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一种烟管菌及其应用

文献发布时间：2023-06-19 19:28:50

技术领域

本发明涉及植物病原菌防治技术领域，特别是涉及一种烟管菌及其应用。

背景技术

柑橘黑点病，广泛流行于我国柑橘产区，给柑橘产业带来较为严重的经济损失。该病的病原为柑橘间座壳菌(Diaporthe citri，D.citri)，主要在枯枝上越冬，而后生长、繁殖，通过其分生孢子孢子侵染寄主植物 (主要为芸香科，包括柑橘、脐橙、葡萄柚等)的果实、叶片和新梢，引起宿主细胞的防卫性反应。在果实表面形成黑色至红褐色的密集小点，严重降低柑橘的商品价值；由于是宿主细胞的防卫性反应造成黑点病症状，D.citri无法在柑橘的果实、叶片和新梢等活体组织上形成子实体，更无法在此越冬；但它却能够以枯枝作为自身越冬的场所，形成子实体，从而开启下一个侵染循环。果园每年产生大量的农业废弃物，除了自然脱落的枯枝落叶，果园每年修剪产生的枯枝更多，同时，枯枝落叶上带有大量的果树病原物。因此，利用可以降解果园枯枝落叶废弃物，同时分解杀死黑点病菌的真菌处理柑橘园的带菌枯枝，是防治柑橘黑点病的重要措施，同时可以降低果园农药的用量，保护环境和人民健康，因而具有重要意义和应用前景。

烟管菌(Bjerkandera adusta)是一种具有分解木质素能力的大型白腐真菌，由于其可以产生多种胞外木质素酶和纤维素酶(专利CN 114107139 A)，在农田废物处理中具有重要作用。烟管菌不但能够降解含木质素的材料，还可以降解其他有机物，利用烟管菌抑制植物真菌病原物，是其中的热点之一。但是烟管菌防治植物真菌病害的机理不清，不同烟管菌菌株(分离物)之间的抑菌作用不同，抑菌能力也不同。如有研究表明，烟管菌与Fusariumoxysporum对峙培养7天，抑菌圈直径小于1cm(Brum, M.,WL Araújo,Maki,C.S.,&Azevedo,J.L..(2012).Endophytic fungi from vitis labruscaL.('niagara rosada')and itspotential for the biological control of fusarium oxysporum.Genetics andmolecular research:GMR,11(4): 4187-4197.)。Bjerkandera adusta抑菌物质是酚类化合物(Soliman,E.R.S., &El-Sayed,H..(2021).Molecular identification andantimicrobial activities of some wild Egyptian mushrooms:Bjerkandera adustaas a promising source of bioactive antimicrobial phenolic compounds.Journalof Genetic Engineering and Biotechnology,19(1):106.)等，这些研究说明不同菌株产生的抑菌物质不同，但是烟管菌对植物病原真菌的寄生分解作用很小。这样的菌对已经存在的病原菌的作用不大。因此筛选对植物病原菌具有抑制、寄生分解作用的烟管菌，对植物残体进行分解的同时，寄生分解植物病原菌，将极大减少柑桔黑点病的侵染来源，大大提高防治效果。

发明内容

本申请筛选到了一株可以对果园枯木的降解作用，对柑橘黑点病菌有高效的寄生作用的烟管菌(Bjerkandera adusta)。

一种烟管菌，命名为烟管菌(Bjerkandera adusta)，株号J3-W27，保藏号为CCTCCNO：M2022715。本申请菌株J3-W27是从浙江省杭州市西湖区(北纬30.2433度，东经120.1143度)的腐朽枯木上采集并分离。通过多个序列比较，J3-W27菌株与烟管菌(Bjerkanderaadusta)序列最接近，亲缘关系最近，此结果与形态鉴定结果相同，表明我们分离到的 J3-W27菌株是烟管菌(Bjerkandera adusta)。将该新筛选到的J3-W27菌株命名为Bjerkanderaadusta，株号J3-W27，于2022年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2022715。

本发明还提供了所述的烟管菌在抑制柑橘黑点病菌(Diaporthe citriF.A.Wolf)生长中的应用。

本发明还提供了所述的烟管菌在防治芸香科植物柑橘黑点病菌 (Diaporthecitri F.A.Wolf)感染中的应用。

凡是能够感染柑橘黑点病菌的植株均能够使用。除所述柑橘外，芸香科其他植物例如橙子、柚子均可应用。优选的，所述芸香科植物为柑、桔、柚、柠檬或橙。

本发明还提供了一种柑橘黑点病菌抑制剂，活性成分包含所述的烟管菌。

本发明还提供了所述柑橘黑点病菌抑制剂的制备方法，将所述的烟管菌接种到发酵培养基培养后，去除菌体的发酵液即为柑橘黑点病菌抑制剂。

优选的，培养温度为25℃，培养时间为7天。

本发明还提供了一种柑橘黑点病菌的防治方法，使用所述的烟管菌或所述柑橘黑点病菌抑制剂喷洒在柑橘植株上；或者烟管菌液体发酵液喷洒在柑橘植株上。

本发明经筛选分离到一株烟管菌，命名为烟管菌(Bjerkandera adusta)，株号J3-W27，保藏号为CCTCC NO：M2022715。菌株J3-W27果园枯枝落叶有很好的降解作用，对柑橘黑点病菌有高效的寄生作用。不但要对病原菌具有抑制、寄生分解作用，同时还对植物残体有强烈的分解作用，将极大减少柑橘黑点病的侵染来源，大大提高防治效果。

附图说明

图1为J3-W27在PDA平板上培养5天的菌落形态图。

图2为J3-W27对柑橘黑点病菌的抑制寄生情况图。

图3为J20-10对柑橘黑点病菌的抑制寄生情况图。

图4为J22L-4对柑橘黑点病菌的抑制寄生情况图。

图5为以柑橘黑点病菌菌丝为基质培养J3-W27菌株情况图。

图6为以柑橘黑点病菌菌丝为基质培养J20-10菌株情况图。

图7为以柑橘黑点病菌菌丝为基质培养J22L-4菌株情况图。

图8为不同菌株对柑橘黑点病菌菌丝的寄生率图。

图9为Ct值与log X的线性关系(标准曲线)图。

具体实施方式

实施例1：菌种分离

从浙江省各地的枯木腐木上采集样品，采用组织分离法分离，过程如下：在超净工作台中，将手术刀及长镊子分别用75％乙醇溶液(v/v)消毒后，用酒精灯外焰灼烧其刀片或镊子尖端至发红后，手术刀刀片和镊尖朝上插于架上待其冷却后使用；于超净工作台中用75％乙醇溶液(v/v) 擦拭样品表面后，用手术刀将其沿纵切面切开，切取边长为0.5cm的内部菌肉，用镊子夹取至GPDA培养基的培养皿内，每一个样品取3～6个分离块，放于25℃黑暗培养箱中培养；每天观察培养皿中，待接种菌块长出菌丝后，立即在解剖镜下(解剖镜预先用75％乙醇溶液(v/v)消毒后置于超净工作台中)进行单菌丝分离并其转移至新的PDA板上；待新的PDA板上菌落长至3cm～4cm直径时进行进一步实验。

GPDA培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，3g磷酸二氢钾，30g琼脂，0.3g氯霉素(chloramphenicol)，1000mL蒸馏水。

PDA培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂，0.3g氯霉素 (chloramphenicol)，1000mL蒸馏水。

PDB液体培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂，1000mL 蒸馏水。

从浙江省杭州市西湖区(北纬30.2433度，东经120.1143度)的腐木多孔菌样品上分离到一株菌株，命名为J3-W27。菌株J20-10从杭州半山国家森林公园的腐木多孔菌样品上分离到的，菌株J22L-4是从淳安县千岛湖岛屿的腐木多孔菌样品上分离到的。这3个样品的形态特征无明显差别，分离物的培养特征也无差异。

实施例2：对峙培养检测

烟管菌对柑橘黑点病菌的抑制寄生作用。

(1)接种与培养

将从浙江省各地分离了多株烟管菌(Bjerkandera adusta)和柑橘黑点病菌菌株D.citri N27(分离自台州柑橘园黑点病发病枝条)重新接种于新的9cm PDA板，25℃培养箱黑暗培养10d后，于超净工作台中，用预先于酒精灯外焰烧红后冷却的5mm直径打孔器，在菌落边缘打下若干个菌饼，用灭菌过的干净牙签将其接种至事先倒好凝固的7cm培养基(倒前各加入50μg/mL的链霉素和80μg/mL的头孢霉素并混匀)中，在同一条直径上，Irpexlacteus菌株和N27菌株的菌块分别接种于圆心的两边，相距3cm。每个处理3个重复，设置一组只接种有N27菌株的菌块的对照组，其他条件皆与实验组相同。试验的培养皿放置在25℃培养箱黑暗培养 5d。

(2)菌落半径的测量与记录

对对照组和实验组的N27菌落半径(N27菌饼中心至与Bjerkandera adusta菌株菌饼中心连接处的生长边缘)进行三次测量。对照组所得N27 菌落半径值为R

对峙培养中，Bjerkandera adusta菌株对N27菌株寄生率的计算：Bjerkanderaadusta菌株与N27菌株重叠生长区域面积(S)占N27全部菌落面积(S

从浙江省各地分离了多株烟管菌(Bjerkandera adusta)，将不同的烟管菌菌株与柑橘黑点病菌D.citri N27接种至PDA培养基上，25℃下进行黑暗对峙培养5d。通过对峙培养筛选了对柑橘黑点病菌的抑制情况，筛选出3株抑制作用明显(图2～4)。其中菌株J3-W27的抑制效果最好，菌株J20-10次之，菌株J22L-4最差。其抑制率分别达到61.11％、51.02％、37.16％，寄生率分别44.55％、20.94％、15.27％(表1)。J3-W27无论是抑制率还是寄生率，比同种的其他菌株都显著增加。

表1不同烟管菌菌株对柑橘黑点病菌的抑制率和寄生率

实施例3

以柑橘黑点病菌N27菌丝体作为基质，检测烟管菌菌株对柑橘黑点病菌的寄生能力。

在固体PDA培养基中活化后的D.citri N27菌落上，打三个菌饼于装有50mL液体PDB培养基的锥形瓶中，置于25℃，150rpm摇床中培养5 d，得到D.citri N27发酵液。而后，将培养好的菌液以7500rpm 4℃离心 10min，弃上清液，于超净工作台中，加入适量ddH

以D.citri N27菌丝体培养烟管菌菌株时，烟管菌对D.citri N27的寄生率的计算：烟管菌白色菌丝生长区域面积(S)占N27菌丝体基质区域面积(S

结果如图5-7所示，供试的3株烟管菌菌株都能以N27的菌丝体为基质进行生长，说明这3株烟管菌都可以寄生分解柑橘黑点病菌。其中 J3-W27的寄生能力明显比其他菌株强，菌丝生长旺盛，寄生率达到98％ (图8)。

实施例4：菌种形态鉴定

在标本上的形态特征：担子果一年生，无柄，菌盖半圆形，有时不规则形，表面淡黄色、灰色至浅褐色，稍粗糙，边缘波浪形；菌肉白色至灰色，软韧革质，干后脆，纤维状；菌管黑色，管孔面烟色至鼠灰色，圆形或近多角形，小而密，长0.5～2mm。担孢子椭圆形或长椭圆形，无色，平滑，(3.5～4.5)×(2～3)μm。

培养物菌落特征：在PDA培养基上，气生菌丝发达，菌落白色(图1)。

综合菌落形态特征、培养特征，将菌株J3-W27鉴定为烟管菌。

实施例5：分子鉴定

(1)DNA提取

1)在PDA平板上22℃培养J3-W27菌株7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300μL提取缓冲液1.5mL离心管中；

提取缓冲液的配方为：1M KCl，100mM Tris-HCl，10mM EDTA， pH＝8.0；

2)将挑取的菌丝用电磨机研碎，然后再加入300μL提取缓冲液，剧烈震荡2min；

3)10000rpm离心10min；

4)吸取上清液，转移至另一新的离心管中，弃沉淀；

5)在上清液中加入等体积的异丙醇(分析纯)，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心10min，沉淀核酸；

6)轻轻倒去上清液，将含有沉淀的离心管倒置在吸水纸上排干水分；

7)再加入300μL 70％乙醇溶液(v/v)，轻轻颠倒混匀数次后，12000 rpm离心2min；

8)轻轻倒去上清液，重复步骤7)一次；

9)将离心管倒置在吸水纸上排干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发；

10)用50μL ddH

(2)真菌核糖体ITS rDNA基因、核糖体SSU rDNA基因、核糖体 LSU rDNA基因、转录因子TEF基因、RPB2基因的PCR扩增

ITS引物：上游引物ITS1序列为： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物ITS4序列为： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；

SSU基因引物：上游引物NS1序列为： 5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，下游引物NS4序列为： 5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′；

LSU引物：上游引物LR5序列为：5′-ATCCTGAGGGAAACTTC-3′，下游引物LROR序列为：5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′；

TEF引物：上游引物EF1-983F序列为： 5′-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3′；下游引物EF1-1567R序列为： 5′-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3′(引物中字母K和R均为简并密码，K为G/T，R为A/G)；

RPB2引物：上游引物bRPB2-6F序列为： 5′-TGGGGYATGGTNTGYCCYGC-3′；下游引物bRPB2-7R序列为： 5′-GAYTGRTTRTGRTCRGGGAAVGG-3′。

PCR扩增在50μL反应体系中进行，体系中含有：上下游引物各2μM，dNTPs 200μM，MgCl

PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行。反应条件：94℃预变性2min；然后35个循环包括：94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸 1min；最后72℃后延伸10min。

(3)PCR产物的回收纯化

PCR反应结束后，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶(m/v)电泳检测后，采用爱思进生物技术公司的DNA凝胶纯化试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行，步骤如下：

1)将50μL PCR产物全部加到1％的琼脂糖凝胶(m/v)的点样孔中，按5V/cm的电泳条件电泳30min；

2)电泳结束后，在紫外灯下用刀片切取含目的DNA片段的凝胶，置于2mL离心管中，称重；

3)按照1mg凝胶加入3mL的DE-A缓冲液的标准，加入DE-A缓冲液到收集凝胶的2mL离心管中，75℃保温10min，期间振荡数次，至完全融化；

4)加入0.5倍DE-A体积的DE-B缓冲液，混合均匀；

5)将DNA制备管放入2mL离心管中，将混合液转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃上清；

6)将DNA制备管放回2mL离心管中，加500μL缓冲液W1，12000 rpm离心30s；

7)将DNA制备管放回2mL离心管中，加700μL缓冲液W2，12000 rpm离心30s；

8)重复步骤7)一次；

9)将DNA制备管放回2mL离心管中，12000rpm离心2min；以排干膜上洗涤液；

10)将DNA制备管放回2mL离心管中，加50μL的ddH

(4)基因的测序和序列分析

经电泳检测后的已经纯化回收的目的DNA片段送至上海生工用 ABIPRISMA377型自动测序仪进行测序。测序结果经过严格核对后，得到如SEQ ID No.1～5所示的DNA片段序列；其中，真菌核糖体ITS rDNA 基因的PCR扩增产物(如SEQ ID No.1所示)、核糖体SSUrDNA基因的PCR扩增产物(如SEQ ID No.2所示)、核糖体LSU rDNA基因的PCR 扩增产物(如SEQ ID No.3所示)、转录因子TEF基因的PCR扩增产物 (如SEQ ID No.4所示)、RPB2基因的PCR扩增产物(如SEQ ID No.5 所示)。

在NCBI网站上，将测得J3-W27菌株的ITS的核苷酸序列用BLAST 在GenBank数据库中查找和比对同源或相似的核苷酸序列。对比结果显示，此序列与登录号为MK806486、MZ541982、FJ810147等属于Bjerkandera adusta菌株的覆盖率为97％以上，相似度为99.6％以上。

而用J3-W27的SSU基因序列检索GenBank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为MT644869、DQ060085的Bjerkandera adusta菌株的覆盖率达100％，相似度达到99％。

而用J3-W27的LSU基因序列检索GenBank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为GQ470629、MW520205、KC176332的Bjerkandera adusta菌株的覆盖率达100％，相似性都为99.8％以上。

用J3-W27的TEF序列检索GenBank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为KT305938的Bjerkandera adusta菌株的相似性达到97％，而与其它种菌株的相似度都低于90％。

用J3-W27的RPB2序列检索GenBank数据库，对比结果显示，与此序列相似度最大的2个登录号分别为KP134913、LN714631，物种是 Bjerkandera adusta，覆盖率达97％，相似性都为96％以上。

通过形态学和DNA序列分析，表明菌株J3-W27属于烟管菌 (Bjerkanderaadusta)。将该新筛选的菌株命名为烟管菌(Bjerkandera adusta)，株号J3-W27，于2022年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2022715。

实施例6

qPCR检测菌株J3-W27对D.citri N27的抑制效果。

提前准备D.citri N27培养液(步骤同实施例3)。

(1)枯枝预处理

利用小型粉碎机将采集自柑橘园中的枯枝粉碎为粒径约1mm的碎屑，并将碎屑分装于100mL锥形瓶中，每瓶装20g，置于121℃下，进行15min 高温灭菌。

(2)菌株接种及培养

取D.citri N27发酵产物于50mL离心管，加入灭菌过的钢珠，65Hz 下研磨60s。于超净工作台中，往装有枯枝碎屑的锥形瓶内加入研磨液，每个瓶5mL，放置于25℃培养箱中进行黑暗培养。7d后，在超净工作台中往装有碎屑的锥形瓶内加入烟管菌菌株J3-W27的菌饼(菌饼准备步骤同实施例3)，每个锥形瓶置三个菌饼，三个重复，以三个只含D.citri N27但未加多孔菌的木屑为空白对照。将锥形瓶放回25℃培养箱中，进行黑暗培养90d。而后，每月定期向锥形瓶中分别加入3mL ddH

(3)qPCR标准曲线制作

以qPCR检测的特异性引物为扩增引物，以D.citri N27菌株的DNA 提取物作为模板，在最适退火温度下进行PCR扩增后，进行切胶回收和回收产物浓度(OD

式中：c为模板浓度，V为添加体积，N

(4)枯枝处理物的取样及其总DNA提取

用灭菌过的长药匙将锥形瓶中的碎屑分别搅拌均匀。之后，使用分析天平称量碎屑，分别从每个锥形瓶中取样品0.1000g。选择MP公司的土壤DNA提取试剂盒

qPCR扩增反应：将纯化的柑橘黑点病菌的PCR产物(以Dc qF和 Dc qR为引物，如表2所示)按10倍梯度稀释成qPCR快速检测体系的模板，建立柑橘黑点病菌qPCR快速检测体系，以Dc qF和Dc qR为特异性引物，进行qPCR三步法扩增。引物信息、反应体系及反应条件如下：

表2 D.citri qPCR检测的特异性引物

表3 qPCR反应体系(20μL)

表4 qPCR反应条件(三步法)

通过Ct值得到对应样品的拷贝数对数值，从而得到1μL待测样品中所含DNA拷贝数(Quantity unknown，Qu)，具体计算见公式(4)。基于拷贝数变化的抑制率(Inhibitionrate，Ir)则通过公式(5)计算得出(Q

以D.citriN27菌株的DNA提取物作为模板，qPCR检测特异性引物为扩增引物进行进行PCR扩增，将其产物进行切胶回收、梯度稀释后作为模板进行qPCR特异性扩增并且制作标准曲线(图9)，得到DNA拷贝数的对数值和Ct值之间对应的线性关系式y＝-2.9721x+34.777(R

表5 J3-W27菌株对柑橘黑点病菌的抑制率

以柑橘枯枝碎屑为基质，将菌株J3-W27和柑橘黑点病菌D.citriN27 进行共培养90d后，基于qPCR检测得到的各处理及空白对照的DNA拷贝数，计算得到的抑制率(表5)表明，菌株J3-W27对于柑橘黑点病菌 D.citri N27具有明显的抑制效果，其抑制率均达到96.0％。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种烟管菌及其应用

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<212> DNA

<213> 烟管菌(Bjerkandera adusta)

<400> 1

tggaagtaaa aagtcgtaac aaggtttccg taggtgaacc tgcggaagga tcattatcga 60

gttttgaatg ggttgtctgc tggctcgcaa gggcatgtgc acgcctgtct catccactct 120

caacttctgt gcacttttca taggccggct tgtgggtgcg ttcgcgcact tgtaggtgtc 180

gggcttatgc tttactacaa acgattcagt tttagaatgt catactttgc tataacgcaa 240

ttatatacaa ctttcagcaa cggatctctt ggctctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa 300

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gagggtattc tagtgttcac gcttctaacc gtcttcggac aaatttctga actctgagct 600

caaatcagta gacaggcccg cccgc 625

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<212> DNA

<213> 烟管菌(Bjerkandera adusta)

<400> 2

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tttactacat ggataactgt ggtaattcta gagctaatac atgcaatcaa gccccgactt 120

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caagaacgaa ggttagggga tcgaaaacga tcagataccg ttgtagtctt aacagtaaac 960

tatgccgact agggatcggg cgaactcaat ttgatgtgtc gctcggcacc ttacgagaaa 1020

tcaaagtctt tgggttctgg ggg 1043

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<211> 880

<212> DNA

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<400> 3

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taatgaaagt gaaagttggg acttctgtcg tggaaggcac cgacgcccgg accagacctt 720

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ggctgactgt gccgtcctca tcattgccgg cggtaccggt gagttcgagg ctggtatctc 60

caaggatggc cagacycgcg agcacgccct ccttgccttc accctcggtg tcaggcagct 120

catcgtcgcc gtcaacaaga tggacaccac caaggttagc gcytttttyc gagtcatgaa 180

aaataatctc accccctatg tagtggagcg aggaccgttt caacgaaatc gtcaaggaga 240

cctccacctt catcaagaag gtyggctaca accccaaggc cgtcgccttc gtccccatct 300

ccggctggca cggtgacaac atgttggagg agtcccccaa gtaagttcct ctatgacgtc 360

gcgaaaagcg cagatactaa ccctgcaata gcatgccgtg gtacaagggc tggaccaagg 420

agaccaaggc cggtgtcgtc aagggcaaga ccctcctcga cgccatcgat gccatcgagc 480

cccccgtccg tccctccgac aagcccctcc gtctccccct ccaggatgtc tacaagatcg 540

<210> 5

<211> 699

<212> DNA

<213> 烟管菌(Bjerkandera adusta)

<400> 5

ttgcggtctc gtcaagaacc tatcgctcat gtcatgcatc tccgtcggct ctctttctgc 60

gcctgttatc gaattcttgg aggagtgggg tctcgagtct ctcgaagaaa acgcacactc 120

tgcgacacca tgcacgaaag tcttcgtcaa cggcgtttgg atgggcgttc accgtgaccc 180

ggccaacttg gtcaagacca tcaagaagct ccgtcgcaag gacgatatca gccctgaagt 240

ctccgtggtt cgggatattc gtgaaaggga gttgcggctc tacacggacg caggtcgtgt 300

ctgccgaccg ctcttcattg tggagaatca acagctgacg ctcaagcgga aacatatcga 360

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gaactcgcgg ctgttggcgg ctggtgtcga cttgcatgcc aacgaaggcg atttcgaccc 600

cgcttctagg ttgaagcccg taccagccct acacaactac acacattgcg agattcaccc 660

tagtatgatc cttggtgttt gcgccggtat cattccttc 699

<210> 6

<211> 19

<212> DNA