一种以CD63为靶点促进细胞分泌外泌体的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种以CD63为靶点促进细胞分泌外泌体的方法及应用。

背景技术

细胞外囊泡(EVs)是由细胞在正常生理条件或在刺激后分泌的脂质双层封闭膜结构，包含不同大小和亚细胞膜来源的囊泡，外泌体是指大小范围为40-200nm的细胞外囊泡子集。外泌体作为细胞通讯的信号体，可以通过与受体细胞膜相互作用，或通过被细胞摄取后释放内容物来介导信号转导。这一特征使外泌体成为发展潜力巨大的基因和蛋白药物载体。然而单位体积的细胞条件性培养基中外泌体的量较低，产业化量产的材料耗费与时间成本高，因此目前亟需有效提高外泌体获得率的方法。提高外泌体量产的一种方法是开发大规模细胞培养平台，而另一种方法则专注通过细胞刺激增加每个细胞的颗粒产量，例如通过缺氧、超声刺激等施加适度的细胞生长压力或利用化合物干扰溶酶体小囊运输和诱导晚期内体隔室的空泡化增加外泌体分泌。然而既能刺激外泌体产生又不影响细胞活性和生长的培养条件或化合物较为缺乏，因此研发提高外泌体的产量对于外泌体的转化意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种以CD63为靶点促进细胞分泌外泌体的方法及应用。

第一方面，本发明要求保护一种提高外泌体产量的方法(或者一种制备外泌体的方法)。

本发明所要求保护的提高外泌体产量的方法(或者制备外泌体的方法)是一种在常规细胞培养条件下提高细胞培养基上清中外泌体产量的方法，可包括如下步骤：以CD63为靶点对用于分泌外泌体的供体细胞进行改造。

其中，所述改造为提高所述供体细胞中CD63的表达量。

进一步地，提高所述供体细胞中CD63的表达量可通过向所述供体细胞中导入能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质来实现。

更进一步地，所述方法可包括如下步骤：

(A1)向所述供体细胞中导入能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质，得到重组细胞；

(A2)用无血清培养基培养所述重组细胞，收集培养上清；

(A3)将所述培养上清与聚乙二醇6000溶液混悬离心，所得沉淀物中即含有外泌体。

在步骤(A1)中，所述“能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质”可为如下任一：

(B1)用于表达CD63的重组载体；

(B2)用于表达CD63的mRNA或所述mRNA的化学修饰物；

(B3)含有(B1)所述重组载体或(B2)所述mRNA或所述mRNA的化学修饰物的脂质颗粒；

(B4)含有(B1)所述重组载体或(B2)所述mRNA或所述mRNA的化学修饰物的重组微生物。

在步骤(A1)中，在向所述供体细胞中导入所述“能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质”后，还可包括利用抗生素或荧光蛋白标签对细胞进行筛选从而获得重组细胞的步骤。

在本发明的具体实施方式中，是采用荧光蛋白标签对细胞进行筛选的，具体采用的是绿色荧光蛋白标签(eGFP)。

在步骤(A2)中，用所述无血清培养基培养所述重组细胞获得所述培养上清是按照包括如下步骤的方法进行的：用所述无血清培养基培养所述重组细胞，在培养的第3、5、7天收集细胞(如HEK293T)条件培养基上清，在第3天和第5天收集条件培养基上清后，加入新鲜的无血清培养基继续培养。收集一周的培养基上清后进行外泌体的富集纯化。

在步骤(A3)中，在将所述培养上清与聚乙二醇6000溶液混悬离心前还可包括用差速离心法去除所述培养上清中的细胞和细胞碎片的步骤。进一步地，去除所述培养上清中细胞的离心条件可为300-500g(如300g)离心5min；去除所述培养上清中细胞碎片的离心条件可为3900-4000g(如3900g)4℃离心20min。

在步骤(A3)中，所述聚乙二醇6000溶液中聚乙二醇6000的浓度可为300g/L。

在步骤(A3)中，所述培养上清与所述聚乙二醇6000溶液的体积配比为2:1。4℃混合过夜。

在步骤(A3)中，所述离心的条件可为3900-4000g(如3900g)4℃离心30min。

在步骤(A3)之后还可包括将所述沉淀物用生理盐水重悬后用超速离心(150000-170000g，如150000g 4℃离心2h)对外泌体进行进一步纯化的步骤。然后可以将获得的外泌体重新悬浮在生理盐水(0.9％NaCl溶液)或无菌PBS溶液中，短期(1-2天)储存于4℃，长期(>2天)分装放入-80℃冰箱保存。

在所述方法中，所述供体细胞可为人源细胞或其他哺乳动物细胞。进一步地，所述供体细胞可为HEK293细胞、HEK293T细胞、CHO细胞、间充质干细胞或脂肪细胞等。在本发明的具体实施方式中，所述供体细胞为HEK293T细胞。

在所述方法中，所述重组载体可为重组慢病毒表达载体、重组真核表达载体。所述重组微生物可为重组慢病毒、重组腺相关病毒。在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为用于重组慢病毒包装的包括包装质粒、包膜质粒、目的基因质粒三种质粒载体，其中所述目的基因质粒的主要元件结构如下：PGMLV-CMV-CD63-eGFP-3xFlag-PGK-Puro,其载体全序列如SEQ ID No.4所示。

在所述方法中，所述mRNA的化学修饰物是对所述mRNA进行化学修饰得到的物质；所述化学修饰可以包括选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合。

在本发明中，所述CD63的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述CD63基因的核苷酸序列可为人CD63 mRNA逆转录的cDNA(如SEQ ID No.3)，也可为密码子优化的表达CD63相同氨基酸序列的核酸序列(如SEQ ID No.2)。

第二方面，本发明要求保护用于制备外泌体的成套产品。

本发明要求保护的用于制备外泌体的成套产品包括前文第一方面中所述的“能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质”、所述供体细胞、所述无血清培养基、聚乙二醇6000。

进一步地，所述成套产品中还可包括生理盐水或PBS溶液，离心机等。

第三方面，本发明要求保护如下任一应用：

(C1)前文第一方面中所述的“能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质”或前文第二方面所述的成套产品在制备外泌体中的应用；

(C2)前文第一方面中所述的“能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质”或前文第二方面所述的成套产品在提高外泌体产量中的应用。

本发明首次提供一种用于提高培养基上清中外泌体产量的方法，通过改造外泌体供体细胞过表达CD63，可以促进细胞条件性培养基上清(即细胞培养上清液)中外泌体的分泌，进而显著提高外泌体的产量，单位细胞外泌体的产量可提高8倍。实施例结果表明，增加供体细胞CD63的表达不影响细胞的增殖及活性，且对生产出的外泌体在粒径大小、ZETA电位等特征上无显著改变,可以作为蛋白和核酸类药物的药物载体介导细胞递送。

附图说明

图1为PGMLV-CMV-CD63-eGFP-3xFlag-PGK-Puro图谱。

图2为表达人CD63-eGFP HEK293T细胞(hCD63 HEK293T)的构建：A为共聚焦荧光显微镜下观察细胞的转染效率(CD63-eGFP-3xFlag)。B为免疫印迹方法检测CD63-eGFP-3xFlag，从左至右依次为HEK293T细胞、转染模版质粒(PGMLV-CMV-eGFP-3xFlag-PGK-Puro质粒)的对照细胞(template HEK293T细胞)、hCD63 HEK293T细胞，抗体为anti-Flag标签抗体。

图3为外泌体制备流程图。

图4为来源于HEK293T、template HEK293T、hCD63 HEK293T三种细胞的外泌体的比较。A为单位细胞的外泌体颗粒数产量的比较。B和C依次为粒径大小和Zeta电位的比较。D、E、F依次为HEK293T细胞、hCD63 HEK293T细胞、template HEK293T对照细胞分泌的外泌体的粒径分布图。

图5为hCD63 HEK293T和HEK293T细胞来源的外泌体的表征。A为细胞裂解物和培养基上清分离的外泌体的蛋白免疫印迹表征。B为外泌体的透射电镜图。

图6为细胞摄取外泌体。

图7为hCD63 HEK293T细胞和HEK293T细胞增殖以及外泌体生产期细胞活性检测。A为MTT实验检测细胞增殖,B为MTT实验检测细胞在无血清培养基培养一周后的活性变化。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、HEK293T细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司产品)用Gibco的DMEM高糖培养基在37℃、95％空气，5％二氧化碳的恒温培养箱中培养，培养箱相对湿度为85-95％。外泌体生产培养基为Sino Biological的无血清培养基SMM 293-TIS。

2、外泌体生产和纯化：利用转染试剂或慢病毒转染使HEK293T细胞过表达CD63后，改用SMM 293-TIS培养基培养，收集一周内HEK293T细胞培养基上清，用差速离心法依次去除培养基中的细胞(300×g，5min)和细胞碎片(3900×g，20min)后，与30％(质量体积百分比，即％表示g/100mL)聚乙二醇6000溶液混悬离心分离外泌体(3900×g，30min)，将沉淀物用生理盐水重悬，用超速离心(150000g，2h)进一步纯化外泌体，将获得的外泌体重新悬浮在生理盐水或无菌PBS溶液中，分装放入-80℃冰箱，进行后续表征和实验。

3、外泌体的体外表征：参照国际囊泡协会的最新指导原则2018MISEV，外泌体的一般表征包括检测外泌体标志物，形态和粒径大小和分布，检测以上标准的方法简介如下：①免疫印迹：外泌体蛋白浓度采用BCA法检测，使用western blot检测外泌体标志物CD63，内质网标志物钙连接蛋白(calnexin)[外泌体中不应该有calnexin,作为阴性对照，确定分离的外泌体没有污染]等确定外泌体的分离质量。②纳米粒子追踪分析(NTA)：使用NanoSightNS300(Malvern Instruments)检测外泌体的颗粒浓度和大小分布；③颗粒跟踪电位分析仪：使用ZetaView(Particle Metrix)检测外泌体的ZETA电位；④透射电子显微镜(TEM)：外泌体样本滴于电镜专用的铜网上，静置吸干多余液体后，滴加乙酸双氧铀染液，蒸馏水清洗后待铜网干燥，使用TalosL120CTEM(Thermo Scientific)观察外泌体形态并拍摄分析。

实施例1、利用慢病毒转染HEK293T细胞过表达人CD63增加外泌体的产量一、慢病毒转染使HEK293T细胞过表达CD63

慢病毒包装：将表达人CD63的DNA片段(SEQ ID No.2，经过了密码子优化)构建入慢病毒载体(PGMLV-CMV-MCS-eGFP-3×Flag-PGK-Puro，上海吉满生物科技公司产品GM-8077)的CMV启动子下游的限制性酶切位点XhoI和EcoRI之间，经测序验证正确后得到的含有目的基因的重组载体PGMLV-CMV-CD63-eGFP-3×Flag-PGK-Puro图谱见图1。其中，重组载体PGMLV-CMV-CD63-eGFP-3×Flag-PGK-Puro的全序列如SEQ ID No.4所示。

将包装质粒pSPAX2(优宝生物VT1444)、包膜质粒pVSV-G(优宝生物VT1470)、上述构建得到的含有目的基因的重组载体PGMLV-CMV-CD63-eGFP-3×Flag-PGK-Puro三种质粒分别进行高纯度无内毒素抽提后，按照5:1:5的质量比共转染HEK293T细胞，转染24h后更换为完全培养基，培养48h后，收集培养上清，再加入新鲜的完全培养基继续培养24h后，继续收集培养上清，合并培养上清，离心(500×g，10min)后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，分装-80℃保存。慢病毒感染HEK293T细胞：按照不同的感染复数(MOI)设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量；6孔板接种10×10

共聚焦显微镜和免疫印迹方法检测细胞转染效率的结果见图2中A和图2中B。hCD63 HEK293T细胞为慢病毒转染PGMLV-CMV-CD63-eGFP-3xFlag-PGK-Puro表达质粒的HEK293T细胞，表达的CD63带有eGFP和Flag标签，分子量约为57kDa，template HEK293T细胞为慢病毒转染PGMLV-CMV-eGFP-3xFlag-PGK-Puro载体质粒的HEK293T细胞，表达eGFP-Flag蛋白，分子量约为30kDa。免疫印迹检测Flag条带，利用ImageJ软件根据骨架蛋白β-actin条带的灰度值进行归一化处理，结果显示hCD63 HEK293T和template HEK293T都已被成功转染且表达的带Flag标签的蛋白条带位置正确，表达量无显著差异(图2中B)。共聚焦显微镜检测eGFP标签(图2中A)，结果显示CD63-eGFP在细胞质内表达。

二、外泌体生产和纯化

用无血清的HEK293T细胞培养基SMM 293-TIS培养基培养细胞，采用流加式流程在培养的第3、5、7天收集HEK293T细胞条件培养基上清，在第3天和第5天收集上清后，加入新鲜的无血清培养基继续培养。收集一周的培养基上清后进行外泌体的富集纯化，流程如图3所示，用差速离心法依次去除培养基中的细胞和细胞碎片后，与30％(质量体积百分比，即％表示g/100mL)聚乙二醇6000溶液混悬离心分离外泌体，将沉淀物用生理盐水重悬，用超速离心进一步纯化外泌体，将获得的外泌体重新悬浮在生理盐水中，分装放入-80℃冰箱，进行后续表征和实验。

三、外泌体的体外表征

参照国际囊泡协会的最新指导原则2018MISEV，外泌体的一般表征包括检测外泌体标志物，形态和粒径大小和分布，检测以上标准的方法简介如下：①免疫印迹：外泌体蛋白浓度采用BCA法检测，使用western blot检测外泌体标志物CD63(CD63抗体，正能生物340219)，内质网标志物钙连接蛋白(calnexin)(calnexin抗体，Affinity BiosciencesAF5362)等确定外泌体的分离质量。②纳米粒子追踪分析(NTA)：使用NanoSightNS300(Malvern Instruments)检测外泌体的颗粒浓度和大小分布，并根据蛋白浓度，计算单位蛋白外泌体的产量；③颗粒跟踪电位分析仪：使用ZetaView(Particle Metrix)检测外泌体的ZETA电位；④透射电子显微镜(TEM)：外泌体样本滴于电镜专用的铜网上，静置吸干多余液体后，滴加乙酸双氧铀染液，蒸馏水清洗后待铜网干燥，使用TalosL120CTEM(ThermoScientific)观察外泌体形态并拍摄分析。

图4中A结果显示HEK293T hCD63细胞产出的外泌体颗粒数同HEK293T细胞和template HEK293T细胞相比显著增加，平均增加倍数为8倍，三种细胞来源的外泌体的平均粒径范围为140-160nm，ZETA电位为-29mv，组间无显著差异(图4中B和C)，图4中D-F依次为来源自HEK293T细胞、HEK293T hCD63细胞和template HEK293T细胞的外泌体的粒径分布。对分离的外泌体进行Western blot鉴定，结果显示外泌体样品中可检测到阳性标志物CD63，无阴性指标Calnexin条带，提示外泌体的分离度较好，胞质蛋白GAPDH和骨架蛋白β-actin在细胞裂解物和外泌体中均可检测到，Flag标签可以在HEK293T hCD63细胞裂解物及分泌的外泌体中检测到(图5中A)。透射电镜结果显示hCD63 HEK293T细胞产出的外泌体具有外泌体典型结构，为茶托型或一侧凹陷的半球形(图5中B)。

四、外泌体的细胞摄取

hCD63 HEK293T细胞分泌的外泌体(简称hCD63外泌体)同HEK293T细胞和templateHEK293T细胞相比带有eGFP信号，可直接用于细胞摄取实验。HEK293T细胞按照2.4×10

五、hCD63 HEK293T增殖和活性检测

MTT法检测细胞增殖：96孔培养板内按照0.5×10

MTT法检测细胞活性：在细胞用无血清培养基培养的第7天也就是最后一次收集培养基上清后，加MTT溶液(MTT浓度0.5mg/mL)，37℃避光培养4h后，小心倒去上清，加入DMSO，震荡10min，沉淀充分溶解后，使用酶标仪Multiskan(Thermo Scientific)检测540nm波长的吸光值，以细胞培养第一天的吸光值做归一化处理，检测细胞活性的变化。

MTT结果显示hCD63 HEK293T细胞的增殖速度在完全培养基下与HEK293T细胞无显著差异(图7中A)，在无血清培养基条件培养一周后，细胞活性的变化与HEK293T细胞无显著差异(图7中B)，结果显示慢病毒转染HEK293T过表达hCD63不影响细胞的增殖和细胞活性。

六、结论

过表达CD63可以显著增加HEK293T细胞培养基上清的外泌体的产量且不影响供体细胞的活性，获得的外泌体具有典型的外泌体形态，同来源于HEK293T细胞在粒径分布、ZETA电位上无显著差异,可以作为蛋白或基因药物的载体。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。