一种利用SSR分子标记提早选择红掌有香后代单株的方法

技术领域

本发明属于植物育种技术领域。更具体地，涉及一种利用SSR分子标记提早选择红掌有香后代单株的方法。

背景技术

红掌(Anthurium andraeanum Lind.)属天南星科(Araceae)花烛属(Anthurium)多年生草本植物。其佛焰苞心形，颜色丰富且花期长，既可作为盆花也可作为鲜切花，具有很高的观赏价值，深受消费者喜爱，市场前景广阔。新品种选育是红掌产业高效可持续发展的关键。在国外，红掌育种在上个世纪四十年代就已开始，而我国的红掌育种则在本世纪初。红掌常规育种周期长、育种成本高，一般培育一个红掌新品种需要8-10年。因此如何缩短育种周期，提高育种效率和效益，已成为进一步推动我国红掌产业自主高效发展的关键。

花香是红掌的主要观赏性状，市场上具有香气的红掌盆花或鲜切花往往比无香品种更具竞争力，但目前市场上的大部分是无香品种。因此选育香型红掌具有重要意义，而在传统育种过程中，红掌香气性状选择只能在后代植株开花时进行，无法提早对有香后代进行种苗繁殖，因此育种周期长；与此同时，育种早期也无法提早淘汰非育种目标性状植株，导致后代群体大，育种成本高。因此研究在育种早期对红掌香气进行选择技术，对缩短育种周期，减少大规模种植，提高育种效益、尽快缩短与国外育种差距均具有重要意义。

分子标记作为新一代的遗传标记，数量众多。利用与育种目标性状基因紧密连锁的分子标记在植株生长的不同阶段，通过提取基因组DNA进行PCR和凝胶电泳检测，就能够实现对具有目标性状植株的提早选择。分子标记辅助选择且具选择准确率高，检测手段简便快速、不受环境条件影响，可以提早对育种目标性状进行选择、可以对隐性性状进行选择，可以对不易观测或观测成本高的性状进行选择等优点。但迄今国内外未见到利用SSR分子标记辅助红掌香气性状选择的报导。为了进一步加快我国香型红掌新品种选育，采用分子标记进行选育，对推动分子标记辅助红掌其他育种目标性状选择具有重要的参考价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是能提前进行红掌香气性状选择，提供一种利用SSR分子标记提早选择红掌有香后代单株的方法。

本发明的主要目的是提供一种用于检测红掌香气性状相关SSR分子标记的引物。

本发明另一目的是提供所述引物在选择红掌有香后代单株中的应用。

本发明又一目的是提供一种利用SSR分子标记辅助选择提高红掌育种效率和效益的方法。

本发明的再一目的是提供一种鉴定香型红掌的试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

现有红掌育种方法主要是杂交育种，香气性状选择只能在杂种后代开花时进行，不能提早选择和淘汰非育种目标的后代植株，既耗时又费钱。本发明通过开发与红掌香气连锁的分子标记，进行引物设计和筛选，获得一种用于检测红掌香气性状相关SSR分子标记的引物，包括上游引物5’-GTTGACAGCCGTCATCACC-3’和下游引物5’-ACATACAGAAGGGTCCGTCG-3’；利用开发的分子标记辅助选择红掌有香后代，实现在杂交后代幼苗期对香气性状的提早选择，对筛选出的香气后代可以进行组培快繁生产种苗，从而明显缩短红掌育种周期，与此同时对没有香气的后代可以直接淘汰，减少了种植规模，提高了红掌育种效率和效益。

因此，本发明提供用于检测红掌香气性状相关SSR分子标记的引物在选择红掌有香后代单株中的应用。

本发明提供一种利用SSR分子标记提早选择红掌有香后代单株的方法，包括以下步骤：

S1.配制杂交组合：选择红掌杂交亲本，配制杂交组合，获得红掌杂交F

S2.SSR分子标记辅助红掌有香后代单株选择：提取红掌亲本及红掌杂交F

S3.香型红掌单株鉴定：将步骤S2选择的后代继续栽培，待开花时结合鼻嗅法鉴定选出香型红掌优良单株。

优选地，根据育种目标选择有香气的红掌做亲本，如果有香气的红掌综合性状好，以其做母本配制杂交组合。以进口泥炭为基质采用直接播种生产后代或用组织培养技术生产后代，以鼻嗅法在早上10点左右对开花后代进行香气性状鉴定。

优选地，步骤S2中提取80.0～120.0mg亲本及杂交F

优选地，步骤S2中PCR扩增应体系为：50.0～100.0ng/μL的DNA模板1.0μL，PCR-mix5.0μL，10.0uM/μL的上游引物和下游引物各0.5μL，ddH

优选地，步骤S2中PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃延伸5min，12℃保存。

更优选地，所述退火57℃。

优选地，步骤S2中聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法为：将PCR扩增产物在6～8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电压300V，120～150min，电泳结束后进行银染和显色，并拍照读带。

本发明还提供一种鉴定香型红掌的试剂盒，含有上述分子标记引物：上游引物5’-GTTGACAGCCGTCATCACC-3’，下游引物5’-ACATACAGAAGGGTCCGTCG-3’。

优选地，所述试剂盒还包含提取样本DNA的试剂。

更优选地，还包含PCR扩增所需试剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供一种利用SSR分子标记提早选择红掌有香后代单株的方法，通过开发与红掌香气连锁的分子标记，并利用分子标记辅助选择红掌有香后代，可在杂交后代幼苗期对香气性状提早选择，对筛选出的香气后代可以进行组培快繁生产种苗，从而明显缩短红掌育种周期，与此同时对没有香气的后代可以直接淘汰，减少了种植规模，提高了红掌育种效率和效益。与现有红掌育种的方法相比，不仅能提早选择和淘汰非育种目标的后代植株，又能缩短育种周期、降低育种成本，解决了香气性状选择只能在杂种后代开花时进行的问题。

本发明将SSR分子标记应用于香型红掌育种、提早选择红掌有香后代单株，能实现对香气性状的提早选择，这对进一步加快我国香型红掌新品种选育，对推动分子标记辅助红掌其他育种目标性状选择也有重要的参考价值。

附图说明

图1为不同SSR分子标记在亲本间的多态性结果图(P1为A.‘Mystral’；P2为A.‘Alabama’；1为分子标记amf124；2为分子标记amf153；3为分子标记amf182；4为分子标记amf173；5为分子标记amf130；6为分子标记SSR199；7为分子标记amf191；8为分子标记amf155；9为分子标记amf15；10为分子标记amf137)；

图2为红掌‘2008-377’组合亲本及10株F

图3为分子标记SSR26对红掌‘2008-377’组合亲本及30株有香F

图4为分子标记SSR26对红掌‘2008-377’组合亲本及30株无香F

图5为分子标记SSR26对‘2008-377’组合亲本及46株F

图6为分子标记SSR26对‘2008-377’组合48株F

图7为分子标记SSR26对‘2018-099’组合22株F

图8为分子标记SSR26对‘2018-099’组合23株F

图9为‘2018-009’组合中入选香型红掌优良单株形态图(a:009-3；b:009-20；c:009-23；d:009-46；e:009-48.)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

其中，所述‘2008-377’组合为：以有香红掌A.‘Mystral’为母本、无香红掌A.‘Alabama’为父本，配制红掌杂交组合‘2008-377’；

所述‘2018-009’组合为：以A.‘Mystral’为母本，小娇红掌(A.‘Xiao Jiao’)为父本，配制杂交组合‘2018-009’。

实施例1分子标记开发及与香气连锁标记的筛选

本实施例以有香红掌Anthurium‘Alabama’为母本、无香红掌Anthurium‘Mystral’为父本，配制红掌杂交组合‘2008-377’；以进口泥炭为基质采用直接播种方法，培育生产杂交后代，以鼻嗅法在早上10点左右对开花后代进行香气性状鉴定。

通过对无香红掌A.‘Mystral’和有香红掌A.‘Alabama’进行转录组测序，根据已知基因序列和引物设计要求(引物长度18～22bp，扩增产物大小为100～250bp，GC含量为40％～60％，上下游引物的退火温度相差在2℃以内)，利用Primer Premier 5.0软件设计得到引物201对，其中根据花香基因设计引物51对；另外再采用现有技术中公开的红掌SSR引物125对，共326对引物。将上述引物送到广州擎科生物公司合成，再以红掌A.‘Alabama’和A.‘Mystral’为材料进行多态性引物筛选。多态性引物筛选结果如表1所示，表明在326对引物中，共筛选出多态性引物137个，多态率为42.0％，其中部分花香多态性引物序列如表2所示，其扩增结果如图1所示，显示部分分子标记引物amf124、amf153、amf182、amf173、amf130、SSR199、amf191、amf155、amf15、amf137在亲本间具有多态性。

表1多态性引物筛选

表2部分花香多态性引物

利用上述筛选出来的137对多态性引物对‘2008-377’组合的父母本及其部分有香气和无香气后代基因组DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。采用PCR扩增反应体系(10.0μL)为：1.0μL DNA模板(50.0～100.0ng/μL)，5.0μL PCR-mix，0.5μL上游引物(10.0uM/μL)，0.5μL下游引物(10.0uM/μL)，3.0μL ddH2O。PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃延伸5min，12℃保存。

电泳检测：用微量取样器吸取5.0μL PCR产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳(电压300V，120～150min)，电泳结束后用0.1％硝酸银溶液银染10min，银染结束后用纯水清洗2～3次凝胶，清洗完显色10min(显色液：0.2g四硼酸钠、15.0g氢氧化钠、甲醛4.0ml、蒸馏水定容至1.0L)最后放置白色塑胶板上拍照读带。

结果显示，绝大多数分子标记引物如Am128(图2a)和Am2(图2b)一样，与香气不连锁。而分子标记引物SSR26在有香气后代中扩增出的条带多数与有香亲本带型一致(图3)，在香气后代扩增出的条带多数与无香亲本带型一致(图4)，说明该标记与红掌香气性状连锁。

实施例2 SSR分子标记辅助香型红掌后代的选择效率

为了进一步验证其标记的准确性，本实施例利用分子标记引物SSR26对94个杂交后代(由实施例1的‘2018-377’组合配制得到F

准确率＝有香后代植株数/与有香亲本带型一致的后代植株数×100％，当选择准确率在80.0％以上，该标记可用于辅助香气性状选择。

试验结果如图5和图6所示，表明带型与有香红掌A.‘Mystral’一致的杂交后代有54个，其中通过鼻嗅鉴定有47个后代有香味，经过计算得出采用分子标记SSR26辅助香气选择的准确率为87.0％，说明开发出的SSR分子标记可用于红掌香气性状辅助选择。

实施例3 SSR分子标记辅助香型红掌后代的选择

经上述研究得到分子标记SSR26辅助香气选择的具有较高的准确性，为进一步利用与红掌香气连锁的分子标记SSR26辅助香型红掌后代选择，本实施例以A.‘Mystral’为母本，小娇红掌(A.‘Xiao Jiao’)为父本，配制杂交组合‘2018-009’，以进口泥炭为基质采用直接播种方法，培育生产杂交后代。当‘2018-009’组合后代在穴盘中长有4～5片叶，取80.0mg嫩叶采用CTAB法提取基因组DNA，提取的DNA用紫外分光光度计检验合格后，统一稀释至50.0～100.0ng/μL；利用分子标记SSR26引物对‘2018-009’组合45个杂交后代幼苗及亲本的DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳(方法同实施例1)。

结果如图7和图8所示，发现45个后代中与有香亲本A.‘Mystral’电泳带型一致的有29个。

接着对29个后代进行继续栽培，开花时通过鼻嗅法鉴定出有26个后代具有香气，结合形态学观测从26个有香后代中选出5个优良香型红掌后代，如图9所示，这些后代株型紧凑、叶色浓绿、花色靓丽、花高于叶、香气宜人，可以进一步快速繁殖形成株系，进行品种比较试验和多年多点实验。

综上，本发明通过转录组测序，引物开发和设计、多态性引物筛选、PCR扩增和凝胶电泳检测分析，建立了与红掌香气连锁的分子标记开发技术，获得了1个与红掌香气连锁的分子标记引物SSR26；通过SSR26标记辅助红掌香型后代选择，结合鼻嗅法鉴定建立了分子标记辅助红掌香气选择技术体系，能够筛选出优良的香型红掌后代。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。