抗SARS-CoV-2奥密克戎突变株XBB及其亚型感染的蛋白及疫苗

技术领域

本发明涉及抗SARS-CoV-2奥密克戎突变株XBB及其亚型感染的蛋白及疫苗，属于医药领域。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-Cov-2)是由世界卫生组织命名的一种新型的β属的冠状病毒。该病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别，是一种以前尚未在人类中发现的新冠状病毒分支。目前，变异新冠病毒主要有五大种类：Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron，Omicron变异株又分为BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.4、BA.5、BQ.1.1、XBB.1.5等几种亚系。

SARS-CoV-2的主要结构蛋白包括刺突蛋白(Spike，S)、信使蛋白(Envelop，E)、膜蛋白(Membrane，M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)，其中，S蛋白在病毒的感染和毒力中起着关键作用，常被用来作为疫苗的抗原。由于SARS-CoV-2变异株XBB含有多个突变位点，病毒的S蛋白也含有多个突变位点，导致变异株XBB及其亚型在一定程度上能够逃逸新冠病毒突变株(Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron)疫苗激发的抗体，导致新冠疫苗失效或保护力降低。因此，开发针对SARS-CoV-2病毒突变株XBB及其亚型的疫苗，特别对各变异的SARS-CoV-2病毒的广谱疫苗，对于新型冠状病毒感染的防治非常重要。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供抗SARS-CoV-2奥密克戎突变株XBB及其亚型感染的蛋白。本发明还提供用于预防和/或治疗SARS-CoV-2奥密克戎突变株XBB及其亚型感染的疫苗，包括含有所述蛋白的重组蛋白疫苗和腺病毒载体疫苗，还提供了含有两种疫苗的组合物或联合用药物。

本发明首先提供抗SARS-CoV-2奥密克戎突变株XBB及其亚型感染的蛋白，其含有选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.7中任意一项所示的氨基酸序列。优选地，所述蛋白选自如SEQ IDNo.3或SEQ ID No.5所示。

本发明还提供了所述蛋白的前体，其是在所述蛋白上连接了信号肽和/或蛋白标签。

优选地，所述的蛋白标签选自如下至少一种：组氨酸标签(6His标签)、硫氧还蛋白标签(Trx标签)、谷胱甘肽转移酶标签、泛素样修饰蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、c-Myc蛋白标签、Avi tag蛋白标签、氮源利用物质A蛋白标签。

进一步地，在所述抗SARS-CoV-2奥密克戎突变株XBB及其亚型感染的蛋白上还连接了切除蛋白标签的蛋白酶识别区。

优选地，所述的蛋白酶选自如下至少一种：肠激酶(EK酶)、TEV蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、羧肽酶A、鼻病毒3c蛋白酶。

进一步地，所述前体的氨基酸序列选自SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20中至少一种。优选地，所述蛋白序列选自如SEQ ID No.12或SEQ ID No.16所示。

本发明还提供了多核苷酸，其编码所述的蛋白或所述的前体。

进一步地，所述核苷酸序列选自SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQIDNo.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21中至少一种。优选地，所述多核苷酸序列选自如SEQ ID No.13或SEQ ID No.17所示。

本发明还提供了重组载体，其含有所述的多核苷酸。

进一步地，所述重组载体采用昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种。

优选地，所述的昆虫杆状病毒表达载体为pFastBac1。

优选地，所述的大肠杆菌表达载体为pET32a。

优选地，所述的酵母表达载体为pPICZaA。

优选地，所述的哺乳动物细胞表达载体为CHO细胞表达载体。

进一步优选地，所述的CHO细胞表达载体为pTT5或FTP-002。

本发明还提供了宿主细胞，其含有所述的重组载体。

进一步地，所述的宿主细胞采用昆虫细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母中至少一种。

优选地，所述的昆虫细胞选自sf9细胞、sf21细胞、Hi5细胞中至少一种。

优选地，所述的哺乳动物细胞为CHO细胞。

本发明还提供了所述的蛋白或所述的前体的制备方法，其特征是：包括如下步骤：培养所述的宿主细胞，使其表达所述的蛋白或前体，然后回收所述的蛋白，即得。

本发明还提供了抗SARS-CoV-2奥密克戎突变株及其亚型感染的蛋白组合物，其包括BA.5序列-1、BA.5序列-2、XBB.1.5序列-1、XBB.1.5序列-2、XBB.1.5序列-3、XBB.1.5序列-4、S-XBB.1.5蛋白中任意两种及以上的组合。

优选地，所述蛋白组合物包括BA.5序列-1、BA.5序列-2中的一种、XBB.1.5序列-1、XBB.1.5序列-2、XBB.1.5序列-3、XBB.1.5序列-4中的任意一种、S-XBB.1.5蛋白至少两种组合。

更优选地，所述蛋白组合物包括BA.5序列-1、BA.5序列-2中的一种、XBB.1.5序列-3、XBB.1.5序列-4中的任意一种与S-XBB.1.5蛋白进行的组合。

本发明还提供了预防和/或治疗SARS-CoV-2奥密克戎突变株及其亚型感染的重组蛋白疫苗，其含有所述的蛋白、所述的前体和/或所述的蛋白组合物，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。

进一步地，所述的辅助性成分为免疫佐剂。

优选地，所述的免疫佐剂选自如下至少一种：鲨烯水包油乳剂、铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、细菌毒素、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料。

进一步地，满足以下至少一项：所述的鲨烯水包油乳剂为MF59；

所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种；

所述的钙盐为磷酸三钙；

所述的植物皂苷为QS-21或ISCOM；

所述的植物多糖为黄芪多糖；

所述的细菌毒素选自重组霍乱毒素、白喉毒素中至少一种；

所述的脂质选自如下至少一种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺；

所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种：(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺、阳离子胆固醇、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、CpG ODN。

本发明还提供了抗SARS-CoV-2奥密克戎突变株XBB及其亚型感染的腺病毒载体疫苗，其构建含有编码所述蛋白、所述前体或所述蛋白组合物的氨基酸序列的多核苷酸的重组载体。

优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列选自SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21中至少一种。更优选地，所述腺病毒载体含有的多核苷酸序列选自构建S-XBB.1.5的多核苷酸，如SEQ ID No.21所示。

进一步地，所述腺病毒载体选自如下至少一种：腺病毒、安卡拉痘苗病毒、腺相关病毒。

优选地，选自人5型、35型或26型或/和黑猩猩AdC68型或AdC7型的复制缺陷型腺病毒。

更优选地，选自E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒。

本发明提供了所述腺病毒载体疫苗中的腺病毒的制备方法，包括以下步骤：构建所述多核苷酸的穿梭质粒载体；然后将构建的穿梭质粒载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞，培养宿主细胞；获得复制缺陷重组腺病毒，然后扩大培养、纯化，即可。

进一步的，所述腺病毒载体疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。

进一步地，所述重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗为皮内或皮下注射制剂、肌肉注射制剂、静脉注射制剂、口服或鼻喷制剂。

优选地，所述的疫苗为肌肉注射制剂和鼻喷制剂。

本发明还提供了治疗和/或预防SARS-CoV-2奥密克戎突变株及其亚型感染的组合物，是含有所述的重组蛋白疫苗和所述的腺病毒载体疫苗为活性成分的复方制剂。

本发明提供了抗SARS-CoV-2奥密克戎突变株XBB及其亚型感染的联合用药物，其含有分别或同时给药的所述的重组蛋白疫苗和所述的腺病毒载体疫苗。

优选地，所述组合物或联合用药物是重组蛋白疫苗1、重组蛋白疫苗2和腺病毒载体疫苗的组合或联合用药。

更优选地，所述重组蛋白疫苗1含有BA.5序列-1、BA.5序列-2蛋白或前体中至少一种的氨基酸序列；所述重组蛋白疫苗2含有XBB.1.5序列-1、XBB.1.5序列-2、XBB.1.5序列-3、XBB.1.5序列-4蛋白或前体中的至少一种氨基酸序列；所述腺病毒载体疫苗含有S-XBB.1.5的多核苷酸序列。

进一步地，所述重组蛋白疫苗1含有的氨基酸序列选自SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10中至少一种。

进一步地，重组蛋白疫苗2含有的氨基酸序列选自SEQ ID No.3～SEQ ID No.6、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18中至少一种。优选地，选自SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18中至少一种。

进一步地，所述腺病毒载体疫苗含有如SEQ ID No.21所示的多核苷酸序列。

进一步地，所述组合物或联合用药物为皮内或皮下注射制剂、肌肉注射制剂、静脉注射制剂、口服或鼻喷制剂；优选地，所述的疫苗为肌肉注射制剂和鼻喷制剂。

本发明还提供了所述的蛋白、所述的前体、所述的蛋白组合物、所述的重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、所述的疫苗组合物或联合用药物在制备治疗和/或预防SARS-CoV-2奥密克戎突变株及其亚型感染或致病的药物中的用途。

本发明还提供了治疗和/或预防SARS-CoV-2奥密克戎突变株及其亚型感染的疫苗组合物，其含有重组蛋白疫苗和腺病毒载体疫苗；所述重组蛋白疫苗的氨基酸序列选自SEQIDNo.1～SEQ ID No.7、SEQ ID No.8～SEQ ID No.20中至少一种；所述腺病毒载体疫苗的抗原的核苷酸序列选自SEQ ID No.23。

本发明还提供了治疗和/或预防SARS-CoV-2奥密克戎突变株及其亚型感染的联合用药物，其分别或同时给药上述的重组蛋白疫苗和腺病毒载体疫苗；所述重组蛋白疫苗的氨基酸序列选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.7、SEQ ID No.8～SEQ ID No.20中至少一种；所述腺病毒载体疫苗的抗原的核苷酸序列选自SEQ ID No.23。

以下序列是申请人基于SARS-CoV-2突变体Omicron变异株BA.5、XBB及亚系XBB.1.5的S蛋白中的RBD序列优化后构建的序列，其构建的蛋白或前体分别定义为BA.5序列-1、BA.5序列-2、XBB.1.5序列-1、XBB.1.5序列-2、XBB.1.5序列-3、XBB.1.5序列-4、S-XBB.1.5蛋白或前体。

SEQ ID No.1BA.5序列-1

VQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGVNCYFPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL

SEQ ID No.2BA.5序列-2

VQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGVNCYFPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL

SEQ ID No.3XBB.1.5序列-1

VQPTESIVRFPNITNLCPFHEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVIYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKPSGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGPNCYSPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

SEQ ID No.4XBB.1.5序列-2

VQPTESIVRFPNITNLCPFHEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVIYNSASFSAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKPSGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGPNCYSPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

SEQ ID No.5XBB.1.5序列-3

VQPTESIVRFPNITNLCPFHEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVIYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKPSGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGPNCYSPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL

SEQ ID No.6XBB.1.5序列-4

VQPTESIVRFPNITNLCPFHEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVIYNSASFSAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKPSGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGPNCYSPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL

SEQ ID No.7S-XBB.1.5

VNLITRTQSYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPALPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYQKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKEGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLERDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPVDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFHEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVIYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKPSGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGPNCYSPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEYVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTKSHRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLKRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKYFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNHNAQALNTLVKQLSSKFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

为了能够辅助蛋白的分泌表达，在构建蛋白时，在其氨基酸上添加了信号肽，以辅助蛋白的分泌表达。同时，为了方便纯化，还在蛋白的氨基酸序列添加了His标签。本发明完整的BA.5序列-1、BA.5序列-2、XBB.1.5序列-1、XBB.1.5序列-2、XBB.1.5序列-3、XBB.1.5序列-4、S-XBB.1.5氨基酸序列分别如SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQIDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20所示。

进一步地，其对应的编码其氨基酸序列的核苷酸序列分别如SEQ ID No.9、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21所示。

SEQ ID No.8完整的BA.5序列-1信号肽-Trx标签-6His标签-EK酶切位点-RBD序列-HR1序列-HR2序列

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDSIVVLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGVNCYFPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL

SEQ ID No.9编码SEQ ID No.8的核苷酸序列

ATGCTGCTGGTGAACCAGAGCCACCAGGGTTTCAACAAGGAACACACTAGCAAGATGGTGTCTGCTATCGTCCTCTACGTGCTGCTCGCCGCCGCTGCTCACTCAGCTTTCGCCGCTGACTCTATCCACATCAAGGACTCCGACGACCTCAAGAACCGTTTGGCCGAAGCCGGCGACAAGCTGGTCGTTATCGACTTCATGGCTACCTGGTGTGGCCCTTGCAAGATGATCGGACCTAAGCTGGACGAAATGGCTAACGAGATGAGCGACAGCATCGTCGTTCTGAAGGTGGACGTCGACGAATGTGAGGACATCGCCACTGAGTACAACATCAACAGCATGCCTACCTTCGTTTTCGTGAAGAACTCTAAGAAGATCGAGGAGTTCTCTGGTGCCAACGTGGACAAGCTCCGTAACACCATCATCAAGCTCAAGCTGGCCGGCAGCGGTAGCGGTCACATGCACCACCACCACCACCATTCAAGCGGCGACGACGACGACAAGGTGCAGCCAACCGAATCAATCGTCCGCTTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCATTCGACGAGGTGTTCAACGCCACCCGTTTCGCCTCTGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGCATCTCCAACTGTGTCGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACTTCGCTCCTTTCTTCGCATTCAAGTGTTACGGAGTGTCCCCTACCAAGCTCAACGATTTGTGCTTCACAAACGTGTACGCTGACAGCTTCGTGATCCGTGGTAACGAGGTTTCTCAAATCGCCCCTGGTCAGACAGGTAACATCGCTGACTACAACTACAAGCTCCCAGACGACTTCACTGGCTGTGTTATCGCTTGGAACTCAAACAAGCTGGACTCTAAGGTGGGTGGTAACTACAACTACCGGTACCGTCTGTTCCGCAAGAGCAACCTCAAGCCATTCGAACGTGACATCAGCACAGAGATCTACCAAGCCGGTAACAAGCCCTGCAACGGCGTTGCCGGAGTCAACTGCTACTTCCCCCTCCAGTCCTACGGATTCCGCCCAACCTACGGCGTGGGTCACCAGCCATACCGCGTGGTTGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCACGCCCCCGCTACCGTGTGTGGCCCTAAGAAGAGCACTAACCTCGTTAAGAACAAGTCCGTGAACTTCAACTTCAACGGTCTCTACGAAAACCAGAAGCTGATCGCTAACCAGTTCAACTCCGCCATCGGCAAGATCCAGGACTCCCTGTCCTCCACAGCTTCCGCTCTGGGCAAGCTGCAGGACGTTGTGAACCAAAACGCTCAGGCCCTGAACACACTGGTGAAGCAACTGAAGAACCACACCAGCCCCGACGTTGACCTGGGTGACATCAGCGGTATCAACGCTAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAACGAAGTGGCTAAGAACTTGAACGAGAGCCTCATCGACCTGCAGGAACTGTAA

SEQ ID No.10完整的BA.5序列-2信号肽-Trx标签-6His标签-EK酶切位点-RBD序列-HR1序列-HR2序列

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDSIVVLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGVNCYFPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL

SEQ ID No.11编码SEQ ID No.10的核苷酸序列

ATGCTGCTGGTGAACCAGAGCCACCAGGGTTTCAACAAGGAACACACTAGCAAGATGGTGTCTGCTATCGTCCTCTACGTGCTGCTCGCCGCCGCTGCTCACTCAGCTTTCGCCGCTGACTCTATCCACATCAAGGACTCCGACGACCTCAAGAACCGTTTGGCCGAAGCCGGCGACAAGCTGGTCGTTATCGACTTCATGGCTACCTGGTGTGGCCCTTGCAAGATGATCGGACCTAAGCTGGACGAAATGGCTAACGAGATGAGCGACAGCATCGTCGTTCTGAAGGTGGACGTCGACGAATGTGAGGACATCGCCACTGAGTACAACATCAACAGCATGCCTACCTTCGTTTTCGTGAAGAACTCTAAGAAGATCGAGGAGTTCTCTGGTGCCAACGTGGACAAGCTCCGTAACACCATCATCAAGCTCAAGCTGGCCGGCAGCGGTAGCGGTCACATGCACCACCACCACCACCATTCAAGCGGCGACGACGACGACAAGGTGCAGCCAACCGAATCAATCGTCCGCTTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCATTCGACGAGGTGTTCAACGCCACCCGTTTCGCCTCTGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGCATCTCCAACTGTGTCGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACTCAGCTTCATTCTCAGCATTCAAGTGTTACGGAGTGTCCCCTACCAAGCTCAACGATTTGTGCTTCACAAACGTGTACGCTGACAGCTTCGTGATCCGTGGTAACGAGGTTTCTCAAATCGCCCCTGGTCAGACAGGTAACATCGCTGACTACAACTACAAGCTCCCAGACGACTTCACTGGCTGTGTTATCGCTTGGAACTCAAACAAGCTGGACTCTAAGGTGGGTGGTAACTACAACTACCGGTACCGTCTGTTCCGCAAGAGCAACCTCAAGCCATTCGAACGTGACATCAGCACAGAGATCTACCAAGCCGGTAACAAGCCCTGCAACGGCGTTGCCGGAGTCAACTGCTACTTCCCCCTCCAGTCCTACGGATTCCGCCCAACCTACGGCGTGGGTCACCAGCCATACCGCGTGGTTGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCACGCCCCCGCTACCGTGTGTGGCCCTAAGAAGAGCACTAACCTCGTTAAGAACAAGTCCGTGAACTTCAACTTCAACGGTCTCTACGAAAACCAGAAGCTGATCGCTAACCAGTTCAACTCCGCCATCGGCAAGATCCAGGACTCCCTGTCCTCCACAGCTTCCGCTCTGGGCAAGCTGCAGGACGTTGTGAACCAAAACGCTCAGGCCCTGAACACACTGGTGAAGCAACTGAAGAACCACACCAGCCCCGACGTTGACCTGGGTGACATCAGCGGTATCAACGCTAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAACGAAGTGGCTAAGAACTTGAACGAGAGCCTCATCGACCTGCAGGAACTGTAA

SEQ ID No.12完整的XBB.1.5序列-1信号肽-Trx标签-6His标签-EK酶切位点-RBD序列

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDCIVVLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFHEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVIYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKPSGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGPNCYSPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

SEQ ID No.13编码SEQ ID No.12的核苷酸序列

ATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGTTTCAACAAGGAACACACCAGCAAGATGGTGAGCGCTATCGTGCTGTACGTCCTGCTGGCCGCTGCTGCTCACAGCGCTTTCGCTGCTGACTCCATCCACATCAAGGACAGCGACGACCTGAAGAACCGTCTGGCCGAGGCCGGTGACAAGCTGGTCGTCATCGACTTCATGGCCACTTGGTGCGGTCCTTGCAAGATGATCGGCCCTAAGCTGGACGAGATGGCTAACGAGATGTCCGACTGCATCGTGGTCCTGAAGGTGGACGTCGACGAGTGCGAGGACATCGCCACCGAATACAACATCAACAGCATGCCCACCTTCGTGTTCGTGAAGAACAGCAAGAAGATCGAGGAATTTTCCGGCGCTAACGTCGACAAGCTGCGTAACACCATCATCAAGCTGAAGCTGGCCGGCTCCGGCTCCGGCCACATGCATCACCACCACCACCATTCCTCCGGTGACGACGACGACAAGGTGCAGCCAACCGAATCTATCGTCAGATTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCTTTCCACGAGGTGTTCAACGCTACCACTTTCGCCAGCGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGTATCAGCAACTGCGTCGCCGACTACTCTGTGATCTACAACTTCGCTCCTTTCTTCGCTTTCAAGTGCTACGGCGTGTCACCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACTAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGAAACGAAGTCTCTCAGATCGCTCCTGGACAGACCGGAAATATCGCTGACTACAACTACAAGCTGCCAGACGACTTCACTGGCTGCGTGATCGCTTGGAACTCAAACAAGCTGGACTCCAAGCCTTCTGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGAAAGTCAAAGCTGAAGCCTTTCGAGCGCGACATCTCAACCGAAATCTACCAGGCTGGTAATAAGCCCTGCAACGGTGTGGCTGGCCCTAACTGCTACTCTCCCCTGCAGTCCTACGGTTTCCGTCCAACCTACGGAGTCGGTCATCAGCCTTACCGTGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAACTGCTCCACGCTCCTGCTACTGTGTGCGGTCCCAAGAAGTCTACTAACCTGGTCAAAAACAAATGTGTCAACTTCAACTTCAACGGTTAA

SEQ ID No.14完整的XBB.1.5序列-2信号肽-Trx标签-6His标签-EK酶切位点-RBD序列

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDCIVVLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFHEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVIYNSASFSAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKPSGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGPNCYSPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

SEQ ID No.15编码SEQ ID No.14的核苷酸序列

ATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGTTTCAACAAGGAACACACCAGCAAGATGGTGAGCGCTATCGTGCTGTACGTCCTGCTGGCCGCTGCTGCTCACAGCGCTTTCGCTGCTGACTCCATCCACATCAAGGACAGCGACGACCTGAAGAACCGTCTGGCCGAGGCCGGTGACAAGCTGGTCGTCATCGACTTCATGGCCACTTGGTGCGGTCCTTGCAAGATGATCGGCCCTAAGCTGGACGAGATGGCTAACGAGATGTCCGACTGCATCGTGGTCCTGAAGGTGGACGTCGACGAGTGCGAGGACATCGCCACCGAATACAACATCAACAGCATGCCCACCTTCGTGTTCGTGAAGAACAGCAAGAAGATCGAGGAATTTTCCGGCGCTAACGTCGACAAGCTGCGTAACACCATCATCAAGCTGAAGCTGGCCGGCTCCGGCTCCGGCCACATGCATCACCACCACCACCATTCCTCCGGTGACGACGACGACAAGGTGCAGCCAACCGAATCTATCGTCAGATTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCTTTCCACGAGGTGTTCAACGCTACCACTTTCGCCAGCGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGTATCAGCAACTGCGTCGCCGACTACTCTGTGATCTACAACTCCGCTAGCTTCTCTGCTTTCAAGTGCTACGGCGTGTCACCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACTAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGAAACGAAGTCTCTCAGATCGCTCCTGGACAGACCGGAAATATCGCTGACTACAACTACAAGCTGCCAGACGACTTCACTGGCTGCGTGATCGCTTGGAACTCAAACAAGCTGGACTCCAAGCCTTCTGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGAAAGTCAAAGCTGAAGCCTTTCGAGCGCGACATCTCAACCGAAATCTACCAGGCTGGTAATAAGCCCTGCAACGGTGTGGCTGGCCCTAACTGCTACTCTCCCCTGCAGTCCTACGGTTTCCGTCCAACCTACGGAGTCGGTCATCAGCCTTACCGTGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAACTGCTCCACGCTCCTGCTACTGTGTGCGGTCCCAAGAAGTCTACTAACCTGGTCAAAAACAAATGTGTCAACTTCAACTTCAACGGTTAA

SEQ ID No.16完整的XBB.1.5序列-3信号肽-Trx标签-6His标签-EK酶切位点-RBD序列-HR1序列-HR2序列

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDSIVVLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFHEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVIYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKPSGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGPNCYSPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL

SEQ ID No.17编码SEQ ID No.16的核苷酸序列

ATGCTGCTGGTGAACCAGAGCCACCAGGGTTTCAACAAGGAACACACTAGCAAGATGGTGTCTGCTATCGTCCTCTACGTGCTGCTCGCCGCCGCTGCTCACTCAGCTTTCGCCGCTGACTCTATCCACATCAAGGACTCCGACGACCTCAAGAACCGTTTGGCCGAAGCCGGCGACAAGCTGGTCGTTATCGACTTCATGGCTACCTGGTGTGGCCCTTGCAAGATGATCGGACCTAAGCTGGACGAAATGGCTAACGAGATGAGCGACAGCATCGTCGTTCTGAAGGTGGACGTCGACGAATGTGAGGACATCGCCACTGAGTACAACATCAACAGCATGCCTACCTTCGTTTTCGTGAAGAACTCTAAGAAGATCGAGGAGTTCTCTGGTGCCAACGTGGACAAGCTCCGTAACACCATCATCAAGCTCAAGCTGGCCGGCAGCGGTAGCGGTCACATGCACCACCACCACCACCATTCAAGCGGCGACGACGACGACAAGGTGCAGCCAACCGAATCAATCGTCCGCTTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCATTCCACGAGGTGTTCAACGCCACCACTTTCGCCTCTGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGCATCTCCAACTGTGTCGCCGACTACAGCGTGATATACAACTTCGCTCCTTTCTTCGCATTCAAGTGTTACGGAGTGTCCCCTACCAAGCTCAACGATTTGTGCTTCACAAACGTGTACGCTGACAGCTTCGTGATCCGTGGTAACGAGGTTTCTCAAATCGCCCCTGGTCAGACAGGTAACATCGCTGACTACAACTACAAGCTCCCAGACGACTTCACTGGCTGTGTTATCGCTTGGAACTCAAACAAGCTGGACTCTAAGCCGTCTGGTAACTACAACTACCTCTACCGTCTGTTCCGCAAGAGCAAGCTCAAGCCATTCGAACGTGACATCAGCACAGAGATCTACCAAGCCGGTAACAAGCCCTGCAACGGCGTTGCCGGACCTAACTGCTACTCTCCCCTCCAGTCCTACGGATTCCGCCCAACCTACGGCGTGGGTCACCAGCCATACCGCGTGGTTGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCACGCCCCCGCTACCGTGTGTGGCCCTAAGAAGAGCACTAACCTCGTTAAGAACAAGTCCGTGAACTTCAACTTCAACGGTCTCTACGAAAACCAGAAGCTGATCGCTAACCAGTTCAACTCCGCCATCGGCAAGATCCAGGACTCCCTGTCCTCCACAGCTTCCGCTCTGGGCAAGCTGCAGGACGTTGTGAACCAAAACGCTCAGGCCCTGAACACACTGGTGAAGCAACTGAAGAACCACACCAGCCCCGACGTTGACCTGGGTGACATCAGCGGTATCAACGCTAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAACGAAGTGGCTAAGAACTTGAACGAGAGCCTCATCGACCTGCAGGAACTGTAA

SEQ ID No.18完整的XBB.1.5序列-4信号肽-Trx标签-6His标签-EK酶切位点-RBD序列-HR1序列-HR2序列

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDSIVVLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFHEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVIYNSASFSAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKPSGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGPNCYSPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL

SEQ ID No.19编码SEQ ID No.18的核苷酸序列

ATGCTGCTGGTGAACCAGAGCCACCAGGGTTTCAACAAGGAACACACTAGCAAGATGGTGTCTGCTATCGTCCTCTACGTGCTGCTCGCCGCCGCTGCTCACTCAGCTTTCGCCGCTGACTCTATCCACATCAAGGACTCCGACGACCTCAAGAACCGTTTGGCCGAAGCCGGCGACAAGCTGGTCGTTATCGACTTCATGGCTACCTGGTGTGGCCCTTGCAAGATGATCGGACCTAAGCTGGACGAAATGGCTAACGAGATGAGCGACAGCATCGTCGTTCTGAAGGTGGACGTCGACGAATGTGAGGACATCGCCACTGAGTACAACATCAACAGCATGCCTACCTTCGTTTTCGTGAAGAACTCTAAGAAGATCGAGGAGTTCTCTGGTGCCAACGTGGACAAGCTCCGTAACACCATCATCAAGCTCAAGCTGGCCGGCAGCGGTAGCGGTCACATGCACCACCACCACCACCATTCAAGCGGCGACGACGACGACAAGGTGCAGCCAACCGAATCAATCGTCCGCTTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCATTCCACGAGGTGTTCAACGCCACCACTTTCGCCTCTGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGCATCTCCAACTGTGTCGCCGACTACAGCGTGATATACAACTCCGCTTCTTTCTCTGCATTCAAGTGTTACGGAGTGTCCCCTACCAAGCTCAACGATTTGTGCTTCACAAACGTGTACGCTGACAGCTTCGTGATCCGTGGTAACGAGGTTTCTCAAATCGCCCCTGGTCAGACAGGTAACATCGCTGACTACAACTACAAGCTCCCAGACGACTTCACTGGCTGTGTTATCGCTTGGAACTCAAACAAGCTGGACTCTAAGCCGTCTGGTAACTACAACTACCTCTACCGTCTGTTCCGCAAGAGCAAGCTCAAGCCATTCGAACGTGACATCAGCACAGAGATCTACCAAGCCGGTAACAAGCCCTGCAACGGCGTTGCCGGACCTAACTGCTACTCTCCCCTCCAGTCCTACGGATTCCGCCCAACCTACGGCGTGGGTCACCAGCCATACCGCGTGGTTGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCACGCCCCCGCTACCGTGTGTGGCCCTAAGAAGAGCACTAACCTCGTTAAGAACAAGTCCGTGAACTTCAACTTCAACGGTCTCTACGAAAACCAGAAGCTGATCGCTAACCAGTTCAACTCCGCCATCGGCAAGATCCAGGACTCCCTGTCCTCCACAGCTTCCGCTCTGGGCAAGCTGCAGGACGTTGTGAACCAAAACGCTCAGGCCCTGAACACACTGGTGAAGCAACTGAAGAACCACACCAGCCCCGACGTTGACCTGGGTGACATCAGCGGTATCAACGCTAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAACGAAGTGGCTAAGAACTTGAACGAGAGCCTCATCGACCTGCAGGAACTGTAA

SEQ ID No.20完整的S-XBB.1.5氨基酸序列，Ad5

SEQ ID No.21编码SEQ ID No.20的核苷酸序列，Ad5

TTCCTGGACGTGTATCAGAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGAGTTCAGAGTGT

ACAGCAGCGCTAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAACCCTTCCTGATGGACCTG

GAGGGCAAGGAGGGCAACTTCAAGAACCTCAGAGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACG

GCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCCATCAACCTGGAGAGAGACCTGCCCCAA

GGCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAACATCACAAGATT

TCAGACCCTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTATCTGACACCTGTGGACAGCAGCAGCGGC

TGGACAGCTGGGGCCGCTGCCTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCCTGCT

GAAGTACAACGAGAACGGCACAATCACCGATGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCCCTG

AGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTATCAGACAA

GCAACTTCAGAGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGATTCCCCAACATCACCAACCTG

TGCCCCTTCCACGAGGTGTTCAACGCCACCACCTTCGCTAGCGTGTACGCTTGGAACAG

AAAAAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGATCTACAACTTCGCCCCCTTCT

TCGCCTTCAAGTGCTACGGGGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAAC

GTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGAGGCAACGAGGTGAGCCAAATCGCCCCTGGGC

AGACCGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGT

GATCGCCTGGAACAGCAACAAGCTGGACAGCAAACCTAGCGGCAACTACAACTACCTG

TACAGACTGTTCAGAAAGAGCAAGCTGAAGCCCTTCGAGAGAGACATCAGCACCGAGA

TCTACCAAGCCGGCAACAAGCCCTGCAACGGCGTGGCCGGCCCCAACTGCTACAGCCC

CCTGCAGAGCTACGGCTTCAGACCCACCTACGGCGTGGGCCATCAGCCCTACAGAGTGG

TCGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGAG

CACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTCACCGGCACC

GGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCAGAGACA

TCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGAGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCAC

CCCCTGTAGCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACAAGCAACCAA

GTGGCCGTGCTGTACCAAGGCGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCATCCACGCCG

ATCAGCTGACCCCCACCTGGAGAGTCTACTCCACCGGCAGCAACGTGTTTCAGACAAG

AGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGTACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACATCCCCA

TCGGCGCCGGCATCTGCGCTAGCTATCAGACACAGACCAAGAGCCACGGCAGCGCTAG

CAGCGTGGCTAGCCAAAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGC

GTGGCCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCAC

CGAGATCCTGCCCGTCAGCATGACCAAGACAAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCG

GCGACAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTCCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACACAGCT

GAAGAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAAGACAAGAACACCCAAGAGGTGTT

CGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGTACTTCGGCGGCTTCAACT

TCAGCCAAATCCTCCCCGACCCCTCCAAACCTAGCAAGAGAAGCTTCATCGAGGACCTG

CTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGACTGCCT

GGGCGATATCGCCGCTAGAGACCTGATCTGCGCTCAGAAGTTCAATGGCCTGACCGTGC

TGCCCCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTATACAAGCGCTCTGCTCGCTGGC

ACCATTACAAGCGGGTGGACCTTCGGCGCTGGCGCTGCCCTGCAGATCCCCTTCGCCAT

GCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACACAGAACGTGCTGTACGAGAATC

AGAAGCTGATCGCCAATCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAAGACAGCCTGAG

CAGCACCGCTAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAAGACGTGGTGAACCACAACGCCCAAGCC

CTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAAGTTCGGCGCCATCAGCAGCGTGCTCA

ACGACATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATCGATAGACTGATC

ACCGGCAGACTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGAGCCGCCG

AGATCAGAGCTAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGGCA

GAGCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGC

GCCCCCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAAGAGAAGAACT

TCACCACAGCCCCCGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGAGAGGGCGT

GTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGAGAAACTTCTACGAGCCTCAG

ATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGT

GAATAATACCGTGTACGACCCCCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAGGAGGAGCTG

GACAAGTATTTCAAGAACCATACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGACATCAGCGGCAT

CAACGCTAGCGTGGTGAACATTCAGAAGGAAATCGACAGACTCAACGAGGTGGCCAAG

AACCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGTACATCA

AGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGTGA

CCATCATGCTGTGCTGCATGACAAGCTGCTGCAGCTGCCTGAAGGGCTGTTGCAGCTGC

GGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAG

CTGCACTACACCTGA

申请人发现，以Omicron变异株BA.5的S蛋白的全长基因，如SEQ ID No.23所示制备出的腺病毒疫苗，然后以Omicron变异株BA.5、XBB.1.5的S蛋白中的RBD序列或RBD-HR分别制备重组蛋白疫苗，将腺病毒疫苗和重组蛋白疫苗联用，对于SARS-CoV-2或其突变病毒引起的交叉感染也有较好的防治效果。

SEQ ID No.22完整的S-BA.5氨基酸序列，Ad5

MFVFLVLLPLVSSQCVNLITRTQSYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLGRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGVNCYFPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEYVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTKSHRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLKRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKYFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNHNAQALNTLVKQLSSKFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

SEQ ID No.23编码SEQ ID No.22的核苷酸序列，Ad5

CTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCCATCAACCTGGGCAGAGACCTGCCCCAAG

GCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATCGGCATCAACATCACAAGATTT

CAGACACTGCTCGCCCTGCACCGGAGCTACCTCACCCCTGGCGACAGCAGCTCCGGCT

GGACCGCTGGGGCTGCCGCCTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCCTGCTG

AAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCTGTGGACTGTGCCCTGGACCCCCTGA

GCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTATCAGACAAG

CAACTTCAGAGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGATTCCCCAACATCACCAACCTGT

GCCCCTTCGACGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTCGCTAGCGTGTACGCCTGGAACAGA

AAGAGAATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACTTCGCCCCCTTCTT

CGCCTTCAAATGCTACGGCGTCAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACG

TGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGAGGCAACGAGGTGAGCCAAATCGCCCCCGGGCA

GACCGGCAACATCGCCGACTATAACTACAAACTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGA

TCGCCTGGAACTCCAACAAGCTGGACAGCAAAGTGGGCGGCAACTACAACTACAGATA

CAGACTGTTCAGAAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGAGACATCAGCACCGAGATC

TACCAAGCCGGCAACAAGCCCTGCAACGGCGTGGCCGGCGTGAACTGCTACTTCCCCC

TGCAGAGCTACGGCTTCAGACCCACCTACGGCGTGGGCCATCAGCCCTACAGAGTGGTC

GTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCCAAGAAGAGCA

CCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGG

CGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCAGAGACATC

GCCGACACCACCGATGCTGTGAGAGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACCCC

TTGCAGCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACAAGCAACCAAGTG

GCCGTGCTGTACCAAGGCGTCAACTGCACAGAGGTGCCCGTGGCCATCCACGCCGATCA

GCTGACCCCCACCTGGAGAGTGTACTCCACCGGCAGCAACGTGTTTCAGACAAGAGCC

GGCTGCCTGATCGGCGCCGAGTACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGG

CGCCGGCATCTGCGCTAGCTATCAGACACAGACCAAGAGCCACAGAAGAGCTAGAAGC

GTGGCTAGCCAAAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGG

CCTACAGCAACAACAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACCGAG

ATCCTGCCTGTGAGCATGACCAAGACAAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGA

CAGCACCGAGTGCAGCAACCTGCTCCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACACAGCTGAAG

AGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAGCAAGACAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCC

AAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGTACTTCGGCGGCTTCAACTTCAGC

CAAATCCTGCCCGACCCTAGCAAGCCTAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTT

CAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGACTGCCTCGGC

GACATCGCTGCTAGAGACCTGATCTGCGCTCAGAAGTTCAACGGCCTCACAGTGCTGCC

CCCCCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTACACCTCCGCTCTGCTGGCCGGCACAA

TTACATCCGGCTGGACCTTCGGCGCCGGCGCCGCCCTGCAAATCCCCTTCGCCATGCAG

ATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACACAGAACGTGCTGTACGAGAATCAGAA

GCTGATCGCCAATCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAAGACAGCCTGAGCAGC

ACCGCTAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAAGACGTGGTGAACCACAACGCCCAAGCCCTGA

ACACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAAGTTCGGCGCCATCTCCTCCGTCCTGAACGA

CATCCTGAGCAGACTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATTGACAGACTGATTACCG

GCAGACTGCAGAGCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGAGAT

CAGAGCTAGCGCCAACCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGGCAGAGC

AAGAGAGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCCC

CCCACGGCGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCCCAAGAGAAGAACTTCAC

CACCGCTCCCGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGAGAGGGCGTGTTCG

TGAGCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGAGAAACTTCTACGAGCCTCAGATCATC

ACCACCGACAACACCTTCGTGAGCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTCAACA

ACACCGTGTACGACCCCCTGCAACCCGAGCTGGACAGCTTCAAGGAGGAGCTGGACAA

GTACTTTAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGGGACATCTCCGGCATCAAC

GCTAGCGTGGTGAACATTCAGAAGGAAATTGACAGACTGAATGAGGTGGCCAAGAACC

TGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGTACATCAAGTG

GCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGTGACCAT

CATGCTGTGCTGCATGACAAGCTGCTGCAGCTGTCTGAAGGGCTGCTGCTCCTGCGGCA

GCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGACAGCGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAGCTGC

ACTACACCTGA

有益效果：本发明首先是制备抗SARS-CoV-2及其变异株感染的重组蛋白疫苗，起主要作用的重组蛋白序列构建思路是基于SARS-CoV-2Omicron变异株BA.5、XBB.1.5的S蛋白中的RBD序列、RBD序列与SARS-CoV-2的S蛋白的七肽重复区HR1和HR2形成的重组序列进行蛋白构建的。同时，再添加相应的疫苗佐剂，能更好地帮助宿主抵抗Omicron变异株XBB及其亚型引起的交叉感染，对开发抗SARS-CoV-2奥密克戎突变株XBB及其亚型感染的重组蛋白疫苗具有重要的意义。

同时，本发明还基于SARS-CoV-2Omicron变异株BA.5、XBB.1.5的全长S蛋白的核苷酸序列进行重组腺病毒载体的构建，获得腺病毒载体疫苗，并将制备的不同的重组腺病毒载体疫苗与不同的重组蛋白疫苗两种或三种结合获得预防或治疗效果更好的抗SARS-CoV-2及其变异株感染的疫苗组合物，其制备为鼻喷试剂更利于抵抗SARS-CoV-2及其变异株感染。

附图说明

图1为实施例1中pFastBac1-GP67-Trx-His-EK-S-RBD(Omicron_XBB.1.5)-HR的设计图；

图2为实施例1中1～3#克隆PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；

图3为实施例1中重组bacmid的PCR鉴定1％琼脂糖凝胶电泳图；

图4为实施例1中重组杆状病毒包装及扩增流程图；

图5为实施例1中杆状病毒扩毒过程中的WB验证结果图；

图6为实施例1中杆状病毒感染后上清经Ni-亲和层析洗脱结果；

图7为实施例1中EK酶切样品验证酶切效果结果图；

图8为实施例1中EK酶切后经Ni-亲和层析填料纯化及SDS-PAGE鉴定图；

图9为实施例2中XBB.1.5腺病毒表达鉴定；

图10为实施例4中Ad5

图11为实施例4中Ad5

图12为实施例4中Ad5

图13为实施例4中Ad5

图14为实施例4中Ad5

图15为实施例5中RBD

图16为实施例5中RBD

图17为实施例5中RBD

图18为实施例5中Ad5

图19为实施例5中Ad5

图20为实施例5中Ad5

图21为实施例6中血清真病毒中和抗体；

图22为实施例7中小鼠免疫攻毒时间表；

图23为实施例7中小鼠咽拭子病毒载量；

图24为实施例7中病毒基因/亚基因RNA；

图25为实施例7中小鼠肺组织的组织病理学变化；

图26为实施例7中小鼠肺组织的组织病理学评分。

具体实施方式

术语缩写：

单磷酸脂质A(MPL)；鲨烯水包油乳剂(MF59)、重组霍乱毒素(rCTB)；黄芪多糖(APS)；磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺(DOTMA)、阳离子胆固醇(DC-Chol)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)、CpG ODN(含有非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心序列的核苷酸序列,人工合成的CpG)

本发明先基于SARS-CoV-2奥密克戎突变株BA.5、XBB.1.5的S蛋白中320-545位氨基酸序列，与七肽重复区1(HR1)、七肽重复区2(HR2)来设计抗SARS-CoV-2奥密克戎突变株XBB及其亚型感染的重组蛋白疫苗。

本发明还基于编码SARS-CoV-2奥密克戎突变株BA.5、XBB.1.5的全长S蛋白的核苷酸序列设计抗SARS-CoV-2奥密克戎突变株XBB及其亚型感染的重组腺病毒疫苗。

本发明还将制备的不同的重组蛋白疫苗和不同的重组腺病毒疫苗进行两者和三者组合，制备成二价和三价鼻喷制剂，通过针对SARS-CoV-2病毒的S蛋白，特别是通过阻断S蛋白的ACE2受体结合区，诱导体内产生抗体等免疫反应，阻断SARS-CoV-2的S蛋白与宿主细胞ACE2受体的结合，从而帮助宿主抵抗冠状病毒感染，尤其是对SARS-CoV-2或其突变病毒引起的交叉感染有较好的防治效果，例如SARS-CoV-2Omicron变异株及其亚系XBB.1.5寄亚型等引起的交叉感染。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1用昆虫杆状病毒系统表达制备重组蛋白(以S-RBD

1.S-RBD

因新冠病毒SARS-CoV-2的S蛋白为定位于膜上的蛋白，因此，为了保证模拟其分泌过程，我们在构建新冠病毒S-RBD(Omicron_XBB.1.5)-HR蛋白表达构建时，在蛋白的N-端加入了GP67的信号肽序列，以辅助蛋白的分泌表达，这一信号肽将在蛋白分泌的过程中自发被昆虫细胞所切除；同时，我们在GP67信号肽后加入了草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda，S.frugiperda)的硫氧还蛋白(Trx)标签用以辅助S-RBD(Omicron_XBB.1.5)-HR折叠，加入了6xhis标签用以帮助后续纯化，加入了EK酶酶切位点，用以切除Trx和6xhis标签。此蛋白表达构建设计，通过EK酶切，将能够移除所有非S-RBD(Omicron_XBB.1.5)-HR的冗余氨基酸。该表达构建设计的模式见图1。

GP67-Trx-His-EK-S-RBD(Omicron_XBB.1.5)的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，GP67-Trx-His-EK-S-RBD(Omicron_XBB.1.5)-HR的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，编码SEQ ID No.12、SEQ ID No.16的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13、SEQ ID No.17所示。

同样地，构建GP67-Trx-His-EK-S-RBD(Omicron_XBB.BA.5)-HR的氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示，编码其氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

上述序列的构建均是以S蛋白320-545位的RBD序列为基础，其中第52、54、56位氨基酸均分别为F、P、F。

2.重组质粒构建的鉴定

以SEQ ID No.16为编码片段，即XBB.1.5-3序列，将设计的编码片段克隆入pFastBac1载体质粒中，并通过菌液PCR鉴定。菌液PCR鉴定结果显示，所挑选的3个克隆中2#、3#克隆成功扩出GP67-Trx-His-EK-S-RBD(Omicron_XBB.1.5)-HR片段，见图2。

3.重组bacmid的鉴定

选择鉴定正确的pFastBac1-GP67-Trx-His-EK-S-RBD(Omicron_XBB.1.5)-HR重组克隆，提取重组质粒后，转化DH10B感受态细胞，并进行蓝白斑菌液PCR鉴定。菌液PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定结果见图3。白斑为发生重组的bacmid克隆，蓝斑为未发生重组的bacmid克隆。

4.重组杆状病毒的包装

将重组bacmid转染入sf9昆虫细胞中，5天后收获P0代重组杆状病毒。重组杆状病毒包装及杆状病毒扩增流程图见图4。

5.目的蛋白的表达验证

在上述杆状病毒的扩增过程中，同时伴随着目的蛋白的表达。而目的蛋白切除标签前，含有His标签，因此我们用Anti-His的WB实验，验证重组蛋白的表达情况。验证结果显示，在40KD～55KD Marker条带间均观察到一条明显的条带，大小与Trx-His-EK-S-RBD(Omicron_XBB.1.5)-HR蛋白大小吻合，表明杆状病毒扩增成功，目的蛋白也能够成功表达。检测结果见图5。

6.目的蛋白的纯化鉴定

以P0代重组杆状病毒感染sf9细胞，3天后收获细胞培养液，并通过Ni-亲和层析填料进行蛋白纯化的验证工作。结果见图6。目的蛋白主要在40mM和250mM咪唑下被洗脱，洗脱后可得到高纯度的目的蛋白。

7.EK酶切切除标签的验证

将目的蛋白洗脱液浓缩，并调整浓度为1mg/ml，加入EK酶，18℃酶切14h后，通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果见图7。显示EK酶能够将Trx-His-EK(EK酶切位点的氨基酸序列)标签从目的蛋白上切除。

8.切除的标签的去除验证

将EK酶切之后的样品，使用Ni-亲和层析填料反挂10min，样品流穿后，再使用250mM咪唑洗脱。将Trx-His-EK-S-RBD(Omicron_XBB.1.5)-HR蛋白(未切开的完整蛋白)、S-RBD(Omicron_XBB.1.5)-HR蛋白和被切下的Trx-His-EK标签分离开。结果见图8。结果显示，Trx-His-EK标签切除后，能够通过Ni-亲和层析填料反挂后续纯化手段去除，由此获得不含任何标签的S-RBD(Omicron_XBB.1.5)-HR蛋白。其蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

通过上述重组蛋白的构建方法基于SARS-CoV-2Omicron_BA.5、XBB.1.5的S蛋白RBD或SARS-CoV-2突变体的S蛋白RBD-HR氨基酸序列，申请人分别给出如SEQ ID No.8、SEQID No.12、SEQ ID No.16的蛋白构建设计，最终表达的蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQID No.3、SEQ ID No.5所示，并以表达的重组蛋白分别制备RBD

实施例2重组腺病毒疫苗的构建及制备

1.SARS-CoV-2Omicron_BA.5、Omicron_XBB.1.5S蛋白基因序列的优化和合成

根据

所述合成的SARS-CoV-2Omicron_BA.5、Omicron_XBB.1.5S蛋白基因如SEQ IDNo.23、SEQ ID No.21所示。

2.重组腺病毒新冠疫苗的包装

在基因合成过程中，将合成后的产物利用重组的克隆策略将S基因克隆至pDC316载体中，得穿梭质粒(pDC316-S)。将以上构建好的包含SARS-CoV-2Omicron_BA.5、Omicron_XBB.1.5变异株S基因的pDC316-S分别与AdMax腺病毒系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞进行重组腺病毒的包装。过程如下：

1)将8×10

2)第二天用高糖DMEM+2％FBS换液，将骨架质粒(pBHGlox_E1,3Cre)和穿梭质粒利用lipofectamine3000共转染HEK293A细胞。具体步骤为：每个转染孔取骨架质粒4μg，穿梭质粒2μg，用125μLOpti-MEM培养基进行稀释，然后加入12μL P3000试剂；另取一支1.5ml EP管，用125μL Opti-MEM培养基进行稀释7.5μL lipofectamine3000；将稀释的质粒和稀释的lipofectamine3000按1：1比例混合，室温孵育10-15分钟后加入细胞中，细胞继续培养，细胞长满后传代于25cm

3)收集出毒的细胞培养物，1200rpm离心3分钟，吸取含病毒的上清，细胞沉淀用1/10培养体积的含病毒上清重悬，置于-80℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融三次。3000rpm离心20分钟，收集含病毒的上清液并与前述的含病毒上清合并，此即为腺病毒疫苗的毒种。

4)取50μL疫苗候选株毒种液，加入2μL蛋白酶K，50℃消化30min释放病毒基因组，以此为模版PCR扩增S基因序列，PCR产物电泳胶回收后测序鉴定，PCR扩增的条件如下：

变性：95℃，10min；变性：95℃，10s；退火：64℃，30s；延伸：72℃，2min；延伸：72℃，5min；循环数，40次；PCR扩增的引物如下：

pDC516-F1：ACACGTCAATGGGAAGTGAAA(SEQ ID No.24)

pDC516-R1：GCTAGACGATCCAGACATGAT(SEQ ID No.25)

3.重组腺病毒新冠疫苗的扩增

经鉴定正确的重组腺病毒疫苗毒种在293细胞中逐级扩增。具体过程如下：按MOI＝10加入80％-90％长满的293细胞，待大部分细胞病毒变圆后，收集病毒培养物，按照上述反复冻融的方法，制备主病毒种子库和工作病毒种子库。利用细胞工厂或生物反应器规模化扩增重组腺病毒疫苗，细胞大部分病变后收集病毒培养物。生物反应器扩增细胞和病毒的过程如下：首先在生物反应器中加入3-5g/LCytodex1微载体后灭菌，然后生物反应器中加入细胞培养液，当运行条件稳定在37℃，pH 7.0，DO 50％，50rpm时，消化收集细胞工厂扩增的HEK293细胞，接种于生物反应器内，接种细胞密度1.0-5.0×10

4.重组腺病毒疫苗的纯化

收集的病毒利用氯化铯超速离心或离子交换层析的的方法纯化，具体过程如下：

(1)氯化铯超速离心纯化腺病毒疫苗

收集的病毒培养物1200g离心10分钟，吸取含病毒的培养上清，细胞沉淀用1/10培养体积的含病毒上清重悬，-80℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融三次，3000rpm离心10-20分钟，吸取上清。含病毒的培养上清用100K-300K超滤膜包浓缩10倍；配制1.4g/ml氯化铯溶液(53g氯化铯+87ml 10mM Tris-HCl，PH 7.9)和1.2g/ml氯化铯溶液(氯化铯26.8+92ml10mMTris-HCl，PH 7.9)；在超速管中缓慢加入8ml 1.4g/ml氯化铯溶液，然后轻缓地加入6ml1.2g/ml氯化铯溶液，最后在不连续梯度顶部加入20ml含病毒上清液，配平后100000×g，4℃离心90分钟；离心结束后注射器抽吸出蓝色的病毒带，透析去除氯化铯后保存在-80℃。

(2)离子交换层析纯化腺病毒

收集病毒培养物，用0.05％-1％ Tween 20 37℃裂解2-4小时，裂解的培养物经1.2μm和0.45μm囊式滤器过滤澄清，使用100-300kD分子量的切向流膜包将样品浓缩10倍，随后用10体积的滤洗缓冲液(50mM Tris–HCl，2mM MgCl2，0–500mM NaCl，pH 8.0)进行滤洗，收集滤洗样品；滤洗的样品中加加入核酸酶，终浓度为10-50U/ml，37℃消化1-3小时后，样品利用Q Sepharose XL、Source 30Q或Source 15Q等填料进行阴离子交换层析，具体过程如下：平衡缓冲液20ml/min流速平衡5个柱体积，平衡结束后10ml/min的流速上样，上样结束后，平衡缓冲液平衡至电导水平；线性梯度洗脱样品，洗脱的条件为100％低盐缓冲液到100％高盐缓冲液，10V洗脱柱体积，流速为10ml/min，收集各个洗脱峰；洗脱结束后用2MNaCl缓冲液对柱子进行再生5～10个柱体积，速度为20ml/min。收集病毒峰，随后洗脱的病毒样品经透析或切向流过滤进行缓冲液置换(缓冲液成10mM Tris、10mM Na-PO

纯化后的腺病毒直接灌装，-20℃避光保存。

5.重组腺病毒疫苗的鉴定

我们首先通过人复制缺陷Ad5腺病毒载体分别表达SARS-CoV-2突变株OmicronBA.5和Omicron XBB.1.5的全长刺突糖蛋白，通过免疫印迹Western blot的方法检测Ad5

其中，通过实施例1制备的腺病毒疫苗分别定义为Ad5

通过以下试验证明本发明制备的重组蛋白疫苗和腺病毒疫苗的效果。

实施例3动物准备及小鼠免疫和样品收集

1、6-8周龄的雌性NIH小鼠购买自维通利华公司，小鼠饲养在四川大学生物治疗国家重点实验室的无特殊病原体的环境中。将10μg重组蛋白和一定量的佐剂混合，于小鼠第0、14、28天肌肉免疫三次，10μg蛋白/只小鼠，三免后7天取血检测中和抗体，评价疫苗的免疫效果。

2、6-8周龄的雌性BALB/c小鼠购买自维通利华公司，小鼠饲养在四川大学生物治疗国家重点实验室的无特殊病原体的环境中。为了制备双组分鼻喷疫苗，将2.5×10

其他双组分疫苗Ad5

由5×10

实施例4酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体

为了检测抗新型冠状病毒RBD特异性IgG和IgA，96孔板(NUNC-MaxiSorp，ThermoFisher Scientific)在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中涂覆1μg/ml重组RBD蛋白，在4℃过夜。第二天，用含有0.1％吐温-20(PBST)的1×PBS洗涤平板三次，然后用含有1％BSA的PBST在室温下封闭1小时。将连续稀释的血清、气管-肺洗液或稀释缓冲液中的鼻拭子加入孔中(100μl/孔)。在37℃孵育1小时后，将平板洗涤三次，然后加入稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊-抗小鼠IgG(1:10000，southern biotech，Cat：0107-05)、HRP-缀合的山羊-抗小鼠IgA(1:5000)、HRP-缀合的山羊-抗兔IgG、HRP-缀合的山羊-抗兔IgG、HRP-缀合的山羊-抗人IgG(southern biotech，Cat：62-8420)或HRP-缀合的山羊-抗人IgA(southern biotech，Cat：2050-05)。然后，在37℃孵育1小时，进一步洗涤平板三次，并在室温下用3，3’，5，5’-四甲基联苯二胺(TMB)显影10分钟。用1M H

结果如图10-14所示，在完成免疫后，重组腺病毒Ad5联合重组RBD的制剂诱导出比单纯的Ad5腺病毒更强的血清和肺泡灌洗液抗RBD特异性的结合抗体，说明腺病毒联合重组亚单位制剂可以产生更强的体液免疫保护能力。此外，单纯的RBD滴鼻免疫无法诱导出强烈的血液结合抗体，但是与空载Ad5

实施例5新型冠状病毒假病毒中和试验

为了检测血清和BALF样品中中和抗体的滴度，如前所述进行假病毒中和试验。表达荧光素酶的假病毒，包括原型、δ和Omicron亚系(BA.2.75、BA.5、BF.7、BQ.1、BQ.1.1、XBB、XBB.1.5和XBB.1.16等)，购自Genomeditech公司。

简言之，将灭活的血清和BALF样本(56℃30分钟)稀释三倍，范围为30-65610，然后与等体积不同稀释度的假病毒在37℃孵育1小时。然后，在每个孔中加入1.2×10

中和度(％)＝(阳性样本-待测样本/阳性样本-阴性样本)×100％

如图15-16所示，单纯的蛋白疫苗(重组RBD

腺病毒联合重组RBD蛋白的双价苗制剂诱导出比单纯的腺病毒更强的血清和肺泡灌洗液中和抗体，说明腺病毒联合重组亚单位制剂可以产生更强的血液和黏膜局部的中和保护能力，阻止病毒的感染；如图18-20所示，Ad5

实施例6新型冠状病毒活病毒中和试验

通过真实的病毒中和试验进行来自接种Ad5

结果显示如图21所示，滴鼻Ad5

实施例7新型冠状病毒XBB.1.16变异体的攻击

在第0、28和56天，用三倍的Ad5

用Ad5

如图22-26所示，用Ad5