一种酶法制备超低分子量石斛寡聚糖的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种酶法制备超低分子量石斛寡聚糖的方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo，D.officinale)为兰科石斛属的珍稀传统药材，包括1500多种植物，目前被收载于药食同源目录。随着人们生活水平质量的提高，传统中药材的应用需求愈发广泛，其中铁皮石斛化学成分及药理活性是目前石斛研究领域的热点与重点。大量药理活性研究表明，铁皮石斛具有免疫调节、抗肿瘤、抗突变、降血压、降血脂、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗辐射、抗溃疡、抗衰老等功效。除药用外，石斛作为保健食品已有几千年的历史。因此这些活性成分在提高免疫力、抗衰老、抗疲劳等方面进行中成药制剂成品与保健品的开发极具前景。近年来，从具有药理活性的40多种石斛中分离出将近100种活性化合物，包括:石斛多糖、石斛碱、联苄酚、氨基酸、黄酮、萜类、微量元素等。

石斛多糖目前研究较为广泛的活性成分为多糖，其中铁皮石斛多糖(Dendrobiumofficinale polysaccharide，DOP)主要是甘露糖、葡萄糖通过糖苷键形成的葡甘露聚糖，有研究发现，铁皮石斛多糖具有保护胃黏膜、调节血糖、保肝、增强免疫力、降血脂等多种活性。近年来研究发现，低分子量聚多糖具有更强的生物活性，比如低分子量甘露寡糖也能通过刺激肝脏分泌甘露结合蛋白，激活补体系统发挥调理和天然抗感染免疫的功能，对肠道病原微生物有很好的识别、黏附和排除作用。由于天然石斛聚糖分子量高、粘稠度大，使其在医药和食品加工领域的使用受到限制。石斛多糖糖苷键在酸性溶液中易断裂，形成不同聚合度的水解物，因此酸法催化水解是降解植物多糖较为常用的方法。硫酸、三氟乙酸及盐酸催化辅助沸水浴加热或直接利用加热设备高温加热水解铁皮石斛多糖，耗时长，酸的浓度大，加热设备易损坏、成本高。三氟乙酸、盐酸极易挥发、刺激呼吸系统、有毒，操作时难易控制浓度，不适合规模化地水解多糖制备甘露糖。而最近报道的采用霉菌发酵石斛多糖制备低分子量石斛多糖的技术被开发，但其发酵时间长，反应产物复杂难分离，且制备的分子量在10000Da以上，因此难以实现工业化制备需求。因而这些因素导致了医药级和食品级的寡糖生产成本居高不下。

发明内容

本发明为解决制备石斛多糖中小分子活性寡糖制备存在的诸多缺陷问题，采用生物酶法催化降解石斛多糖，由于生物酶法反应条件温和、专一性高、且产品纯度高，易于实现工业化生产制备。

本发明提供了嗜热菌(Thermobifida halotolerans)来源的糖苷酶或表达所述糖苷酶的重组微生物在水解石斛多糖方面的应用。

在一种实施方式中，所述嗜热菌(Thermobifida halotolerans)来源的糖苷酶具有SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，编码所述糖苷酶的基因具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述微生物包括但不限于大肠杆菌。

本发明还提供一种制备超低分子量石斛寡聚糖的方法，所述方法是将所述糖苷酶或含所述糖苷酶的细胞培养物用于石斛多糖的降解。

在一种实施方式中，所述超低分子量石斛寡聚糖的分子量≤1000Da，包括但不限于石斛二糖、石斛三糖、石斛四糖。

在一种实施方式中，所述方法是将所述糖苷酶或含所述糖苷酶的细胞培养物加入至高分子石斛多糖溶液中。

在一种实施方式中，所述高分子石斛多糖溶液中多糖的分子量≥1×10

在一种实施方式中，所述高分子石斛多糖溶液中多糖的分子量为1×10

在一种实施方式中，所述石斛多糖用50mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制成浓度为1-100g/L的溶液。

在一种实施方式中，所述溶液中石斛多糖的浓度为10g/L。

在一种实施方式中，所述糖苷酶的添加量≥1U/g

在一种实施方式中，参与石斛多糖降解的糖苷酶是不含其它盐的纯酶液，酶在反应体系中的浓度为10-10000U/L，具体可以为5000U/L。

在一种实施方式中，所述反应体系溶液的pH值控制在5.0～10.0之间，具体可以为pH7.0。

在一种实施方式中，所述反应体系的温度在10℃-75℃之间，具体可以为60℃。

在一种实施方式中，所述反应体系的反应时间为0.5-16h，具体可以为2h。

本发明还提供所述糖苷酶或所述方法在生产含石斛寡糖的产品中的应用。

在一种实施方式中，所述高分子石斛多糖可被水解为≤1000道尔顿的超低分子量石斛寡糖，包括但不限于石斛二糖、石斛三糖、石斛四糖、石斛五糖，或水解为1000～10000道尔顿的石斛六糖、石斛七糖、石斛八糖及以上寡糖等。

有益效果：

(1)本发明提供了嗜热菌Thermobifida halotolerans来源的糖苷酶在水解石斛多糖方面的应用。

(2)本发明在重组大肠杆菌异源表达嗜热菌Thermobifida halotolerans来源的糖苷酶，并通过优化糖苷酶的编码基因，获得表达活性显著提高的ThDPS表达产物，实现了ThDPS酶的高效活性表达，由于大肠杆菌拥有较强的蛋白表达能力，易于ThDPS酶的大规模发酵制备，以本发明重组表达的嗜热糖苷酶ThDPS可以直接用于石斛多糖的高效水解，实现活性寡糖规模化酶法催化制备。

(3)本发明利用基因工程菌株发酵所制酶直接用于降解石斛多糖制备寡聚糖小分子，反应条件极其简单，对仪器设备无要求，在常温常压下即可实施；酶水解工艺不需添加任何有机试剂，无任何污染废弃物产生；小分子寡糖的转化产率达95％以上，产物在水溶液中比较单一，易于纯化回收。基于应用分析，本发明方法在工业上用于制备单一活性功能寡糖及其衍生体具有非常广泛的价值。

附图说明

图1为DNS法检测多种糖苷水解酶水解石斛多糖活性的结果。

图2为糖苷酶序列优化前后的相对酶活。

图3为ThDPS重组蛋白表达与蛋白纯化电泳图。

图4为不同底物浓度下ThDPS酶催化水解石斛多糖的比酶活。

图5为不同反应温度对ThDPS酶催化水解石斛多糖的影响：相对酶活指相对于最大反应酶活的百分比值。

图6为不同反应pH对ThDPS酶催化水解石斛多糖的影响：相对酶活指相对于最大反应酶活的百分比值。

图7为荧光电泳检测ThDPS酶催化水解的石斛寡糖产物。

具体实施方式

ThDPS糖苷酶的表达宿主与培养基如下：

下述实施例当中涉及的pET21a质粒和大肠杆菌E.coli BL21(DE3)均购自Stratagene,La Jolla,CA,USA。

LB液体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，氨苄浓度为100μg/mL。

LB固体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，氨苄浓度为100μg/mL，琼脂15g/L。

ThDPS糖苷酶活性测定：

酶活定义：在37℃下，每1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量定义为一个单位酶活(U)。

酶活测定：ThDPS糖苷酶可以将石斛多糖分解为甘露寡糖，甘露寡糖具有还原性，可以与DNS试剂在碱性条件下发生一定的化学反应，生成在煮沸条件下呈棕红色的3-amin-5-nitrosalicylic acid，可以用分光光度计测量生成的还原糖量，它的颜色的深浅程度与还原糖含量有关。

酶活测定的具体步骤为：总反应体系2mL，含有浓度为4g/L的石斛多糖溶液1mL，浓度为200mM的磷酸盐缓冲液200μL，10μL酶液，对照组加入10μL蒸馏水，所有反应液总体积补水至2mL。混合反应液在37℃孵育30min。取出后沸水浴1min使酶失活。每管中加入2mL DNS溶液，沸水浴3min，迅速冷却，加1mL蒸馏水定容至5mL。在540nm波长下测量吸光值，确定酶活。

水解产物石斛寡糖凝胶荧光电泳

试剂准备：配制DMSO(乙酸：水：DMSO＝3:17:20)、0.2M ANTS(溶于水：乙酸＝17:3)、1M NaCNBH3(溶于DMSO溶液)；

样品处理：80uL寡糖水解物和80uL蔗糖的水溶液于EP管中，用移液枪向各EP管中准确吸入10uL DMSO、5uL ANTS、5uLNaCNBH

分离胶制作：30％丙烯酰胺5.33mL、1.5M Tirs-Hcl(pH8.8)1mL、蒸馏水1.67mL、10％过硫酸铵30uL、TEMEO 10uL，混匀制胶。

电泳完成后把取出的胶放到紫外灯下观察条带。

实施例1：多种糖苷酶重组大肠杆菌的异源表达与制备

1)、糖苷酶基因重组构建

为筛选能对石斛多糖进行高效水解的糖苷酶，经生物信息学比对筛选了不同物种和不同糖苷酶家族的糖苷水解酶编码基因，再经过系统发育树和保守位点比对分析，挑选了4种代表性的糖苷水解酶进行异源重组表达，制备糖苷水解酶蛋白。

以嗜热菌Thermobifida halotolerans来源的THGH(SEQ ID NO.1所示)、Thermobifida fusca来源的TFGH基因序列(Genbank登录号：AID15578.1)、Klebsiellapneumoniae来源的KPGH(Genbank登录号：CP035202.1(146142-148334))以及Thermobifidaalba来源的TAGH(Genbank登录号：BBA57841.1)为模版，进行PCR扩增编码基因，采用无缝克隆的方式重组pET21a，重组的质粒THGH-pET21a、TFGH-pET21a、KPGH-pET21a、THGH-pET21a和TAGH-pET21a转化大肠杆菌BL21(DE3)，分别获得重组菌THGH-pET21a/BL21(DE3)、TFGH-pET21a/BL21(DE3)、KPGH-pET21a/BL21(DE3)、TAGH-pET21a/BL21(DE3)；取适量转化液涂布在LB培养基平板上，37℃过夜培养，菌落PCR正确后挑取单菌落摇瓶培养、提取质粒。经进一步测序验证正确后，含有重组质粒的菌株即为重组菌并进行下一步表达。

2)、重组菌蛋白的诱导表达与活性检测

将步骤1构建的重组菌接种至试管中，含5mL的LB培养基(含100ug/mL氨苄青霉素)，在37℃、200r/min摇瓶培养16h作为种子液，按1％的接种量转接到的100mL LB液体培养基中(含100ug/mL氨苄青霉素)，置于37℃、200rpm摇瓶培养至OD600为0.6后，添加0.1mM的IPTG进行诱导表达，在37℃、200rpm条件下振荡培养24h。获得的发酵液以8000×g、4℃离心10min，去除上清，收集菌体。用8mL 50mM pH＝7.0的PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎后，4℃、12000×g离心10min，去除沉淀，收集上清液，用于水解石斛多糖反应并采用DNS法进行水解产物检测。结果如图1所示，仅有THGH表达产物对石斛多糖产生了显著的水解活性，并产生了大量还原性寡糖，酶活达68U/OD

实施例2：ThDPS石斛多糖水解酶的优化表达

同时，为了进一步提高THGH蛋白的表达水平以及酶活，以Thermobifidahalotolerans中THGH基因序列为模板，根据大肠杆菌宿主密码子的兼并性对密码子进行优化合成大小为1326bp的ThDPS基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，设计同源重组引物ThDPS-21AF(5`-AAGAAGGAGATATACATATGCGTAAACGCCTGACCGTG-3`)和ThDPS-21AR(5`-CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCGGTGGTGCAGGTCAGGGTC-3`)，保留重组蛋白下游6x His-tag，将制备的基因片段产物与pET21a空质粒(用NdeI、XhoI双酶切)进行无缝克隆，连接产物转化到E.coli BL21(DE3)，并进行测序验证正确后按照实施例1的方法诱导表达。对经过密码子优化后的表达产物进行水解石斛多糖的酶活分析，结果如图2所示，相比没有密码子优化的THGH表达酶活水平(68U/OD菌体)，优化后的序列ThDPS表达酶活水平显著提高了2.75倍，达到187U/OD菌体，这为后续高水平制备石斛多糖水解酶奠定了技术基础。

实施例3：ThDPS石斛多糖水解酶的纯化与酶活表征

收集实施例2制备的酶液，采用镍柱进行蛋白纯化，制成ThDPS酶，放置-20℃冰箱备用。经SDS-PAGE蛋白电泳检测，如图3所示，纯化的蛋白条带大小约为50-52kDa，与理论大小基本一致。

以石斛多糖为底物，对ThDPS的酶学性质进行了表征研究。

分别称取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4和3g石斛多糖(Mw>100000Da)溶于1L蒸馏水中，配制出石斛多糖溶液，随后加入20μL酶液，37℃反应30min。其中酶液为实施例1制得的ThDPS的酶液用去离子水稀释，稀释液浓度至100μg/mL。如图4所示，随着石斛多糖初始浓度从0.2克/升增加到3克/升，ThDPS的催化活性迅速增加。这些结果表明石斛多糖的水解中没有明显的底物抑制，在底物浓度为2.4g/L时，比酶活可达5100U/mg。

2、最适温度测定：配制10g/L的石斛多糖作为反应底物，反应体系中加入0.4mL终浓度2g/L的石斛多糖，加入500mM的Tris-HCl缓冲液200μL，加入20μL酶液(提供10U的催化活力)，对照组加入20μL蒸馏水，所有反应液总体积补水至2mL，混合均匀后分别置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴环境中温育30min。其中酶液为实施例1制得的ThDPS的酶液用去离子水稀释，稀释液浓度至100μg/mL。反应采用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成还原糖量。

结果如图5所示，ThDPS显示出60℃的最佳反应温度，并且在40℃和60℃之间的温度下仍然具有85％以上的活性。表明该酶是高度热稳定的。这种石斛多糖水解酶的热稳定性明显高于其他来源的糖苷酶，这些结果表明，ThDPS可作为一种优良的高温生物催化酶用于大规模水解石斛多糖制备低分子量寡糖。

3、最适pH测定：

配制不同pH的500mM缓冲液：柠檬酸缓冲液(pH 2、3、4、5、6)、磷酸缓冲液(pH6、7、8)、Tris-HCl缓冲液(pH 8、9、10、11)。

配制10g/L的石斛多糖作为反应底物，反应体系中加入0.4mL的石斛多糖样品至终浓度2g/L，用不同的pH缓冲液补充至2mL，每组设置3管，其中2管中加入20μL(50μg/mL)酶液，剩余1管加入20μL蒸馏水，测定不同pH下底物自分解情况，37℃孵育30min。取出后沸水浴1min使酶失活。每管中加入2mL DNS溶液，沸水浴3min，迅速冷却。其中酶液为实施例1制得的ThDPS的酶液用去离子水稀释，稀释液浓度至100μg/mL。

用去离子水调零，在540nm波长下测量吸光值，参考标准曲线，计算酶活力，绘制不同pH值反应条件与酶活性曲线关系图，确定最适pH。最大吸收值对应的反应温度为重组酶的最适温度，相对酶活(RA)定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比。

结果如图6所示，ThDPS在50mM pH 7.0的磷酸盐缓冲液中反应时显示最大活性，在pH6.0至10.0范围内显示超过90％的活性。酸碱度稳定性试验的结果表明，ThDPS也是高度稳定的广泛的酸碱度范围，这有利于其规模化催化水解制备石斛寡聚糖。

实施例4利用ThDPS酶液水解石斛多糖高效制备石斛寡糖产物

为实现最大水解效率，在上述水解反应条件优化的基础上，提高石斛多糖浓度至10g/L(出现黏稠，基本达到最大浓度)进行水解反应。称取0.1g石斛多糖干粉溶于10mL pH7.0的磷酸盐缓冲液中，配制出石斛多糖溶液，随后加入1ml ThDPS的酶液(酶蛋白浓度为100μg/mL)，60℃反应2h。其中酶液为实施例1制得的ThDPS的酶液用去离子水稀释，稀释液浓度至100μg/mL。

样品经衍生化处理后进行凝胶荧光电泳，通过在紫外灯下的观察，结果如图7所示：以未加酶水解的石斛多糖样品液作为对照，加入ThDPS酶液对石斛多糖进行充分反应水解后，通过荧光糖电泳分析表明，石斛多糖对照组在同等条件下不含低分子量寡糖产物；而采用ThDPS酶对石斛多糖水解后，产生了大量的超低分子量石斛二糖、石斛三糖、石斛四糖、石斛五糖，和低分子量石斛六糖、石斛七糖、石斛八糖及以上石斛寡糖产物，即重组表达的嗜热甘露糖苷酶ThDPS对石斛多糖底物实现了高效水解，可以一步直接制备获得超低分子量的石斛寡糖产物。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。