一种二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒及制备和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术，具体涉及一种二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，免疫治疗作为肿瘤治疗的新型方法，以其广谱抗肿瘤活性、低毒副作用、有效抑制肿瘤转移与复发、清除难以发现的微小病灶及显著延长患者中位生存期等优势迅速成为研究热点，在肿瘤临床治疗方面已取得巨大进展（Immunity, 2020, 52(1): 17-35.）。目前，肿瘤免疫疗法大多集中于增强T细胞应答，如免疫检查点抑制剂（Immunecheckpoint inhibitors，ICI）通过靶向程序性死亡受体1/程序性死亡受体配体1（Programmed death 1/programmed death ligand 1，PD-1/PD-L1）通路，调节肿瘤浸润淋巴细胞的功能（Nature Reviews Clinical Oncology, 2017, 14(4): 203-220.）；如通过基因工程修饰的特异性表达嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）的T细胞（Nature Reviews Clinical Oncology, 2020, 17(7): 418-434.），可直接靶向攻击肿瘤细胞，在临床上取得了良好的疗效，但由于单药ICI响应率低，肿瘤抗原差异性大等缺陷，只有少数癌症患者从这些疗法中受益。近年来，基于干扰素基因刺激因子（Stimulator ofinterferon genes，STING）信号通路的免疫疗法受到了广泛关注，其通过环鸟苷酸-腺苷酸合酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）识别细胞内DNA，生成第二信使环鸟苷-腺苷二核苷酸（cyclic GMP-AMP，cGAMP），进而激活内质网上的STING蛋白，促使Ⅰ型干扰素（Interferon，IFN）分泌并驱动强效的抗肿瘤免疫应答，对于多种肿瘤模型和提升抗肿瘤免疫响应率具有特殊的优势（Nature Reviews Immunology, 2021, 21(9): 548-569.）。然而内源性STING激动剂cGAMP因其成药性差，如分子量小、带负电、易降解等，导致常规载体难以负载、靶向效率低、细胞摄取能力弱。人工合成的小分子STING激动剂，如吖啶酮类（二甲苯吡酸）、氨基苯并咪唑类（diABZI）等，存在溶解性差、脱靶效应、毒副作用大等诸多缺陷（PLoS One, 2014, 9(6):e99988; Nature, 2018, 564(7736):439-443.）。尽管通过构建聚合物囊泡、脂质体等纳米制剂，可一定程度上提升STING激动剂的靶向性，但缺乏胞浆输送特性仍大幅限制了STING信号通路的激活效率。因此，如何实现STING信号通路的高效激活，显著提升免疫应答响应率，是肿瘤免疫治疗领域面临的关键问题。

光治疗是目前肿瘤治疗方法的重要组成。肿瘤治疗中的常用光敏剂吲哚菁绿（ICG）以光动力作用为主，兼具光热作用。它可在外部光源（近红外光）下将光能转化为热能来杀死癌细胞。其光动力治疗的核心是利用波长范围在650～1350 nm的近红外激光照射肿瘤部位，蓄积在肿瘤部位的光敏剂经近红外激光照射后吸收光子，从基态（S0）跃迁到单重激发态（S1）或通过系间穿越至三重激发态。位于单重激发态的分子不稳定，通过非辐射跃迁回到基态并放出热量，诱导肿瘤细胞凋亡，发挥光热治疗作用；或通过辐射跃迁回到基态并发出荧光，用于体内外示踪；三重激发态的光敏剂与基态氧发生直接能量转移，生成具有细胞杀伤作用的单线态氧，产生氧化应激破坏肿瘤细胞，发挥光动力治疗作用（ChemicalReviews, 2005, 105(6): 2647-2694.）。

研究表明，多种二价无机金属离子如Co

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒及其制备方法和应用。本发明采用新的技术思路，为一种低毒且非侵入的治疗方法。包载Mn

为达到发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒，包括二价无机金属离子、光敏剂和蛋白质；所述光敏剂为有机光敏剂；所述蛋白质为载体蛋白；进一步优选的，二价无机金属离子包括Mn

本发明公开了上述二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：将光敏剂溶液加入二价无机金属离子与蛋白质的混合液中，搅拌反应，得到二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒；进一步的，搅拌反应后纯化，得到二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒。优选的，先调节蛋白质溶液的酸碱度，再加入二价无机金属离子溶液，得到二价无机金属离子与蛋白质的混合液。

本发明中，所述二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒由二价无机金属离子、光敏剂和蛋白质组成，蛋白质包载二价无机金属离子和光敏剂，其粒径为5～30 nm，载药量为1%～20%；粒径为透射电镜粒径，载药量是指纯化后样品中，（二价无机金属离子或光敏剂）质量/（二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒）质量×100%。

本发明中，蛋白质参与二价无机金属离子和光敏剂纳米粒的形成；该纳米粒能够蓄积在肿瘤细胞溶酶体内，在光照后破坏溶酶体膜并应激损伤细胞核，发挥光动力治疗作用；尤其是，可实现Mn

此外，本发明纳米粒与其他采用生物矿化制备的氧化锰蛋白纳米粒相比，存在不同的技术思路。如Guo等制备的天然黑色素/MnOx纳米杂化纳米粒，尺寸为125~158 nm；又如Xu等制备的MnO

本发明采用蛋白质作为载体，具体的，将二价无机金属离子溶液与蛋白质溶液混合使离子进入蛋白质的内部空腔，加入光敏剂，使两者在蛋白质内腔中持续生长，实现二价无机金属离子和光敏剂在蛋白质中的包载并维持二价态的稳定，从而制得二价无机金属离子和光敏剂蛋白纳米粒，有效解决了目前认为STING激动剂难以负载，缺乏胞浆传输的特性以及STING激活效率低下等难题。本发明提供的二价无机金属离子和光敏剂蛋白纳米粒具有良好肿瘤靶向性，促进了Mn

本发明中，采用氢氧化钠溶液、盐酸溶液将蛋白质溶液的酸碱度调节至pH为6～7；所述蛋白质溶液为蛋白质水溶液，浓度为2～20 mg mL

本发明中，蛋白质水溶液与二价无机金属离子水溶液体积比为1～10∶1；二价无机金属离子水溶液的浓度为20～100 mM；二价无机金属离子和光敏剂的摩尔比为4～16∶1；蛋白质、二价无机金属离子的摩尔比为（0.5～5）∶1，优选（1～3）∶1。

本发明公开了上述二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒在制备提高二价无机金属离子转运至胞浆的药物中的应用，利用光照使光敏剂产生光动力效应并实现Mn

本发明公开了上述无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒在肿瘤免疫治疗中的应用，具体为在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

本发明中，以上述无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒为活性成分的肿瘤免疫治疗药物的剂型没有限制，可以制备成各类制剂，比如用于静脉注射、皮下注射、瘤内注射等的注射剂。

现有技术通过仿生矿化的方式将二氧化锰原位生长到白蛋白中，光敏剂（比如吲哚菁绿，ICG）分子通过疏水相互作用和静电吸附的方式负载到蛋白上得到最终的纳米体系。现有技术还通过沉淀法制备光敏剂比如（二氢卟吩e6（Ce6））光动力治疗体系，并在其表面修饰牛血清白蛋白（BSA）包裹的MnO

本发明首次采用基于蛋白质的疏水空腔为模板的生物矿化法，成功制备了二价无机金属离子和光敏剂蛋白纳米粒，二价无机金属离子和光敏剂都包载在蛋白质中；制得的纳米粒形貌规整，尺寸均一性好，分散性好，其释放行为具有pH响应性，在模拟溶酶体的pH5.5微酸性介质中，H

现有技术利用二氧化锰提供氧气，主要用于缓解肿瘤乏氧微环境；本发明联合光照用以实现Mn

与其他载STING激动剂纳米药物相比，本发明提供的二价无机金属和光敏剂蛋白纳米粒，其显著的优势在于制备方法简便可控，反应条件温和，能响应于溶酶体微酸性环境释放药物，生物安全性好，肿瘤靶向性高，疗效好，副作用小。具体来说，这种以Mn

附图说明

图1为本发明中实施例一纳米粒的透射电镜图片。

图2为本发明中实施例一纳米粒的X射线光电子能谱。

图3为本发明中实施例一纳米粒中吲哚菁绿（ICG）的紫外-可见吸收光谱。

图4为本发明中实施例一纳米粒的光热升温曲线统计图。

图5为本发明中实施例一纳米粒的活性氧生成（A）及量子产率统计图（B）。

图6为本发明中实施例一纳米粒中Mn

图7为本发明中实施例一纳米粒促进4T1细胞内活性氧生成图。

图8为本发明中实施例一纳米粒、二氯化锰和物理混合物对4T1细胞的细胞存活率统计图，分别为暗毒性（A）和光毒性（B）。

图9为本发明中实施例一纳米粒促进4T1细胞内dsDNA释放图。

图10为本发明中实施例一纳米粒促进DC2.4细胞分泌一型干扰素统计图。

图11为本发明中实施例一纳米粒在4T1小鼠原位乳腺癌中的近红外活体荧光成像图（A）及荧光统计图（B）。

图12为本发明中实施例一纳米粒对4T1小鼠原位乳腺癌治疗后的激光共聚焦显微镜观察的肿瘤切片图，样品分别为游离罗丹明B、标记罗丹明B的Abraxane和Mn-ICG@HSA。

图13为本发明中实施例一纳米粒和物理混合物治疗荷4T1原位乳腺癌及远端肿瘤模型鼠的抑瘤曲线，分别为近端肿瘤（A）和远端肿瘤（B）的肿瘤生长曲线，以及荷瘤鼠生存曲线（C）。

图14为本发明中实施例一纳米粒和物理混合物在4T1原位乳腺癌模型肿瘤组织中一型干扰素分泌统计图。

图15为本发明中实施例一纳米粒和物理混合物在4T1原位乳腺癌及远端模型中免疫细胞表达情况，分别为自然杀伤细胞（A）、CD8

图16为本发明中实施例二中不同二价无机金属离子溶液、蛋白-二价无机金属离子溶液及二价无机金属离子-光敏剂ICG溶液比较。

图17为本发明中实施例二中不同二价无机金属离子和光敏剂ICG以不同摩尔比形成沉淀比较。

图18为本发明中实施例三中不同光敏剂溶液、二价锰-光敏剂沉淀及二价锰离子与不同光敏剂制备的蛋白纳米粒溶液比较。

图19为本发明中实施例三中二价锰离子与不同光敏剂制备的蛋白纳米粒溶液水合粒径图。

图20为本发明实施例四中不同蛋白质溶液及Mn

图21为本发明实施例四中不同蛋白质包载Mn

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明采用的原料、试剂都为市售产品，符合药物的常规要求，采用的具体制备操作以及性能测试为常规技术；涉及的动物实验符合苏州大学动物实验要求。所有数据均以平均值±标准差表示，并使用双侧学生t检验或Tukey事后检验的单因素方差分析评估各组之间的差异。统计差异定义为*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

作为示例，本发明以白蛋白为载体，基于单分子蛋白质模板的生物矿化法，通过二价金属离子（如Mn

本发明调控体系的酸碱度，加入适量Mn

现有报道用于STING激活的纳米药物治疗效率低下，临床上采用瘤内注射的方式进行给药。然而，传统的递送策略无法实现STING激动剂的溶酶体逃逸和胞质递送，导致STING靶点激活效率低下。本发明中，二价无机金属离子，如Mn

本发明提供了上述二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒的制备方法，为以下步骤：

（1）调节蛋白质水溶液的酸碱度，利于二价无机金属离子与蛋白相互吸附，得混合液1；

（2）将二价无机金属离子水溶液与混合液1混合搅拌得到混合液2；

（3）将光敏剂水溶液与上述混合液2混合搅拌得到混合液3，然后搅拌反应后，经超滤和水洗纯化，得到二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒。

本发明中，搅拌反应的温度为室温，时间为1～6小时，具体实现搅拌反应的方式以及搅拌反应的控制为常规技术；纯化为超滤水洗至中性，除去游离小分子并提供纳米粒稳定的环境，超滤时，离心机转速为1500～3000 rpm。

本发明中，蛋白质溶液、二价无机金属离子溶液、光敏剂溶液中，溶剂为去离子水或各类水溶液。二价锰离子为二氯化锰或其他二价锰盐溶液；光敏剂为吲哚菁绿，蛋白为人血清白蛋白等。

本发明中，用磁力搅拌器等进行搅拌反应，具体为常规技术。

优选的，二价无机金属离子溶液与蛋白质溶液混合的时间为3～5 min，加入光敏剂后搅拌反应时间为1～6小时。

本发明中，用氢氧化钠水溶液或盐酸溶液调节蛋白质溶液的pH值，优选的，NaOH水溶液或HCl溶液的浓度为2 mol/L。

实施例一

二价锰离子和光敏剂蛋白纳米粒的制备，其具体步骤如下：

分别配制10 mg mL

对制备的Mn-ICG@HSA进行透射电镜拍摄，结果如图1，纳米粒平均粒径为（9.74±0.90）nm，粒径均一、分散均匀。并且，采用冻干法测得Mn

对照例

在实施例一的基础上，省略MnCl

1.对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA的组分进行分析，具体步骤为：

（1）锰元素及价态分析：取纳米粒溶液（Mn-ICG@HSA）进行冷冻干燥，同时以MnCl

（2）ICG光谱分析：分别配制浓度为10.0 mg mL

2. 对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA进行光热效应考察，具体步骤为：取纳米粒溶液，用水将其稀释至ICG终浓度为10 g mL

3. 对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA进行光动力效应考察，具体步骤为：取纳米粒溶液，用水将其稀释至ICG终浓度为1g mL

4.对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA进行药物释放行为考察，具体步骤为：取纳米粒溶液，用水将其稀释至Mn

5. 对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA促进4T1细胞内ROS实验考察，具体步骤为：将4T1细胞接种至共聚焦玻底皿中（1×10

6.对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA进行对4T1细胞存活率考察，具体步骤为：将4T1接种于96孔细胞培养板中（5×10

7.对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA进行细胞内dsDNA释放实验考察，具体步骤为：将4T1细胞接种至共聚焦玻底皿中（1×10

8.对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA促进树突状细胞（DC2.4）细胞外一型干扰素（IFN-β）分泌的实验考察，具体步骤为：使用小鼠IFN-β酶联免疫分析（Enzyme -LinkedImmuno Sorbent Assay, ELISA）试剂盒检测Mn-ICG@HSA纳米粒作用后，DC2.4上清液中IFN-β的分泌情况，实验方法如下。将DC2.4接种于24孔板中（2×10

9.对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA进行在4T1小鼠乳腺癌中的近红外活体荧光成像实验考察，具体步骤为：取6-8周BALB/c雌性小鼠，于腹部乳腺处接种4T1细胞（1×10

10. 对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA进行肿瘤渗透考察，具体步骤为：用罗丹明B（Rhodamine B）标记临床白蛋白结合型紫杉醇（Abraxane）和Mn-ICG@HSA：取3 mL新制Mn-ICG@HSA与30 μL 罗丹明B（5 mg mL

11.对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA进行荷4T1原位及远端乳腺癌模型的抑瘤实验考察，具体步骤为：取6-8周BALB/c雌性小鼠，于腹部乳腺处接种4T1细胞（1×10

12.对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA进行荷4T1原位乳腺癌小鼠肿瘤组织中IFN-β分泌实验考察，具体步骤为：取6-8周BALB/c雌性小鼠，建立原位乳腺癌小鼠模型，按上述抑瘤实验分组进行给药，各组注射剂量均为Mn 3.0 mg kg

13.对实施例一中制备的Mn-ICG@HSA进行荷4T1原位乳腺癌小鼠肿瘤组织细胞相关免疫能力考察，具体步骤为：取6-8周BALB/c雌性小鼠，建立原位乳腺癌小鼠模型，按上述抑瘤实验分组进行给药，各组注射剂量均为Mn 3.0 mg kg

实施例二

采用各类二价无机金属离子和光敏剂ICG制备纳米粒，其具体步骤如下：

首先分别配制浓度为10 mg mL

分别等体积混合HSA溶液和金属离子溶液，及金属离子溶液和ICG溶液，5000 rpm离心5 min，观察：1）各二价无机金属离子在水中、HSA溶液中、ICG溶液中是否产生沉淀，从而考察各种金属离子是否导致蛋白质变性，及是否能与ICG通过静电作用产生沉淀。结果如图16，在加入白蛋白溶液前，Mn

进一步将上述金属离子溶液和光敏剂ICG溶液分别以不同物质的量比（1:1~16:1）混合，考察不同金属离子与光敏剂ICG形成沉淀的物质的量比。结果图17，当金属离子和ICG物质的量比提升至4:1时，Mn

实施例三

二价无机金属离子（Mn

分别配制浓度为10 mg mL

实施例四

采用不同载体蛋白制备二价无机金属离子Mn

分别配制浓度为10 mg mL

本发明采用新的技术思路有效解决了目前通常递送高价态无机氧化物需在细胞内还原至二价态才能发挥作用的不足，在水溶液中通过精确控制反应pH，室温下成功制备了一种包载二价无机金属离子和有机光敏剂的蛋白纳米粒，制备条件温和、方法简便、粒径均匀而可控，所得肿瘤靶向性良好的纳米粒具有稳定维持二价态无机金属离子的特性和尺寸优势，能通过血管壁向肿瘤组织深部渗透，在溶酶体微酸性环境（pH 5.5）下纳米粒中的二价无机金属离子/有机光敏剂迅速解离后释放二价无机金属离子（如Mn