一种基于特异性核酸适配体的抗dsDNA抗体电化学检测方法

技术领域

本发明涉及电化学生物传感器，具体地涉及一种GE/DNA/polyA

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种全身多系统损害的自身免疫病，临床表现为免疫炎症的弥漫性结缔组织病，以血清中出现多种自身抗体和免疫复合物为特点。抗双链DNA抗体(Anti-dsDNA antibody，抗dsDNA抗体)是SLE的特异性抗体，对SLE的特异性可达85％以上，被纳入美国风湿病学会SLE诊断标准。由于该抗体滴度的升降与病情活动密切相关，故被列为SLE疾病活动指标之一。

建立抗dsDNA抗体的精准检测方法，对SLE的诊断及疾病活动度判断具有非常重要的临床意义。目前检测抗dsDNA抗体的方法主要有放射免疫法(radioimmunoassay,RIA法)、间接免疫荧光法indirect immunofluorescence,IIF)、酶联免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)等。因存在放射性核素的污染，RIA法已极少用于抗dsDNA抗体的检测。IIF法特异性较高，但其检测结果需要用荧光显微镜观察，且影响因素较多，对检验人员技术和经验要求较高，无法用于SLE疾病活动度的监测。ELISA敏感性高、操作简便、可以半定量或定量检测抗dsDNA抗体，但方法特异度不高，容易造成假阳性结果。现在普遍建议联合检测抗双链DNA抗体，以高通量的ELISA作为抗dsDNA抗体的初筛实验，减少对稳定期SLE的漏诊率；用特异度较高的IIF复查，减少假阳性和假阴性的发生。当这两种方法出现不一致时就会产生疑惑，有研究数据显示，不一致中以IIF阴性ELISA阳性居多。而这种不一致更多的指向抗体的亲和力。因此临床上迫切需要操作简便、准确度高的抗dsDNA抗体的检测方法，以提高SLE的诊疗水平。

电化学分析以其检测快速、成本低、操作简便等优点而著称，已广泛应用于临床、环境和工业领域。其中，电化学阻抗谱(EIS)是一种直接测量目标分析物引起的电极表面变化的技术，通过一种简单和无标记的策略，可检测基质复杂的生物标志物。例如，基于抗原或抗独特型抗体的EIS生物传感器近年来被广泛应用于特异抗体和其他蛋白的快速检测。然而，由于电极表面不可忽视的非特异性结合，这些基于EIS分析策略的应用在很大程度上受到限制。例如，血清中大量干扰蛋白会严重增加本底反应，降低生物传感器的检测灵敏度。此外，已报道的这些基于免疫的EIS生物传感器高度依赖于重组抗原或抗独特型抗体作为捕获配体，价格昂贵，稳定性欠佳且由于批次间的差异，通常重现性较差。因此，开发高效的防污涂层材料，联合表位模拟肽这种高特异性、廉价、稳定的捕获配体，是成功开发新型基于EIS的抗体检测平台的重要途径。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种快速准确地检测血清中的抗dsDNA抗体的GE/DNA/polyA

本发明的技术方案是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种抗dsDNA抗体的DNA适配体，其含有如下序列的双链DNA探针：

链1：5’-GATCGTAGCTGTCCCGTCCATAATCACTCG-3’(SEQ ID NO.1)

链2：3‘-CTAGCATCGACAGGGCAGGTATTAGTGAGCG-5’(SEQ ID NO.2)。

进一步第，本发明所述DNA适配体按照下述方式配对：

上述DNA链的5’端进行-SH修饰。

本发明得另一技术目的是提供一种GE/DNA/polyA

进一步地，本发明所述polyA

进一步地，本发明所述polyA

进一步地，本发明所述所述金纳米颗粒通过以下方法制备：将200mL的0.01％四氯金酸溶解于5±1mL的1.0％柠檬酸三钠水溶液，搅匀，溶液由灰色变为酒红色，脱离热源静置即生成胶体纳米金，冷却至室温，直至形成透明的红色均相金纳米胶体溶液。

进一步地，本发明所述二抗标记的金纳米颗的制备方法如下：将40～60μL稀释后的Fc区二抗与400～500μL金纳米颗粒溶液混合后孵育后离心，冲洗，取沉淀物溶解于PBS中备用；优选地，所述Fc区二抗的稀释是以Fc区二抗与PBS按体积比1：8～9。

本发明得另一技术目的是提高一种GE/DNA/polyA

1)GE/polyA

2)DNA适配体修饰金电极的制备：将预处理后的金电极浸泡在400～600μM的DNA适配体溶液中，孵育洗涤后浸泡polyA

3)信号放大标签的制备：将40～60μL稀释后的Fc区二抗与400～500μL金纳米颗粒溶液混合后孵育后离心，冲洗，取沉淀物溶解于PBS中备用；优选地，所述Fc区二抗的稀释是以Fc区二抗与PBS按体积比1：8～9；

进一步地，本发明所述金电极预处理包括以下步骤：将金电极抛光打磨，超声清洗，强碱清洗，强酸清洗，用31％H

进一步地，本发明所述包括以下步骤：

1)、用PBS将抗dsDNA抗体标准品稀释成浓度为700～900IU/mL的抗dsDNA抗体储藏液；用空白血浆将抗dsDNA抗体储藏液配置成浓度为10、50、100、200、800IU/mL的标准抗dsDNA抗体溶液，进行线性和灵敏度评估；

2)、将空白血清分别稀释10倍和50倍，分别加入浓度10、50和200IU/mL的抗dsDNA抗体中，评价生物传感器的准确性和精密度；

3)、将DNA适配体/polyA

4)、在含有0.1M KCl的1mM Fe(CN)

式中m和n分别表示两条不同的奈奎斯特曲线；

5)、将上述标准抗dsDNA抗体溶液和待测样本溶液分别进行电化学阻抗谱分析，得到各溶液对应的ΔZ′值，以各标准抗dsDNA抗体溶液得到的ΔZ′值绘制抗dsDNA抗体浓度的标准曲线，并将待测ΔZ′代入标准曲线中计算得到待测样本的血清抗dsDNA抗体值。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

(1)针对抗dsDNA抗体的Fab片段设计筛选出高亲和力的DNA适配体探针，可有效避免体内高同源性hIgG等蛋白的干扰，从而显著提高体内高亲和抗dsDNA抗体检测的特异性；

(2)采用polyA30作为防污涂层用于阻断金电极表面的剩余活性位点，将设计的新型核酸适配体DNA探针固定在电极上作为亲和捕获配体。同时，制备二抗标记的金纳米颗粒作为信号放大标签，用于生物传感器电荷转移电阻的净增加；

(3)所构建的基于电化学阻抗谱分析平台的金电极GE/DNA/polyA30生物传感器，可快速准确地检测血清中的抗dsDNA抗体，实现SLE的早期诊断。

附图说明

图1为本发明核酸适配体决定序列的分子结构模型图。

图2为本发明DNA适配体与抗dsDNA抗体的分子对接图。

图3为本发明MST实验中16个不同浓度样品的初始荧光值。

图4a为本发明不同浓度的DNA适配体与抗dsDNA抗体亲和力。图4b为DNA适配体与抗dsDNA抗体亲和力拟合曲线。

图5为本发明GE/DNA/polyA30电化学生物传感器检测抗dsDNA抗体示意图。

图6为本发明电化学阻抗的等效电路图。

图7a为本发明PolyA30、BSA涂层的防污能力比较；图7b为本发明polyA30孵育电极图。

图8为本发明生物传感器在10IU/mL抗dsDNA抗体标准溶液中的循环伏安图。

图9为本发明不同抗体及其混合物(100IU/mL抗dsDNA抗体，ANA和100μg/mL IgG特异性试验。

图10为本发明抗dsDNA抗体的浓度与净的阻抗值(ΔZ′)变化的标准曲线。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的技术目的、技术方案和优点，现结合附图与具体实施例对本发明做进一步说明。

Fc区二抗为能识别抗dsDNA抗体(厂家：Cell Signaling Technology,产品名称：Anti-Human IgG,Fc gammaFragment Specific,HRP-LinkedAntibody#32935)。

血液采集来源为广东省中医院检验医学部，使用患者和健康体检者的检验后剩余标本，项目的实施通过广东省中医院伦理委员会批准(伦理号ZE2019-206-01)。

polyA

1、DNA适配体的构建

1.1、DNA适配体的仿生设计

首先从蛋白数据库(RCSB)获取与SLE人源抗dsDNA抗体具有高度同源性的抗体(如下表1所示)的-Fab片段和抗原DNA复合物的晶体结构，然后结合分子对接及分子动力学模拟分析DNA抗原与抗体-Fab片段之间的相互作用，明确抗体-Fab片段与抗原结合的活性位点及关键片段。

表1.与SLE人源抗dsDNA抗体具有高度同源性的抗体

1.2、DNA适配体的合成

筛选出能与抗体-Fab片段特异性结合，且亲和力强的DNA，如式I所示，该目标DNA包含胸腺嘧啶二聚体dT(6-4)T结构区域，含有两个相邻胸腺嘧啶(TT)DNA可以在紫外照射(254nm)条件下形成TT-二聚体。

上述R

表2核酸适配体的决定序列

注：上述表格表示各碱基配对关系，如链1的2号碱基C与链2的1’号碱基G配对，并在各链5’端进行SH修饰，以便与金电极连接。

在保持决定序列(上表2所示，其分子结构模型图如图1所示)的基础上，为了提高DNA适配体的稳定性，在其一端增加一定数量的脱氧核糖核苷酸。在此基础上进行DNA适配体的合成。为了使核酸适配体能够连接在金电极上，在链的5’端进行-SH修饰退火。

完整的双链DNA适配体序列为：

链1：5’GATCGTAGCTGTCCCGTCCATAATCACTCG-3’(SEQ ID NO.1)

链2：3‘CTAGCATCGACAGGGCAGGTATTAGTGAGCG-5’(SEQ ID NO.2)

2、抗dsDNA抗体与其核酸适配体亲和力测试

2.1、实验试剂

1).50μM的SH-C

①1M Tris-HCL,pH＝8.0：称1211.4mg三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入7mL超纯水，用浓HCL调节pH＝8.0(约200μL)，定容至10mL。

②0.5M EDTA pH＝8.0：称1861.2mg乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，加入8mL超纯水,用NaOH调节pH＝8.0(约0.4g)，定容至10mL。

③TE buffer：10mMTris-HCL,pH8.0,1mM EDTA

吸取1M Tris-HCL,pH＝8.0500uL，0.5M EDTA pH＝8.0100uL，加超纯水定容到50mL后，高温高压灭菌；室温保存。

1OD

国际规定1OD引物干粉≈33μg(当T,C,G,A各占25％时成立)，本实验默认按照国际规定，以1OD＝33μg计算。每管2OD＝66μg，n＝m/M＝66μg/9625.31＝6.857nmol，加入138μLTE Buffer，得到50μM的适配体溶液。

2).抗dsDNA抗体：欧蒙ELISA抗dsDNA抗体试剂盒中的中浓度质控品，100IU/mL

2.2、操作步骤

注：所用仪器Monolith NT.115，有红光和蓝光两种模式。

本实验荧光分子为100IU/mL抗dsDNA抗体，配体分子为50μM的SH-C

第一步：荧光强度预测

目的：检测荧光分子的荧光强度是否足够进行下一步实验。

操作：取两支毛细管吸取荧光分子溶液上机检测。由于本次实验所用的蛋白和多肽均未标记，所以分别都进行Pretest检测荧光强度。若要进行标记，标记的原则一般为优先标记分子量小的物质，即优先考虑标记多肽配体。

若第一步验证荧光分子荧光强度足够，则进行第二步

第二步：结合情况验证

目的：验证荧光分子与配体分子是否有结合

操作步骤如下：

A组：取20μL荧光分子溶液于0.2mL EP管中，再加入20μL配体分子(20μL dsDNA抗体+20μL核酸适配体)

B组：取20μL荧光分子溶液于0.2mL EP管中，再加入20μL溶解配体分子所用的缓冲液(20μL dsDNA抗体+20μLTE Buffer)

A组和B组各用毛细管吸样4支，上机结合情况检测

若两种分子有结合，则进行第三步

第三步：结合力测试

目的：结合力强弱Kd值的计算

操作步骤如下：

1)、取16支0.2mL EP管编号，第一支加入20μL配体，后15支加入10μL溶剂配体分子所用的缓冲液(最好加入0.05％-0.5％的吐温20，防止荧光分子聚集)，从前1号管吸取10μL溶液加入2号管，混匀后从2号管吸取10μL溶液加入3号管混匀，依次重复，第16号管吸取10μL丢弃；

2)、向上述16支管中加入10μL荧光分子溶液,吹打混匀，避光孵育30min；

3)、孵育后将EP管涡旋混匀，每管用1根毛细管吸取上样，上机结合力检测。

3、GE/DNA/polyA

3.1金电极的预处理

首先，用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末对金电极进行仔细抛光打磨，直至金电极表面像镜面一样光滑，然后用去离子水进行超声清洗。之后依次用0.1M NaOH清洗10min,0.1MHCl清洗5min，食人鱼溶液(31％H

3.2金纳米颗粒的合成

将玻璃器皿在新鲜配制的王水溶液(3:1HNO

3.3GE/polyA

首先将不同碱基数量的polyA

3.4DNA适配体修饰电极的制备

按3.1预处理后的金电极浸泡在DNA适配体溶液(500μM)中，4℃孵育12h。将DNA适配体肽修饰后的金电极(GE/DNA适配体)分别用去离子水和PBS洗涤三次，然后在4℃的polyA

3.5信号放大标签的制备

在预先合成的金纳米颗粒(GNPs)表面修饰能识别抗dsDNA抗体的Fc区二抗(SA)：首先将10μL SA和90μLPBS混合于200μL离心管中，然后将50μL稀释后的SA和450μL GNPs溶液移入2mL离心管中室温孵育2小时。然后在12500×g的重力下离心5min，离心之后用去离子水和PBS冲洗3次。最后，去除上清液，将离心清洗好的沉淀物重新溶解在PBS中备用。

3.6抗dsDNA抗体检测生物传感系统的构建

用PBS稀释抗dsDNA抗体标准品(来源于欧蒙医学诊断(中国)有限公司的品牌EUROIMMUN)，制备抗dsDNA抗体储藏液，浓度为800IU/mL。将储藏液加入稀释10倍的空白血浆中，配制一系列已知浓度(8～800IU/mL)的抗dsDNA抗体溶液进行线性和灵敏度评估。将空白血浆分别稀释10倍和50倍，稀释后的血清样品均加入3种浓度的抗dsDNA抗体溶液(10、50和200IU/mL)，用于评价生物传感器的准确性和精密度。DNA适配体/polyA

式中m和n分别表示两条不同的奈奎斯特曲线。

3.7GE/DNA/polyA

3.7.1DNA适配体与抗dsDNA抗体的分子对接

如图2所示，抗dsDNA抗体-DN适配体的对接使用HDOCK软件通过基于快速傅里叶变换(fast Fourier transform，FFT)的全局对接程序进行。旋转采样采用15°的夹角间隔，基于FFT的平移配体搜索采用

3.7.2MST结果

为了评估DNA适配体与抗dsDNA抗体的结合亲和力(测试方法按2、抗dsDNA抗体与其核酸适配体亲和力测试进行)：首先进行微量热泳实验(MST)，MST数据的初始荧光值数据如图3所示。结果表明，16个样品的初始荧光值的误差在仪器要求的20％以内，这是MST实验的进行K

测试16个对半稀释的不同浓度DNA适配体与抗dsDNA抗体之间的亲和力，通过对这16组配体-受体结合数据的非线性拟合，得到如图4a的不同浓度的DNA适配体与抗dsDNA抗体亲和力拟合曲线以及如图4b DNA适配体与抗dsDNA抗体亲和力拟合曲线，其K

3.7.3基于DNA适配体的抗dsDNA抗体电化学阻抗谱检测平台

通过计算机模拟和MST实验等手段，设计合成、筛选验证了一个对抗dsDNA抗体特异性识别的DNA适配体。通过分子研究，进行了全原子、显式水分子分子动力学模拟，明确了DNA适配体和抗dsDNA抗体的特定作用力。对金电极的表面进行抗污染能力的优化，研制了一种快速、准确的基于电化学阻抗技术的GE/DNA/polyA30电化学阻抗生物传感器，用于血清样本中抗dsDNA抗体的检测。polyA30抗金电极表面非特异性吸附涂层的使用显著提高了传感器的分析性能。所研制的GE/DNA/polyA30电化学阻抗生物传感器具有较好的检测性能、较短的分析时间和较低的成本。此外，该polyA30防污涂层可根据传感界面的实际性能定制合成，可扩展到其他与金界面相关的生物传感器。如图5所示，为GE/DNA/polyA

为了验证polyA

3.8GE/DNA/polyA

通过循环伏安法(CV)，以检查在电活性[Fe(CN)

为了进一步评价GE/DNA/polyA

3.9GE/DNA/polyA

为了验证所构建的EIS生物传感器平台可用于抗dsDNA抗体的定量检测，使用平台对欧蒙抗dsDNA抗体ELISA试剂盒的校准品进行了标准曲线的建立，浓度10,50,100,200,800IU/mL，随着浓度增加EIS值也随之增加。净的阻抗值(ΔZ′)变化与抗dsDNA抗体的浓度呈线性关系(如图10所示)，其关系式满足方程Y(ΔZ′)＝0.886X(C)+1.231(R

IIF法特异性较高，被认为是抗dsDNA检测的金标准。但其检测结果需要用荧光显微镜观察，影响因素较多，对检验人员技术和经验要求较高，无法用于SLE疾病活动度的监测。ELISA敏感性高、操作简便、可以半定量或定量检测抗dsDNA抗体，但方法特异度不高，容易造成假阳性结果。现在普遍建议联合检测抗双链DNA抗体，以高通量的ELISA作为抗dsDNA抗体的初筛实验，减少对稳定期SLE的漏诊率；用特异度较高的IIF复查，减少假阳性和假阴性的发生。当这两种方法出现不一致时就会产生疑惑，前期研究结果表明，不一致中以IIF阴性ELISA阳性居多。

使用既往收集的样本进行方法学间的研究。样本来源于2017年8月至2018年4月广东省中医院就诊的抗dsDNA抗体阳性的血清标本共155例。SLE患者116例，其中男7例，女109例；男女比例为1:16，平均36岁。所有患者均符合2017年美国风湿病学会与欧盟抗风湿病联盟年补充及修订的SLE诊断标准。非SLE组39例，其中男8例，女31例；男女比例为1:4，平均47岁。所有样本取空腹静脉分离血清，于-80℃保存。本研究经广东省中医院伦理委员会批准(伦理号：ZE2019-206)。

前期研究中已分别采用IIF法和ELISA法对抗dsDNA抗体进行了检测，方法如下：

IIF法检测抗dsDNA抗体(dsDNA-IIF)：采用德国欧蒙公司的荧光试剂，以绿绳短膜虫为包被抗原，以异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的羊抗人lgG为荧光二抗，对所有标本进行IIF检测，以抗dsDNA抗体IIF<1:10判为阴性，IIF≥1:10判为阳性。

使用EIS生物传感器对既往样本进行再次检测

结果：样本人群的基本特征及不同方法检测结果的情况

SLE多发生于中年女性患者，SLE组女性比例高于非SLE组，P<0.05。2组的dsDNA-IIF、dsDNA-ELISA、EIS生物传感器的差异均有统计学意义，P<0.05。见表3。在SLE组中EIS生物传感器的阳性检出率较好(79.31％)，和dsDNA-ELISA的阳性检出率相当(85.34％)。非SLE组中dsDNA-IIF 39例全部为阴性，dsDNA-ELISA阳性15例、阴性24例，说明dsDNA-ELISA检测结果特异性不高。而在非SLE组中它的阳性2例，与ELISA相比表现出了更好的特异度。

表3样本人群的基本特征及两种方法检测结果的情况

注：年龄采用中位数(四分位数)表示；与非SLE疾病组比较，

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。