海龟疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是涉及海龟疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

海龟是恐龙时代遗留下来的“活化石”，具有很大的经济、科研、观赏、文化和生态价值。其中，绿海龟(学名：Chelonia mydas)海龟科海龟属的一种龟，目前已被列入《华盛顿公约》附录Ⅰ名录、《世界自然保护联盟》(IUCN)濒危物种以及《中国国家重点保护野生动物名录》一级。近年来，人为的捕捞和生态环境的破坏，绿海龟数量极具减少，因此坚守好绿海龟的保育工作尤为重要。

随着绿海龟人工繁殖技术的成熟，病害问题也阻碍着保育工作的顺利前进。海水中存在着大量的海洋微生物，有细菌、真菌、寄生虫和寄生生物等，因水质的恶劣，个体的免疫力下降，食物的不适应性等均为导致绿海龟疾病的爆发。由于绿海龟是国家一级保护动物，关于其常见病原菌和易感病原菌鲜有报道，对于预防和治疗工作的开展有较大难度。基于绿海龟最终必须要回归海洋，因此我们在增强绿海龟的抗病能力上做研究，针对病原菌开发的疫苗更为有效。

绿海龟主要以海草和藻类等为食，因此在食物链上存在较大的弱势，无论人工养殖阶段还是海洋生活阶段，病菌感染是常有的现象。因误食了塑料袋之类的垃圾导致生病，或是在游动过程中被石头之类尖锐的东西擦伤，也可能是天敌的攻击等受伤。海洋中存在大量的细菌，尤其是以弧菌为主，如何有效抵抗多种致病性弧菌对海龟造成致命的影响，研究其灭活苗的保护作用具有重大意义。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种海龟疫苗及其制备方法和应用。

本发明的第一方面，是提供一种海龟疫苗，所述疫苗海龟对绿海龟具有很好的免疫保护。

一种海龟疫苗，其免疫原由副溶血弧菌H0711的灭活菌株和/或哈维氏弧菌TL0816的灭活菌株制备而成，本发明的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)H0711和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)TL0816，已于2022年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，所述副溶血弧菌H0711的保藏编号为CCTCC No：M 20221681，所述哈维氏弧菌TL0816的保藏编号为CCTCC No：M 20221682。

在其中一些实施例中，所述海龟是绿海龟。

在其中一些实施例中，所述海龟疫苗由副溶血弧菌H0711的灭活菌株和哈维氏弧菌TL0816的灭活菌株制备而成。

在其中一些实施例中，所述副溶血弧菌H0711的灭活菌株和哈维氏弧菌TL0816的灭活菌株的用量比为：1-3：1-3，优选为0.9-1.1：0.9-1.1，进一步优选为1：1。

在其中一些实施例中，还包括疫苗佐剂。

在其中一些优选的实施例中，所述疫苗佐剂为铝盐佐剂。

在其中一些优选的实施例中，所述副溶血弧菌H0711的灭活菌株和/或哈维氏弧菌TL0816的灭活菌株的菌液浓度分别为1×10

本发明的第二方面，是提供上述海龟疫苗的制备方法。

上述海龟疫苗的制备方法，包括以下步骤：

将培养的副溶血弧菌H0711灭活，得H0711灭活菌液；

将培养的哈维氏弧菌TL0816灭活，得TL0816灭活菌液；

将H0711灭活菌液和TL0816灭活菌液混合。

在其中一些实施例中，所述灭活为：在副溶血弧菌H0711菌液和/或哈维氏弧菌TL0816菌液中各定量添加体积浓度为0.18％-0.22％终浓度的福尔马林，放置于28℃-32℃恒温培养箱中，放置22h-26h进行灭活，即为福尔马林灭活菌液。

本发明的第三方面，是提供上述海龟疫苗在制备预防和治疗海龟细菌感染中的药物中的应用，优选地，所述细菌为副溶血弧菌和/或哈维氏弧菌。

本发明在研究中，从基于发病绿海龟中分离得到众多的细菌中，通过中华草龟的人工感染试验，获得对海龟具有较强保护力的菌株副溶血弧菌H0711和哈维氏弧菌TL0816，并进行了生物保藏(保藏编号为CCTCC No：M 20221681和CCTCC No：M 20221682)，可将其制备成灭活疫苗应用到绿海龟身上获得对细菌的免疫力保护，特别是制备成合适的二联苗，对海龟的预防病原菌的感染具有远好于单独一种的免疫能力，相对保护率达到75％，这对于提高绿海龟对特定病原菌的免疫能力有重要意义，可用于预防和治疗海龟细菌感染。而且所述灭活疫苗在制备方法上也经济廉价，便于大规模生产。

附图说明

图1人工感染死亡草龟临床症状，其中，1和2是哈维氏弧菌TL0816菌，3和4是副溶血弧菌H0711。

图2健康与发病草龟的肝脏组织切片HE染色示意图，其中，A是健康龟肝脏组织切片HE(100X)，B是健康龟肝脏组织切片HE(400X)，C是感染H0711发病龟肝脏组织切片HE(100X)，D是感染H0711发病龟肝脏组织切片HE(400X)，E是感染TL0816发病龟肝脏组织切片HE(100X)，F是感染TL0816发病龟肝脏组织切片HE(400X)。

图3健康与发病草龟的肺部组织切片HE染色，其中，A是健康龟肺部组织切片HE(100X)，B是健康龟肺部组织切片HE(400X)，C是感染H0711发病龟肺部组织切片HE(100X)D是感染H0711发病龟肺部组织切片HE(400X)，E是感染TL0816发病龟肺部组织切片HE(100X)，F是感染TL0816发病龟肺部组织切片HE(400X)。

图4健康与发病草龟的肠道组织切片HE染色：A是健康龟肠道组织切片HE(100X)，B是健康龟肠道组织切片HE(400X)，C是感染H0711发病龟肠道组织切片HE(100X)，D感染H0711是发病龟肠道组织切片HE(400X)，E是感染TL0816发病龟肠道组织切片HE(100X)，F是感染TL0816发病龟肠道组织切片HE(400X)。

图5肾脏组织切片HE染色(健康与发病)结果示意图，其中A是健康龟肾脏组织切片HE(100X)B是健康龟肾脏组织切片HE(400X)，C是感染H0711发病龟肾脏组织切片HE(100X)，D是感染H0711发病龟肾脏组织切片HE(400X)，E是感染TL0816发病龟肾脏组织切片HE(100X)，F是感染TL0816发病龟肾脏组织切片HE(400X)。

图6是在TCBS平板上的形态(左图)及革兰氏染色(右图)，其中，A是H0711，B是TL0816。

图7是菌株H0711和TL0816的16SrRNA扩增电泳结果示意图，其中，M为2000bpDNAMarker，-为阴性对照，1和2分别对应菌株H0711和TL0816的扩增条带。

图8是菌株H0711和TL0816的热休克蛋白60基因扩增电泳结果示意图，其中，M为2000bpDNAMarker，-为阴性对照，1和2分别对应菌株H0711和TL0816。

图9是显微镜下直接计数法示意图，其中，A血球计数板，B小格体积(1/400×0.1)mm

图10是抗体效价显著性分析结果示意图。

图11是混合菌攻毒生存曲线结果示意图。

图12是本发明所述H0711菌攻毒生存曲线结果示意图。

图13是本发明所述TL0816菌攻毒生存曲线结果示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

单价疫苗只含有单一的抗原成分的疫苗，往往只能预防一种传染病或一种型别的病原体感染。联合疫苗是指含有二个或多个活的、灭活的生物体或者提纯的抗原，可用于预防多种疾病。其实二者又有利弊，单价苗虽然适用率低，但针对某一种病原体，保护效果要比联合免疫要好，联合疫苗优势在于减少接种次数，同时能预防多个疾病，广发适用性好，但联苗的工序会更加复杂，联苗间是否存在竞争抑制，是否更容易引起接种个体的应激反应，如何组合等因素都需要考虑。

总体来说，在疫苗安全有效的前提下，联合疫苗可减少疫苗注射次数，同时预防更多种类的疾病。接种联合疫苗能提高了疫苗接种率，减少多次免疫给个体带来的应激，同时可减少疫苗运输、存放和接种的成本，降低接种和管理费用，还可减少疫苗生产中必含的防腐剂及佐剂等剂量，减低疫苗的不良反应等，因而有效的联苗更具有优势。

本发明从发病海龟分离鉴定到40株菌株，通过对所述菌株的分离、纯化和鉴定，同样包括人工感染中华草龟LD

本发明的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)H0711和哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)TL0816，已于2022年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号分别为CCTCC No：M 20221681和CCTCC No：M20221682。

在一些实施例中，所获取副溶血弧菌H0711和哈维氏弧菌TL0816强毒株，经灭活制备成二联灭活苗。通过分组试验，获得了混合菌攻毒后保护率最高75％以及抗体效价最高的铝胶佐剂高剂量组。同时该二联苗对于单菌攻毒，保护率均能达到50％以上，在草龟上有良好效果，可以应用在绿海龟。本发明所述毒株的筛选有严格程序，灭活菌苗制备简易，可操作性高，步骤简单，可重复性高，有较好的针对性。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

我们针对广东惠东海龟国家级自然保护区的人工养殖环境和发病个体进行多次的流行病学调查，发现均以细菌性疾病最为常见。在2019-2021年期间，我们从该保护区发病绿海龟的体表和体内陆续共分离到40株菌株，针对40株菌进行毒力筛选，详细情况见表1。

(1)菌株纯化、扩培

分离培养基为血平板和TCBS琼脂为主(两种培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司)，血平板为成品培养基，TCBS琼脂培养基按使用说明称取粉末溶解后，煮沸小于2min，倾倒平板备用。菌株的扩培培养基为LB(胰蛋白胨1g/100mL,酵母粉0.5g/100mL，氯化钠2g/100mL，121℃15min)，固体培养基接种后于30℃恒温培养约20h，液体培养基接种后于30℃恒温振荡培养20h，200rpm。

(2)菌株16SrRNA鉴定

将流行病学调查获得得40株菌进行纯化培养，并进行细菌16SrRNA鉴定，确定细菌种细菌16SrRNA鉴定采用通用引物：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’SEQ IDNO.1)和1492R(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’SEQ ID NO.2)进行基因扩增。反应体系：2×TaqPCRMaster Mix25μL、上下游引物各2μL、DNA模板1μL、ddH

(3)平板菌落计数法(用于攻毒实验活菌计数)

1、编号，将平皿和离心管分别标记浓度。

2、稀释样品，将带攻毒菌样品进行适当稀释。取样，用移液器准确吸取10

3、倒平板，于上述平皿中尽快倒入融化并冷却到45℃左右的培养基15ml，旋转混匀。4、计数，30℃培养24h后取出培养皿进行计数，算出同一稀释度的三个平皿中平均菌落数，再按公式计算每毫升原样品中的活菌数。

5、数据处理，一般选取同一稀释度平均菌落数在30～300个之间的平板。例如一个稀释度，平均菌落数在30～300个之间时，乘以稀释倍数报告。

(3)分离菌株毒力初筛

通过平板菌落计数法，获取扩培后40株菌的原菌液浓度，10000rpm，2min，去上清液，用生理盐水悬浮菌体，调整菌液至10

表2.绿海龟源细菌分离鉴定及毒株人工感染中华草龟初筛死亡率统计

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四、绿海龟源细菌毒力二筛

通过毒力初筛，从40株菌中获得9株毒力较强毒株(死亡率大于50％)。为进一步筛选强毒株，我们针对9株初筛较强毒株再一次攻毒中华草龟并统计死亡情况，获取毒力更高的菌株，淘汰毒力较低菌株。通过纯化扩培获得9株菌菌液，通过平板活菌计数法，确定原菌液浓度，并通过生理盐水把原菌液稀释成5×10

表3.T2019H0711攻毒情况统计表(简称H0711株)

表4.T2020TL0816攻毒情况统计表(简称TL0816株)

表5.T20201117TL1攻毒情况统计表

表6.T20200420GQ4攻毒情况统计表

表7.T20210322H5攻毒情况统计表

表8.T20210515#4HG1攻毒情况统计表

表9.T20210515#24HG攻毒情况统计表

表10.T20210818Q4攻毒情况统计表

表11.T20210818#23攻毒情况统计表

实施例2

经过进一步筛选，本发明选取了副溶血弧菌H0711和哈维氏弧菌TL0816，并进行了强毒株LD50测定(SPSS软件计算)。

半数致死量(lethal dose 50％,LD

以菌株副溶血弧菌H0711为例设置变量，输入数据Analyze---Regression—Probit(概率单位)“攻毒剂量”选入“协变量”栏中；“死亡数”选入“响应频率”栏中；“实验动物总数”选入“观测值汇总”栏中；“转换”栏中，选择“对数底为10，其它保持默认。选项结果回归方程为：Probit＝--4.660+0.758X。不同剂量的实验值和预期值概率表残差遵从正态分布标准化残差＝残差的均值/残差的标准差试验点的标准化残差落在正态分布区间外的概率≤0.05。

在95％置信区间表格中找到概率0.5对应的估算值即为LD

表12.强毒株LD

实施例3

对副溶血弧菌H0711和哈维氏弧菌TL0816感染的中华草龟病理组织切片的分析。

通过毒力初筛的人工感染实验，我们发现感染哈维氏弧菌和副溶血弧菌死亡的中华草龟临床症状与发病死亡绿海龟症状一致：肝脏肿大出血、肠道肿胀充血，肺组织萎陷，肾脏肿大充血。及时切取发病濒死草龟肝、肺、肠道和肾脏组织固定于10％福尔马林，同时我们取样健康草龟作为对照组，均用于制备石蜡切片做病理分析。

人工感染死亡草龟临床症状请见图1。

1、发病死亡草龟组织切片与健康草龟组织切片对比分析(肝、肠、肺、肾)

1.1肝脏组织切片HE染色(健康与发病)，结果请参见图2。

从图2中可以看出，发病龟肝脏组织切片显示肝细胞排列紊乱，肝细胞空泡化，有少量淋巴细胞浸润；有较多铁血黄素沉积。提示肝出血，并伴有炎症。

1.2肺部组织切片HE染色(健康与发病)的结果请见图3。

从图3中可以看出，发病龟肺泡间隔断裂，肺泡萎缩；肺组织可见较大囊腔，可能是急性感染导致肺泡内有异样组织增生。提示肺部结节增生，可能是炎症引起，伴有肺萎缩症状。1.3肠道组织切片HE染色(健康与发病)的结果请见图4。

从图4中可以看出，两者可见肠道绒毛黏膜脱落、黏膜下层损伤；浆膜层变薄，肌层有不同程度损伤。提示肠道黏膜变薄，肿胀或有肠炎。

1.4肾脏组织切片HE染色(健康与发病)的结果请见图5。

从图5中可以看出，健康状态下，肾小球血管袢薄而清晰。内皮细胞和系膜细胞数目正常。周围的肾小管也正常；发病后可见肾小管管腔阻塞，肾小管增大，官腔增大，肾小球内毛细血管增生，提示有明显肾炎。

实施例4弧菌培养

1菌株纯化、扩培及革兰氏染色(培养方法同上)

从保种的H0711和TL0816菌，吸取10uL置于TCBS平板，用无菌接种环划线培养，于30℃恒温倒置培养24h。挑取TCBS上的单菌落到LB培养基中进行扩培。同时挑取单菌落进行革兰氏染色。H0711副溶血弧菌在TCBS平板上菌落呈圆形，边缘整齐、湿润、稍混浊、半透明，绿色菌落，直径2-4mm；革兰氏染色为阴性杆菌。TL0816哈维氏弧菌在TCBS平板上菌落呈圆形，边缘整齐、湿润、半透明，黄色色菌落，直径2-4mm；革兰氏染色为阴性杆菌。

2菌株16SrRNA鉴定

通用引物：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’SEQ ID NO.1)，1492R(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’SEQ ID NO.2)反应体系：2×TaqPCR Master Mix25μL、上下游引物各2μL、DNA模板1μL、ddH2O 20μL；反应程序：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃90s，35个循环；72℃7min。扩增产物经测序确定。

注：图示菌株H0711和TL0816的16SrRNA扩增电泳条带，M为2000bpDNAMarker，-为阴性对照，1和2分别对应菌株H0711和TL0816的扩增条带。

2.1H0711菌株16SrRNA测序结果：

TGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCAGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGC

GGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAA

CGATGGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGC

GTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGAC

GATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGA

CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA

TGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGT

AGTGTAGTTAATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCC

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAA

AGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATT

GCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGG

TGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATA

CTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC

GCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACG

CGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGG

GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACC

TACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGA

CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC

GAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGC

CGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTA

GGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCCAACTTGCGAAAGTGAGC

GAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTC

GGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA

CACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGTAGTTTAACCTTCGGGGGGACGCTTACCAC(SEQ ID NO.3)

2.2TL0816菌株16SrRNA测序结果：

TAAGCGTCCTCCCGAAGGTTAAACTACCTACTTCTTTTGCAGCCCACTCCCATGGTGTGA

CGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATTCTGATCCACGATTACT

AGCGATTCCGACTTCACGGAGTCGAGTTGCAGACTCCGATCCGGACTACGACGCACTTT

TTGGGATTCGCTCACTCTCGCAAGTTGGCCGCCCTCTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGT

GTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTAT

CACCGGCAGTCTCCCTGGAGTTCCCACCCGAAGTGCTGGCAAACAAGGATAAGGGTTG

CGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGC

ACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAA

GAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGG

GCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTA

ACGCGTTAGCTCCGAAAGCCACGGCTCAAGGCCACAACCTCCAAGTAGACATCGTTTAC

GGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCATCTGAGTGTC

AGTATCTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTTCAGATCTCTACGCATTTCA

CCGCTACACCTGAAATTCTACCCCCCTCTACAGTACTCTAGTCTGCCAGTTTCAAATGCTA

TTCCGAGGTTGAGCCCCGGGCTTTCACATCTGACTTAACAAACCACCTGCATGCGCTTTA

CGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAG

TTAGCCGGTGCTTCTTCTGTCGCTAACGTCAAATAATGCAGCTATTAACTACACTACCTTC

CTCACGACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGC

ATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACC

GTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTTGG

TGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCCACCTAGGCATATCCTGACGCGAGAGGCCC

GAAGGTCCCCCTCTTTGACCCGTAGGTATTATGCGGTATTAGCCATCGTTTCCAATGGTTA

TCCCCCACATCAGGGCAATTTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGACGCCGTTATCGTTCCCCGAAGGTTCAGATAACTCGTTTCCGCTCGACTTGC(SEQ ID NO.4)。

3菌株HSP60(热休克蛋白-60)基因扩增

引物：HSP60-F(5’-ACAACAGCAACGGTACTAGC-3’SEQ ID NO.5)，HSP60-R(5’-CAACTTTCACGATGCCAC-3’SEQ ID NO.6)，

反应体系：2×TaqPCR Master Mix25μL、上下游引物各2μL、DNA模板1μL、ddH

3.1H0711菌株HSP60扩增片段测序结果：

CGCAAGCAATCGTAAATGAAGGTCTAAAAGCAGTTGCAGCGGGTATGAACCCAATGGAT

CTTAAGCGCGGTATCGACAAAGCTGTTGCAGCGGCAGTAGAGCAACTAAAAGAGCTTTC

TGTTGAGTGTAACGACACCAAAGCAATCGCACAGGTTGGTACTATCTCTGCGAACTCTG

ACGCAAGCGTAGGTAACATCATTGCTGAAGCAATGGAACGCGTTGGCCGCGACGGTGTT

ATCACTGTTGAAGAAGGTCAGGCTCTACAAGACGAGCTAGACGTAGTAGAAGGTATGCA

GTTCGACCGCGGTTACCTATCTCCTTACTTCATCAACAACCAAGAAGCGGGCAGCGTTG

AGCTAGAAAACCCATTCATCCTTCTAGTTGATAAGAAGATCTCAAACATTCGTGAGCTTC

TACCAACTCTAGAAGCAGTAGCAAAAGCATCTCGTCCACTGCTAATCATCGCAGAAGAC

GTAGAAGGCGAAGCACTAGCGACATTGGTTGTGAACAACATGCGTGTCTGGGAAAA(SEQ ID NO.7)

3.2TL0816菌株HSP60扩增片段测序结果：

AACTTTTCCACGAGCCACGCATGTTGTTCACAACAAGTGTTGCTAGTGCTTCACCTTCTA

CGTCTTCAGCGATGATAAGTAGTGGGCGAGATGCTTTTGCTACTGCTTCTAGTGCTGGAA

GAAGTTCACGGATGTTCGATACTTTCTTATCGATCAGAAGGATGAATGGGTTTTCTAGAT

CAACAGAACCTGCTTCTTGGTTGTTGATGAAGTAAGGAGATAGGTAACCGCGGTCGAAC

TGCATACCTTCAACTACATCTAGCTCATCTTGTAGTGCTTGACCTTCTTCAACAGTGATAA

CACCGTCGCGACCAACTTTTTCCATTGCTTCAGCAATGATGTTACCTACGCTTGAGTCAG

AGTTCGCAGAGATAGTACCAACCTGTGCGATTGCTTTGGTGTCGTTACACTCAACAGATA

GCTCTTTTAGTTGCTCAACTGCTGCGATAACTGCTTTGTCGATACCGCGCTTAAGGTCCA

TTGGGTTCATACCCGCTGCAACTGCTTTTAGACCTTCATTTACGATTGCTTGCGCTAG(SEQ IDNO.8)。

4菌株生化鉴定

表4-1H0711和TL0816株的生化鉴定结果

经过前期两轮筛选，将从患病绿海龟体内分离的到的两株弧菌(编号H0711、TL0816)，并且通过人工感染毒力试验证明它们对健康草龟具有较强毒力，分别将其接种在LB液体(2％NaCl)培养基中，置于30℃恒温振荡培养箱中以200rpm培养20h后，以10000rpm，2min离心，再用灭菌生理盐水清洗3次后收集菌体。

5显微镜下直接计数法步骤(用于灭活菌免疫计数)

5.1观察待测菌悬液浓度，加无菌生理盐水适当稀释(一般稀释100倍)，以每小格的菌数可数为度；

5.2取洁净的血球计数板一块，先在计数区上盖上一块盖玻片；

5.3将原菌悬液彻底摇匀，稀释梯度浓度后，用移液器吸取8uL，盖玻片放置好后，在缝隙中滴加菌液，菌液依靠虹吸进入到计数板。

5.4静置3-5min，使菌沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。

5.5中央计数区为25个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央1个中方格的菌数(即25×16个小格)。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记；

5.6在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。

5.7每个样品重复计数2-3次(每次数值不应相差过大，否则应重新操作)，按公式计算出每mL菌悬液所含细菌数量。

5.8测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾放入盒内保存。

5.9计算公式：[(A1+A2+A3+A4+A5)/(5×16)]/[(1/400)×0.1×0.001]×稀释倍数(cfu/mL)。

本发明两种菌种鉴定采用菌株16SrRNA及hsp60基因序列鉴定，测序结果在NCBI进行BLAST比对，经比对，H0711株16SrRNA及hsp60基因序列与NCBI数据库副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)16SRNA和hsp60基因序列同源性分别为100％、99％；并结合生化鉴定结果综合判定为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，TL0816株16SrRNA及hsp60基因序列与NCBI数据库哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)16SRNA和hsp60基因序列同源性分别为100％、99.63％，并结合生化鉴定结果综合判定为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。

所述副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)H0711和哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)TL0816，已于2022年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，所述副溶血弧菌H0711的保藏编号为CCTCC No：M 20221681，所述哈维氏弧菌TL0816的保藏编号为CCTCCNo：M 20221682。

实施例5、免疫原的制备

采用灭菌生理盐水将计算后得出的菌液浓度调整至10

在制备的两株弧菌(H0711、TL0816)菌液中各定量添加0.2％终浓度的福尔马林，放置与30.0℃恒温培养箱中，放置24h进行灭活，即为福尔马林灭活菌液。取3组灭活后的菌液100μL，分别涂布于TCBS平板和LB平板，置于30.0℃恒温培养箱中，放置24h后进行观察，培养基上均无菌落长出，即证明菌体已经被彻底灭活，可以作为灭活菌苗(反应原)使用。

实施例6灭活苗安全性试验

为确保灭活苗注射实验用草龟是安全无毒可靠的，把2株菌H0711和TL0816均灭活后按1：1混合均匀并调整浓度至10

表9-1.高浓度灭活苗14d安全性试验统计

分析：实验结果表明，使用高浓度10

实施例7免疫接种

对均重35g左右的健康草龟，采用肌肉注射100uL灭活二联菌苗，每个菌株的灭活菌苗接种80只草龟，对照组注射100uL无菌生理盐水。将接种后的草龟正常饲养，每天分投喂一次草龟人工配合饲料。饲养期间，水族缸中的水温变化控制在24～28℃之间。自第一次免疫接种灭活二联菌苗饲养10d后，进行第二次免疫，二免剂量一样，饲养时间为20d。

采血与血清分离

从每一个试验和对照组水族缸中随机捞取6只草龟，采用椎骨下静脉方法采血，采集约0.8-1mL的血液放置2mL离心管，在室温下平放置2h以上，4000g，离心20min，分离免疫血清。-80℃保存备用。

免疫保护率统计：对于二免(30d)结束进行攻毒试验，攻毒菌株浓度为两株菌(H0711、TL0816)的2倍LD

血清抗体效价的测定

1、在96孔板V型板(90°)中第一排第一格中各加入50微升生理盐水，其他的孔中各加入50微升；

2、再往第一孔中加入草龟血清20微升混匀，从第一孔中取出50微升再加入到第二孔中，混匀；

3、再从第二孔中取出50微升加入第三孔中混匀，依次类推加至11孔，从第11孔中取出50微升弃去，第12孔不加；

4、往1～12孔中加灭活菌液(1×10

5、低倍镜观察，记录凝集沉淀的最高稀释度的倒数为抗体效价。以稀释倍数最高而又显凝集者为其凝集效价，以标记(+)的上一个滴度记录抗体效价；

6、计算抗体几何平均滴度，几何均数(geometric mean,G)，所有n个观测数据乘积的n次方根，常用于描述存在少数偏大的极端值的正偏态分布或观测值之间呈倍数关系或近似倍数关系数据的集中位置。

7、使用SPSS对抗体效价做单因素方差分析，Step1：打开软件，依次点击“分析——比较均值——单因素ANOVA”；Step2：“单因素方差分析”窗口中，将“抗体效价”放入“因变量列表”选项框中，将“反应原”放入“因子”选项框中。Step3：单因素方差分析”窗口中点击“事后比较”选项，出现“单因素ANOVA：事后多重比较”窗口，在“假定方差齐性”栏下勾选“邦弗伦尼”方法，在“未假定方差齐性”栏下勾选“塔姆黑尼”方法，然后点击“继续”。Step4：“单因素方差分析”窗口中点击“选项”，出现“单因素ANOVA：选项”窗口，勾选“描述性”和“方差齐性检验”和“韦尔奇”，然后点击“继续”。

表13-1实验组和对照组血清凝集抗体效价检测结果

抗体效价显著性分析的结果请见图10。其中免疫原为H0711：TL0816＝1：1,每种菌的高剂量10

从图10中可以看出，抗体效价显著性分析显示，实验组抗体效价均高于对照组，其中佐剂高剂量组显著高于其他组别(P＜0.5)；抗体几何平均滴度计算结果显示佐剂高剂量免疫组最高，为1：1：114.04，其次为佐剂中剂量组，均为1：50.80，其中对照组为1：5.04。实验结果显示，中华草龟在二免疫30天结束后，血清的凝集抗体效价明显比对照组要高。这表明，灭活苗在龟体内产生共同抗体，能有效的保护草龟免受该细菌病害入侵。

实施例8二联苗相对保护率

疫苗相对保护率＝(1-受免龟死亡率/对照组龟死亡率)×100％

6个免疫组以及对照组使用以下4种不同毒株组合进行攻毒试验。攻毒组1攻毒剂量为两个毒株H0711和TL0816的各2LD

表15.混合攻毒相对保护率统计表

混合菌攻毒生存曲线的描述请见图11。

表16.H0711单菌攻毒相对保护率统计表

H0711菌攻毒生存曲线的描述请见图12。

表17.TL0816单菌攻毒相对保护率统计表

上述表15-17，以及图12-图13中可以看出，二免后从攻毒后一个月的生存曲线来看，免疫组的存活率均高于对照组。其中佐剂高剂量免疫组草龟在使用混合菌攻毒后的保护率最高，为75％，其次为无佐剂高剂量免疫组，保护率为68.75％；单菌攻毒的保护率均能达到50％以上，高剂量免疫后，对于攻毒的保护率均高于低剂量攻毒，说明高剂量免疫后更能激发个体产生更多的抗体，提高抗病能力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。