特定条件下能以合理的置信水平检出被测物的最小浓度；本发明利用已知低浓度的分析物样品与空白样品的测量信号进行比较，以此确定可靠检出的最小浓度，选用的信噪比为3:1。

由表7和表8可看出，本发明对于目标化合物的加标回收率达到98.3％-100.2％，方法检出限达到了0.5-0.6g/100g，说明本发明提供的检测方法回收率良好，准确度较高。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。