酚磺乙胺及其纳米制剂在制备治疗脊髓损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及酚磺乙胺及其纳米制剂在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

背景技术

脊髓损伤是最常见的一种神经系统损伤，随着建筑业、运输业及体育运动等不断发展，人口老龄化的全面加剧，这些损伤的发生率逐年增多，且年轻化的趋势越来越明显，给患者的生命健康带来严重的威胁，对家庭社会造成极为承重的经济负担。

其中，脊髓损伤后出血是导致神经元死亡、继发性损伤加重及功能缺失的重要病理现象。经研究发现，大鼠脊髓损伤后12小时内，在损伤区局部均存在未破裂红细胞，表明损伤后经受损血脑屏障出血持续时间较长，其破裂后释放的大量有害物质会引起脊髓继发性损伤。因此，早期止血有利于减轻继发性损伤。但创伤后机体本身处于高凝状态，过度止血可能引起深静脉栓塞事件，严重时甚至危及生命。

发明内容

本发明的目的在于提供酚磺乙胺及其纳米制剂在制备治疗脊髓损伤药物中的应用，本发明提供的酚磺乙胺及其纳米制剂用于脊髓神经止血时无明显血栓形成，用于治疗脊髓损伤能够显著促进脊髓损伤后运动功能恢复，且未观察到明显血栓形成，为临床治疗脊髓损伤早期出血的潜在药物。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了酚磺乙胺在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

优选的，所述治疗脊髓损伤为对脊髓神经止血。

优选的，所述药物中酚磺乙胺的有效用量为0.1g/kg。

优选的，所述酚磺乙胺为酚磺乙胺纳米制剂。

优选的，所述酚磺乙胺纳米制剂的粒径为60～100nm。

优选的，所述酚磺乙胺纳米制剂包括酚磺乙胺和药物载体。

优选的，所述药物载体包括聚酯、壳聚糖、明胶、光聚合水凝胶、脂质体、淀粉和海藻酸钠中的一种或多种。

优选的，所述聚酯包括聚己内酯、乙交酯-L-丙交酯-己内酯三元无规共聚物、聚-DL-乳酸-聚乙二醇共聚物、聚L-丙交酯和聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或多种。

优选的，所述光聚合水凝胶包括甲基丙烯酰化壳聚糖、甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化丝素蛋白、甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化海藻酸和甲基丙烯酰化葡聚糖中的一种或多种；

所述脂质体由磷脂、胆固醇和α-生育酚制备得到。

本发明提供了酚磺乙胺在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。本发明实施例表明：本发明分别采用大鼠脊髓挫伤和半切模型，选择酚磺乙胺为干预药物，选择酚磺乙胺为止血干预药物，未观察到明显血栓形成，提示酚磺乙胺为临床治疗脊髓损伤早期出血的潜在药物。分别在脊髓挫伤后即刻、损伤后不同时间点尾静脉注射酚磺乙胺，发现酚磺乙胺可有效减少损伤区面积、坏死细胞数量，并增加损伤旁区神经元存活、减轻星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞活化，并促进大鼠脊髓损伤后运动功能恢复。

进一步的，在本发明中，所述酚磺乙胺为酚磺乙胺纳米制剂。本发明实施例表明：与对照组及酚磺乙胺市售普通制剂组相比，本发明提供的纳米制剂止血药物可显著降低大鼠脊髓损伤后促炎性免疫因子TNFα、iNOS、IL-12的转录水平；可显著升高大鼠脊髓损伤后抑炎性免疫因子Arginase1、Ym1、IL-4、IL-10的转录水平；可增加大鼠脊髓损伤后损伤旁区神经元存活和大鼠脊髓损伤后损伤区周围及中心残存神经纤维数量。以上结果提示本发明提供的酚磺乙胺纳米制剂除止血作用减轻脊髓继发损伤外，纳米制剂到达损伤组织局部后可还善损伤局部免疫微环境，为损伤区周围神经元存活提供良好的生存环境，从而促进损伤区周围神经元存活、增加神经纤维数量，进而促进脊髓损伤后运动功能恢复。从而，与对照组及酚磺乙胺市售普通制剂(国药集团容生制药有限公司，10支，每支规格为：2mL：0.5g)组相比，本发明提供的纳米制剂止血药物可显著促进大鼠脊髓损伤后BBB(Basso,Beattie&Bresnahanlocomotorratingscale)评分。

附图说明

图1为不同酚磺乙胺剂型对大鼠脊髓损伤后不同时间点的BBB评分变化曲线；

图2为不同酚磺乙胺剂型对大鼠脊髓损伤后促炎性免疫因子TNFα、iNOS、IL-12的转录水平的影响；

图3为不同酚磺乙胺剂型对大鼠脊髓损伤后抑炎性免疫因子Arginase1、Ym1、IL-4、IL-10的转录水平的影响；

图4为不同酚磺乙胺剂型对大鼠脊髓损伤后损伤旁区神经元存活的影响；

图5为不同酚磺乙胺剂型对大鼠脊髓损伤后损伤区周围及中心残存神经纤维数量的影响。

具体实施方式

本发明提供了酚磺乙胺在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。

在本发明中，所述治疗脊髓损伤优选为对脊髓神经止血。

在本发明中，所述治疗脊髓损伤出血药物优选为治疗脊髓损伤早期出血药物。

在本发明中，治疗脊髓损伤早期出血药物的用药时间优选为24小时之内，进一步优选为10小时之内。

在本发明中，所述脊髓神经止血药物或所述治疗脊髓损伤药物中酚磺乙胺的有效用量优选为0.1g/kg。

在本发明中，所述有效用量为酚磺乙胺的质量与患者体重的之间的比例关系。

在本发明中，所述酚磺乙胺优选为酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述酚磺乙胺纳米制剂的粒径优选为60～100nm。

在本发明中，所述酚磺乙胺纳米制剂优选包括酚磺乙胺和药物载体。

在本发明中，所述药物载体优选包括聚酯、壳聚糖、明胶、光聚合水凝胶、脂质体、淀粉和海藻酸钠中的一种或多种。

在本发明中，所述聚酯优选包括聚己内酯(PCL)、乙交酯-L-丙交酯-己内酯三元无规共聚物(PGLC)、聚-DL乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)、聚L-丙交酯(PLLA)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)中的一种或多种。

所述光聚合水凝胶优选包括甲基丙烯酰化壳聚糖、甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化丝素蛋白、甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化海藻酸和甲基丙烯酰化葡聚糖中的一种或多种。

在本发明中，所述脂质体由磷脂、胆固醇和α-生育酚制备得到。

在本发明中，所述淀粉优选为可溶性淀粉。

在本发明中，所述酚磺乙胺纳米制剂的制备方法优选根据所述药物载体的种类进行选择。

在本发明中，所述药物载体为聚酯时，所述酚磺乙胺纳米制剂的制备方法优选包括过滤法、均质乳化法、超声乳化法、膜乳化法或喷雾干燥法。

在本发明中，所述药物载体为壳聚糖和/或明胶时，所述酚磺乙胺纳米制剂的制备方法优选包括超声乳化法或交联法。

在本发明中，所述药物载体为光聚合水凝胶时，所述述酚磺乙胺纳米制剂的制备方法优选包括光固化法或微流控法

在本发明中，所述药物载体为脂质体时，所述酚磺乙胺纳米制剂的制备方法优选包括薄膜分散法。

在本发明中，所述要去载体为淀粉时，所述酚磺乙胺纳米制剂的制备方法优选包括反相微乳法。

在本发明中，所述药物载体为海藻酸钠时，所述酚磺乙胺纳米制剂的制备方法优选包括微流控法或乳化离子交联法。

在本发明中，所述过滤法优选包括以下步骤:

将所述聚酯溶解于有机溶剂中，得到聚酯溶液；

将所述聚酯溶液、所述酚磺乙胺、表面活性剂和水混合，得到分散液；

将所述分散液去除有机溶剂，得到水悬浮液；

将所述水悬浮液膜过滤后离心，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述有机溶剂包括四氢呋喃和乙醇。所述四氢呋喃和乙醇的体积比优选为3:2。所述混合的温度优选为25～40℃。所述表面活性剂优选为吐温，所述表面活性剂和水的体积比优选为1:6。所述去除有机溶剂的方法优选为旋转蒸发，所述旋转蒸发的温度优选为室温。所述膜过滤使用的滤膜的孔径优选为0.45μm。所述离心的时间优选为15min。所述离心得到固相产物，本发明优选对所述固相产物进行后处理，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：将所述固相产物依次进行水洗和干燥。在本发明中，所述水洗的次数优选为2次，所述水洗优选为蒸馏水洗。所述干燥优选为冻干。

在本发明中，所述均质乳化法优选包括以下步骤：

将所述聚酯和有机溶剂混合，得到油相；

将聚乙烯醇(PVA)、酚磺乙胺和水混合，得到水相；

在冰水浴条件下，将所述油相和所述水相均质乳化，得到油/水乳液；

将所述油/水乳液去除有机溶剂后，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。所述均质乳化优选在均质乳化机中进行。所述去除有机溶剂的温度优选为室温。所述去除有机溶剂得到固相产物，本发明优选对所述固相产物进行后处理，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：将所述固相产物依次进行水洗和干燥。在本发明中，所述水洗的次数优选为2次，所述水洗优选为离子水洗，两次水洗之间优选采用离心分离。所述干燥优选为冻干。

在本发明中，所述超声乳化法优选包括以下步骤：

将所述聚酯和有机溶剂混合，得到油相；

将聚乙烯醇(PVA)、酚磺乙胺和水混合，得到水相；

在冰水浴条件下，将所述油相和所述水相超声乳化，得到油/水乳液；

将所述油/水乳液去除有机溶剂后，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。所述去除有机溶剂的方法优选为溶剂挥发法。所述去除有机溶剂得到固相产物，本发明优选对所述固相产物进行后处理，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：将所述固相产物依次进行水洗和干燥。在本发明中，所述水洗的次数优选为2次，所述水洗优选为离子水洗，两次水洗之间优选采用离心分离。所述干燥优选为冻干。

在本发明中，所述膜乳化法优选包括方法一或方法二。

在本发明中，所述方法一优选包括以下步骤：

将所述聚酯和有机溶剂混合，得到油相；

将酚磺乙胺和水混合，得到内水相；

在冰水浴条件下，将所述油相和所述内水相超声乳化，得到油包水初乳液；

将所述油包水初乳液加入聚乙烯醇水溶液中混合，得到预复乳液；

在氮气压力条件下，将所述预复乳液进行膜乳化，得到复乳液；

将所述复乳液去除有机溶剂后固液分离，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。所述超声乳化优选在超声波细胞破碎仪中进行。所述油包水初乳液加入聚乙烯醇水溶液中的混合优选在机械搅拌的条件下进行，所述机械搅拌的时间优选为2～5min。所述膜乳化优选为：将所述预复乳液倒入快速膜乳化装置的储存罐中，以氮气压力将预乳液反复压过孔径为0.5～1.2μm的SPG膜，直至得到粒径均一的乳液。所述去除有机溶剂的温度优选为室温。所述去除有机溶剂得到固相产物，本发明优选对所述固相产物进行后处理，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：将所述固相产物依次进行水洗和干燥。在本发明中，所述水洗优选为蒸馏水洗，两次水洗之间优选采用离心分离。所述干燥优选为液氮冷冻干燥。

在本发明中，所述方法二优选包括以下步骤：

将壳聚糖和/或明胶、醋酸的水溶液和酚磺乙胺混合，得到水相；

将所述石蜡、石油醚和乳化剂混合，得到油相；

将所述水相和油相混合，得到预乳液；

在氮气压力条件下，将所述预乳液进行膜乳化，得到水油乳液；

将所述水油乳液和所述交联剂有机溶溶液混合交联，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述醋酸的水溶液的质量百分含量优选为1％。所述膜乳化优选为：将所述预乳液倒入快速膜乳化装置的储存罐中，以氮气压力将预乳液反复压过孔径为0.5～1.2μm的SPG膜，直至得到粒径均一的乳液。所述交联剂优选为戊二醛饱和的甲苯溶液。在本发明中，所述混合交联后得到交联反应液，本发明优选对所述交联反应液进行后处理，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：将所述交联反应液进行离心，得到固相产物；将所述固相产物依次进行洗涤和干燥。在本发明中，所述洗涤优选依次进行石油醚洗涤、丙酮洗涤和乙醇洗涤。所述干燥优选为冷冻干燥。

在本发明中，所述喷雾干燥法优选包括以下步骤：

将所述聚酯、酚磺乙胺、有机溶剂混合，得到混悬液；

将所述混悬液进行喷雾干燥，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。所述超喷雾干燥优选在纳米喷雾干燥仪中进行。所述超喷雾干燥的进口温度优选为60℃，所述超喷雾干燥的喷头帽孔径优选为0.5-1.5μm。本发明优选将酚磺乙胺纳米制剂冷冻保存。

在本发明中，所述交联法优选包括以下步骤：

将壳聚糖和/或明胶、酚磺乙胺和水混合，得到混合溶液；

将石蜡和乳化剂混合，得到乳化溶液；

将所述乳化溶液注入所述混合溶液中，得到乳液；

将所述乳液和交联剂混合固化后，加入有机溶剂得到纳米粒分散液；

将所述纳米粒分散液离心，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述交联法采用壳聚糖原料时，所述混合的原料优选还包括醋酸。所述壳聚糖和/或明胶、酚磺乙胺和水混合的温度优选为70℃。所述乳化剂优选为Span80。所述石蜡和乳化剂混合的温度优选为55℃。所述石蜡和乳化剂混合优选在机械搅拌的条件下进行。本发明优选采用注射器将所述乳化溶液注入所述混合溶液中。所述注入后，本发明优选继续搅拌15min得到乳液。在本发明中，所述交联剂优选为戊二醛水溶液。所述戊二醛水溶液的质量百分含量优选为12.5％。所述交联剂优选分两批加入。所述有机溶剂优选为丙酮。所述离心的时间优选为15min。所述离心得到固相产物，本发明优选对所述固相产物进行后处理，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：将所述固相产物依次进行洗涤和干燥。在本发明中，所述洗涤优选为采用丙酮和异丙醇依次进行润洗。所述干燥优选为冷冻干燥。

在本发明中，所述光固化法优选包括以下步骤：

将光聚合水凝胶、酚磺乙胺、酰基次膦酸锂盐和水第一混合，得到预混合溶液；

将食用油和石蜡油第二混合，得到混合油；

将所述预混合溶液和所述混合油第三混合，得到混合溶液；

在紫外光照射条件下，将所述混合溶液进行固化，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述第一混合的温度优选为40℃，所述第一混合优选在水浴条件下进行。所述第二混合的温度优选为60℃，所述第二混合优选早搅拌的条件下进行。所述第三混合优选为将所述预混合溶液滴加至所述混合油中。所述固化优选在搅拌的条件下进行，所述固化的时间优选为5min。在本发明中，所述固化得到固化产物，本发明优选对所述固化产物进行后处理，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：将所述固化产物静置后依次进行洗涤和干燥。在本发明中，所述洗涤优选为采用预冷的二氧六环、丙酮和乙醇依次进行冲洗。所述干燥优选为烘干，所述干燥的温度优选为60℃。

在本发明中，所述微流控法优选包括方法三或方法四。

在本发明中，所述方法三优选包括以下步骤：

将光聚合水凝胶、酚磺乙胺、缓冲溶液和光引发剂混合，得到内相溶液；

将矿物油和表面活性剂混合，得到连续相溶液；

将内向溶液和连续相溶液注射入微流控装置的两个入口混合得到剪切微滴；

在紫外光照射条件下，将所述剪切微滴进行光交联固化，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述内相溶液中，所述光引发剂的质量百分含量优选为0.5％。所述表面活性剂优选为Span80。所述矿物油和所述表面活性剂的质量比优选为1:0.05。在本发明中，所述光交联固化得到固体凝胶纳米粒，本发明优选对所述固体凝胶纳米粒进行后处理，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：将所述固体凝胶纳米粒依次进行洗涤和干燥。在本发明中，所述洗涤优选为采用丙酮和质量百分含量为75％的乙醇水溶液依次进行洗涤。所述干燥优选为冻干。

在本发明中，所述方法四优选包括以下步骤：

将酚磺乙胺、缓冲溶液和海藻酸钠混合，得到内相溶液；

将离子交联剂和水混合，得到外水相；

将内向溶液、连续相和外水相注射入微流控装置的三个入口混合剪切交联得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述缓冲溶液优选为PBS溶液。所述连续相优选为矿物油。所述离子交联剂优选为CaCl

在本发明中，所述薄膜分散法的制备方法优选包括以下步骤：

将的磷脂、胆固醇、α-生育酚和第一有机溶剂第一混合，得到类脂溶液；

将所述类脂溶液、酚磺乙胺和第二有机溶剂第二混合，得到混合溶液；

将所述混合溶液去除有机溶剂，得到类脂薄膜；

将溶解有冻干保护剂的水化介质水化所述类脂薄膜，得到粗悬液；

将所述粗悬液超声处理，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，第一有机溶剂优选为氯仿。所述第二有机溶剂优选为甲醇。所述第二混合的温度优选为40℃，所述第二混合优选在水浴条件下进行。所述去除有机溶剂的方法优选为减压蒸馏。所述超声处理的时间优选为2～10min。本发明优选将所述酚磺乙胺纳米制剂于4℃冰箱中保存。

在本发明中，所述反相微乳法优选包括以下步骤：

将淀粉、NaOH、酚磺乙胺和水第一混合，得到水相溶液；

将所述大豆油和表面活性剂第二混合，得到油相溶液；

将所述水相溶液和所述油相溶液第三混合，得到分散乳液；

将所述分散乳液和环氧氯丙烷混合，离心分离，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述第一混合优选在搅拌的条件下进行，所述第一混合后，本发明优选将所述水相溶液在常温条件下活化30min。所述第二混合的温度优选为60℃。所述第散混合的温度优选为40℃，所述第三混合优选为：将所述水相溶液缓慢加入所述油相溶液中。在本发明中，所述离心分离得到固相产物，本发明优选对所述固相产物进行后处理，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：将所述固相产物依次进行洗涤和干燥。在本发明中，所述洗涤优选为采用乙酸乙酯洗涤、乙醇和丙酮反复洗涤。所述干燥优选在干燥箱中进行。所述酚磺乙胺纳米制剂优选冷冻保存。

在本发明中，所述乳化离子交联法的制备方法优选包括以下步骤：

将酚磺乙胺溶液和海藻酸钠溶液混合，得到水相；

将所述玉米油和表面活性剂混合，得到油相；

将所述水相滴加至所述油相中，得到水/油乳液；

将所述水/油乳液和离子交联剂混合进行交联固化，得到所述酚磺乙胺纳米制剂。

在本发明中，所述酚磺乙胺溶液优选为酚磺乙胺PBS溶液。所述海藻酸钠溶液的质量百分含量优选为1.5％。所述酚磺乙胺溶液和所述海藻酸钠溶液的体积比优选为3:10。所述表面活性剂优选包括司盘-85和吐温-85；所述玉米油、司盘-85和吐温-85的体积比优选为100:5:1。所述滴加优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速优选为≥4000r/min，所述搅拌的时间优选为5min。所述离子交联剂优选为CaCl

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将0.5g的聚酯(PCL)溶解在10mL四氢呋喃中，并加入乙醇，四氢呋喃与乙醇的体积比为3/2，得到聚合物溶液；然后将0.1g的酚磺乙胺添加到聚合物溶液中以获得均匀混合溶液。在40℃温和搅拌条件下，将混合溶液滴加到10mL吐温和60mL水溶液中，以形成分散体系。在室温下通过旋转蒸发将四氢呋喃和乙醇从分散体中彻底除去后，将所得的水悬浮液用0.45μm的滤膜过滤以除去沉淀。以8000rpm离心15分钟收集负载有酚磺乙胺的聚酯纳米颗粒，并用蒸馏水洗涤2次。冻干后，获得干燥的聚酯负载酚磺乙胺纳米颗粒。

实施例2

将0.5g聚酯(PCL)溶于10mL二氯甲烷作为油相，将10mL，质量百分含量为0.1％PVA、质量百分含量为0.1％酚磺乙胺的水溶液作为水相，冰浴条件下采用高速均质乳化机(转速为4000r/min)将油相分散于水相中制备油/水乳液，将其在常温下磁力搅拌挥发去除有机溶剂固化成纳米粒，用去离子水离心洗涤数次，冷冻干燥制成成品。

实施例3

将聚酯(PCL)溶于二氯甲烷作为油相(油相中PCL的质量百分含量1％)，将PVA、酚磺乙胺水溶液作为水相(水相中酚磺乙胺的质量百分含量0.1％，PVA的质量百分含量0.1％)，冰浴条件下用超声乳化将10mL油相分散于10mL水相中制备油/水乳液，用溶剂挥发法去除乳滴中的有机溶剂使其固化成微球，用去离子水以8000rpm离心洗涤数次，冷冻干燥制成成品。

实施例4

取10mL酚磺乙胺水溶液作(0.1％)为内水相，将聚酯(PCL)溶解溶于10mL的二氯甲烷中作为油相(PCL的质量百分含量1％)。将内水相加入到10mL油相中，用超声波细胞破碎仪进行超声乳化得到油包水初乳液。然后，将初乳液倒入聚乙烯醇水溶液(质量百分含量0.1％)中，在机械搅拌下以3000r/min搅拌5min预复乳化。随后，将预复乳液倒入快速膜乳化装置的储存罐中，以氮气将预乳液反复压过孔径为1.2μm的SPG膜，直至得到粒径均一的乳液。最后，将复乳液在室温下搅拌过夜，使溶剂完全挥发。将固化后的纳米粒通过以8000rpm离心收集，用蒸馏水洗涤数次，液氮冷冻后，采用冻干机冷冻干燥得到粒径均一的载药纳米粒。

实施例5

称取聚酯(PCL)溶解于二氯甲烷中(PCL的质量百分含量1％)，将0.1g的酚磺乙胺粉末，超声分散于10mL溶有PCL的二氯甲烷溶液中，将制备的混悬液采用纳米喷雾干燥仪进行喷雾干燥。进口温度设定为60℃，喷头帽孔径为0.5μm。收集干燥后的载药纳米粒冷冻保存。

实施例6

将1g壳聚糖于70℃溶于10mL醋酸-酚磺乙胺溶液中(醋酸的质量百分含量为1％，酚磺乙胺的质量百分含量为0.3％)中，壳聚糖充分溶解后，室温下搅拌使溶液混合均匀。其后在10mL液体石蜡中加入乳化剂Span80(Span80的质量百分含量为1％)；恒温55℃条件下以4000r/min的搅拌速度高速机械搅拌，用注射器缓慢加入壳聚糖混合溶液，继续搅拌15min形成稳定的乳液。在室温下继续搅拌30min后分两次加入5mL交联剂(12.5％戊二醛水溶液，每次加入2.5mL)使其固化。调整搅拌速度为3000r/min，再加入丙酮，使纳米粒脱水。以8000rpm离心15min得到纳米粒。用丙酮、异丙醇分别润洗，冷冻干燥得到壳聚糖/明胶载药纳米粒。

实施例7

将1g壳聚糖溶于10mL含有质量分数为1％的醋酸水溶液中，再加入0.1g的酚磺乙胺，配制成混合溶液，待完全溶解后,将其过滤除去不溶物，然后取8mL过滤后的溶液作为水相，将液体石蜡和石油醚按照体积比1:1混合后加入Span80混合均匀作为油相(Span80的质量百分含量为1％)；把水相和油相按体积比1:1经超声混合制备成预乳液，以氮气将预乳液反复压过孔径为0.5μm的SPG膜，得到粒径均一的水油乳液。缓慢滴加5mL戊二醛饱和的甲苯溶液，保持40℃在高速搅拌(4000r/min)下交联，然后以8000rpm离心，弃去上清液，分别用石油醚、丙酮、乙醇洗涤后冻干可得到粒径均一的壳聚糖载药纳米粒。

实施例8

取甲基丙烯酰化壳聚糖，将其溶于10mL含有0.1％酚磺乙胺和0.5％酰基次膦酸锂盐的蒸馏水中。水浴40℃直至溶解，制成甲基丙烯酰化壳聚糖的质量浓度为15％的混合溶液。取10mL食用大豆油和石蜡油(体积比1:1)混合油，然后将该混合溶液放置于搅拌器中，恒温60℃高速搅拌(4000r/min)。将制备好的溶液缓慢滴加于搅拌状态的混合油中，同时将紫外固化灯至于烧杯下面，边紫外固化边高速搅拌5分钟，停止搅拌，将该混合物放置五分钟。随后用预冷(5℃)的二氧六环、丙酮和乙醇分别冲洗纳米粒，充分除去纳米粒表面残留油分，60℃烘箱过夜烘干纳米粒。

实施例9

将注射器连接至微流控装置，使用微注入泵的推进装置将流体注入两个入口。使用矿物油作为连续相，使用5％(w/w)Span80作为表面活性剂。将含0.1％酚磺乙胺与1％甲基丙烯酰化壳聚糖的PBS溶液与0.5％的光引发剂溶液以体积比1:1混合作为内相。启动注射泵，并将内相(流速为0.5mL/min)和连续相液体(流速为1mL/min)注入设备中。由于连续相液体的剪切应力，GelMA形成了微滴，并从出口转移到交联盘上。水凝胶液滴通过在紫外线照射下进行光交联而形成固体凝胶纳米粒。用丙酮和75％的酒精洗涤水凝胶，以除去表面活性剂和矿物油，冻干保存。

实施例10

采用薄膜分散法制备脂质体。取1g磷脂与1g胆固醇，溶解于10mL含α-生育酚(1wt％)的氯仿溶液中，得类脂溶液。再将0.1g酚磺乙胺，加入10mL甲醇中，得到酚磺乙胺溶液，转移至40℃恒温水浴中将酚磺乙胺溶液和类脂溶液混合，用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，以10mL溶解有冻干保护剂的水化介质(40℃)水化类脂薄膜，形成粗悬液，旋涡轻2h，超声10min，于4℃冰箱中保存。

实施例11

将5g可溶性淀粉加入到相应量的2mol/LNaOH和酚磺乙胺溶液中(酚磺乙胺的质量百分含量为1％)，充分搅拌，在常温下活化30min。在容器中加入10mL大豆油，然后加入10mLSpan60，加热至60℃使Span60完全溶解，冷却至40℃，高速搅拌下(4000r/min)将配制好的淀粉溶液缓慢加入。液珠完全分散均匀后，加入5mL环氧氯丙烷，反应约6h后，以8000rpm离心分离，分去油相，用乙酸乙酯洗净，再用乙醇和丙酮反复洗涤，于干燥箱中进行干燥，得到载药淀粉纳米粒，冷冻保存。

实施例12

取酚磺乙胺的PBS溶液(酚磺乙胺的质量百分含量为0.1wt％)，加入1.5％海藻酸钠溶液(体积比3:10)，混合均匀，作为水相；将玉米油、司盘-85、吐温-85，按体积比100:5:1混合均匀，作为油相。在高速搅拌(4000r/min)下，用注射器将水相缓慢滴加至油相中，搅拌5min，形成水/油乳液；然后加入离子交联剂溶液(离子交联剂溶液为5％CaCl

实施例13

将注射器连接至微流控装置，使用微注入泵的推进装置将流体注入三个入口。使用矿物油作为连续相，将含酚磺乙胺(酚磺乙胺质量百分含量为0.1wt％)与海藻酸钠(海藻酸钠质量百分含量为1.5wt％)的PBS溶液作为内相，将5％CaCl

测试例

对实施例1制备的酚磺乙胺纳米制剂、市售的酚磺乙胺普通制剂进行动物模型实验。大鼠脊髓损伤模型在实验室采用脊髓挫伤立体定位装置制备。

(1)首先观察了实施例1制备的酚磺乙胺纳米制剂治疗脊髓损伤的终点效果，分别在损伤后1、3、7、10、14、21天进行行为学测试；即实施例1制备的酚磺乙胺纳米制剂是否可以改善大鼠脊髓损伤后运动功能恢复。测试结果如图1所示，结果发现：与空白对照组及普通制剂止血药物组相比，纳米制剂止血药物可显著促进大鼠脊髓损伤后BBB(Basso,Beattie&Bresnahanlocomotorratingscale)评分。

(2)本测试例进一步探讨实施例1制备的酚磺乙胺纳米制剂促进运动功能恢复的机制，收集损伤脊髓组织，采用实时定量PCR测定，由于除药物本身止血效能外，实施例1制备的酚磺乙胺纳米制剂本身相对于人体是外来物质，因此其进入损伤脊髓后很可能先被固有免疫细胞(小胶质/巨噬细胞)吞噬，因此本测试例观察了其对损伤局部免疫活化的影响，结果如图2所示，结果发现：与对照组及普通制剂止血药物组相比，纳米制剂止血药物可显著降低大鼠脊髓损伤后促炎性免疫因子TNFα、iNOS、IL-12的转录水平；

如图3所示结果：与对照组及普通制剂止血药物组相比，纳米制剂止血药物可显著升高大鼠脊髓损伤后抑炎性免疫因子Arginase1、Ym1、IL-4、IL-10的转录水平。

(4)本测试例检测了对实施例1制备的酚磺乙胺纳米制剂、市售的酚磺乙胺普通制剂对脊髓大鼠脊髓损伤后损伤旁区神经元存活以及与运动功能恢复直接相关的另一个指标---神经纤维的数量的影响。测试结果如图4和图5所示结果：与普通制剂止血药物组相比，纳米制剂止血药物可增加大鼠脊髓损伤后损伤区周围及中心残存神经纤维数量；与普通制剂止血药物组相比，纳米制剂止血药物可增加大鼠脊髓损伤后损伤旁区神经元存活。

实施例的结果表明，本发明提供的酚磺乙胺纳米制剂除药物本身止血作用减轻继发损伤外，纳米制剂到达损伤组织局部后可改善损伤局部免疫微环境，为损伤区周围神经元存活提供良好的生存环境，从而促进损伤区周围神经元存活、增加神经纤维数量，进而促进脊髓损伤后运动功能恢复。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。