抗围绝经期抑郁症肝气郁证的中药单体芦丁及其应用

技术领域

本发明属于围绝经期抑郁症治疗药物技术领域，具体涉及抗围绝经期抑郁症肝气郁证的中药单体芦丁及其应用。

背景技术

围绝经期是指妇女绝经前后的一段时期(从停经开始至停经后12个月内)，此阶段卵巢功能开始衰退，易表现出情绪低落、郁郁寡欢、胸闷心悸等症状，绝大多数妇女此阶段持续遭受来自家庭、工作、经济等多重压力，导致抑郁情绪进一步加重，且很难自行缓解，因此发展成为围绝经期抑郁症(Perimenopausal depression,PMD)。PMD与女性普通抑郁症相比，PMD发病于特定年龄，发病率高，发病机制复杂，并伴有其他症状。PMD见于45岁-55岁女性，即月经紊乱至绝经时段，由于卵巢功能衰退，雌激素水平突然下降，诱发神经-内分泌-免疫系统紊乱，此阶段女性极易患PMD，同时还会伴有潮热、出汗、失眠、骨关节肌肉疼痛等症状。

PMD主要发病假说有雌激素学说、神经递质学说、神经营养因子学说、炎症学说、神经内分泌学说。目前，针对已知发病机制，临床治疗PMD的一线药物是抗抑郁药物(以五羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)为主)以及雌激素药物(倍美力、补佳乐)；PMD尚无指定性治疗的中成药。西药治疗手段具有一定疗效，但抗抑郁药物致使患者出现体重增加、性功能障碍、嗜睡等症状，雌激素药物会增加乳腺癌和子宫内膜肿瘤的风险，以上副作用限制了西药治疗药物的使用。中医药治疗PMD近年取得重要进展，主要是采用中药复方和针灸治疗，未见有治疗PMD病证的中药新药。鉴于国内外治疗PMD现状，亟需研发出疗效显著、副作用小的新药，研发过程中存在的最大阻碍为PMD具体发病机制尚不明确，现有发病机制未取得突破性进展，探究PMD发病关键机制，为新药研发提供治疗靶向，已成为药物研发面临的主要问题。

中医古籍并无PMD病名记载，根据其临床症状，可归为“郁证”、“百合病”、“燥脏”等范畴，中医对围绝经期的描述，最早可追溯至秦汉时期，《素问·上古天真论篇》中记载“女子七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也”，主要阐释了女子进入围绝经期的生理变化。研究发现PMD的常见证型有心肾不交兼有肝郁型、肝郁肾虚型、肾虚型、肝郁气滞型和心肾不交型，而肾虚肝郁和心肾不交兼夹肝郁为主要证型(李晓洁,施凤,张蕾.围绝经期抑郁症的中医病机和证型研究[J].光明中医,2018,33(05):597-599.)。大多数医家认为肾虚为发病基础，肝气郁为发病关键(卢永屹.围绝经期抑郁症的中医治疗进展[J].江西中医药,2019,50(07):73-76.)。

芦丁(LD)存在于贯叶连翘、金丝桃、荞麦、槐米等多种中草药或自然植物中。国内外均有文献报导了芦丁抗抑郁作用：Ibrahim M Ibrahim发现LD可缓解固定应激组小鼠抑郁行为(Comparative evaluation of natural neuroprotectives and theircombinations on chronic immobilization stress-induced depression inexperimental mice[J].3Biotech)。Arun Parashar(Rutin alleviates chronicunpredictable stress-induced behavioral alterations and hippocampal damage inmice)发现LD通过保护慢性不可预知性组小鼠海马脑区神经元发挥抗抑郁作用。结合国内外相关文献，王香君(王香君,夏小雯,马明钰,等.基于抑郁症病理机制探讨芦丁抗抑郁作用[J].中国现代应用药学,2022:1-6.)总结了LD抗抑郁作用机制，发现LD通过抑制单胺氧化酶表达与HPA轴功能亢奋，改善调体内单胺类神经递质和脑源性神经营养因子水平，影响胆碱能神经系统、谷氨酸能、GABA能，改善认知障碍，促进神经保护等发挥抗抑郁作用。

发明人团队前期发现，疏肝解郁药对柴胡-白芍主要有效成分是芦丁、槲皮素和芍药苷，其中，芦丁作用于脑内GABAAR达到疏肝解郁作用。发明专利CN111297881A公开了芦丁在制备GABAA受体抑制剂中的应用，所述芦丁能够和GABAA受体结合，认为芦丁能够作为GABAA受体抑制剂用于制备治疗神经系统疾病的药物。但迄今未见有芦丁对PMD治疗作用，尤其是芦丁对PMD肝气郁证治疗作用的研究报道或发明专利公开。

综上所述，本领域迫切需要开发具有抗PMD药理作用的新药物。

发明内容

本发明目的是提供一种抗围绝经期抑郁症肝气郁证的中药单体芦丁及其应用。

术语“中药单体”是指中药中的单一活性成分，其化学结构明确，药理活性多样，如抗炎、抗氧化应激等。芦丁就是这样一种中药中的单一活性成分。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明的第一方面，本发明首先提供了一种PMD肝气郁结证大鼠模型构建方法与模型评价指标，以“孤养+双侧卵巢切除(OVX)+慢性不可预见刺激(CUMS)”方法制备PMD肝气郁结证大鼠模型，通过行为学表观指标以及血清中关键生化指标作为评价依据，评价该模型模拟PMD肝气郁证病证表现与其病理变化。结果表明：阴道电阻结果显示，假手术组具有完整的动情周期，模型大鼠未观察到动情前期，证明模型大鼠进入围绝经期；行为学观察显示，模型大鼠表现出PMD抑郁症抑郁行为；相关指标检测显示，模型大鼠与假手术组大鼠相比，血清E2,5-HT,ALLO水平显著改变，表明采用“孤养+OVX+CUMS”方法制备的PDD肝气郁证大鼠模型模拟出PMD肝气郁证临床表现与相应病理变化，是一个符合病证动物模型造模评价标准的PMD肝气郁证动物模型。

在本发明的另一方面，本发明提供了PMD肝气郁证的发病机制，借助上述模型，本发明探查PMD肝气郁证的发病机制，结果表明，PMD肝气郁结证大鼠血清中ALLO水平显著性下降，前额叶、海马、下丘脑中Gabra4、Gabrb2 mRNA表达显著性升高，下丘脑和杏仁核中Gabrd mRNA表达显著性升高，是PMD肝气郁证主要发病机制，该机制与目前已知PMD发病机制存在明显不同，反映出PMD肝气郁证发病病理生理变化特征。

在本发明的另一方面，本发明提供了芦丁抗PMD肝气郁证的药理药效及其作用机制，基于前期研究基础，本发明推测芦丁具有抗PMD效果，通过改善ALLO水平，调控关键脑区中GABAAR亚基表达发挥作用。为了验证上述推断，本发明制备PMD肝气郁证大鼠模型并灌胃芦丁进行干预，同时设有灌胃氟西汀(Fluoxetine，1.8mg/kg)组作为阳性对照，验证了芦丁治疗PMD肝气郁证模型大鼠药理药效及其作用机制。在LD剂量筛选实验中，本发明发现，12.5mg/kg的剂量即可有效缩短小鼠在强迫游泳(FST)和悬尾(TST)实验中的悬浮不动时间；对本剂量进行大小鼠计量换算，并进一步实验发现LD可改善PMD肝气郁证模型大鼠抑郁症状、学习记忆与社会交往能力。行为学实验结果显示：与Model组相比，Fluoxetine和LD各剂量组大鼠总路程显著性升高(P<0.05)，总静止时间显著性降低(P<0.05)；与Model组相比，LD(Low)糖水偏好率显著性升高(P<0.05)；与Model组相比，LD(Low)和LD(Medium)强迫游泳不动时间显著性降低(P<0.05)。药理学实验则证明了LD通过上调外周血中5-HT、ALLO含量，下调前额叶Gabra4、Gabrb2 mRNA表达发挥上述作用。

上述结果表明：芦丁干预能够有效改善模型大鼠的抑郁行为状态，本发明证实了芦丁对PMD肝气郁证具有改善乃至治疗作用。

基于上述技术效果，本发明的第二方面，提供了芦丁在制备抗围绝经期抑郁症产品中的应用。

上述第二方面所称的芦丁，不仅表示CAS号：153-18-4所代表的化合物实体，还包括芦丁的主要提取原料，如苦荞麦叶、槐花、槐米、槐角、赤豆等，上述原料仅作为示例，芦丁的提取方式也属于本领域常规手段，如乙醇回流提取方式，从上述原料中获取芦丁对于本领域技术人员来说不具有技术难度。

再一种可行的实施方式中，所述芦丁表示主要活性成分为芦丁的制剂，如芦丁片，该实施方式中，上述应用的具体形式为芦丁片作为抗围绝经期抑郁症治疗药物的应用。

上述抗围绝经期抑郁症产品可行的实例如食品、药物，包括用于改善围绝经期抑郁症带来的肝气郁结症的特殊医用食品、饮品或治疗药物，还包括用于制备PMD抑制模型的干预药物。

本发明的第三方面，提供了一种用于围绝经期抑郁症肝气郁证的治疗药物，所述药物的活性成分为芦丁。

所述治疗药物的形式包括口服制剂、注射剂，更优选为口服制剂，所述口服制剂中芦丁的含量为本领域技术人员依据现有研究手段可以常规确定的技术内容，可行的实施方式中，所述芦丁的含量为治疗药物质量的1％～99％；进一步，为20～80％，更进一步，为30～60％。

本发明取得了如下有益效果：

1.本发明建立了PMD肝气郁证大鼠模型，为探查发病机制，筛选活性药物提供了PMD肝气郁证病证结合动物模型。通过对该病证大鼠模型血清和脑内相关指标检测，本发明明确了PMD与普通抑郁症发病机制有显著区别：抑郁症发病机制主要为脑区及外周血清5-羟色胺(5-HT，又名血清素)水平降低；抗抑郁药(如盐酸氟西汀)通过提高脑内5-羟色胺水平而起作用。PMD肝气郁证的发病机制主要为血清中ALLO水平下降，介导前额叶Gabra4、Gabrb2以及下丘脑Gabrb2 mRNA表达上调，ALLO通过调节GABAAR参与人体情绪调节。这种发病机制层面的差异意味着PMD治疗药物的研发并非现有抗抑郁药物的常规转用，而是应当朝向针对该病证发病机制中主要靶点，研发新的治疗药物。

2.本发明证明了芦丁具有抗PMD肝气郁证的药效及其药理机制。本发明芦丁对PMD肝气郁大鼠模型药理药效实验表明：与模型组和阳性对照药氟西汀组相比，芦丁(8.65mg/kg)组显著改善了PDD肝气郁证的抑郁行为表现及其相关病理生理指标变化；该疗效药是通过上调该病证模型大鼠血清ALLO水平，下调介导前额叶Gabra4、Gabrb2 mRNA表达的药理机制而实现的。

3.本发明为PMD的防治，尤其是PMD肝气郁证的预防和治疗，提供了一种可用于保健食品和新药研发的中药单体芦丁。目前针对PMD的治疗药物，西医主要为抗抑郁症药氟西汀之类，治疗效果有效，但副作用明显，患者接受性差。中医治疗主要为中药复方逍遥散等，未见有治疗PMD的中成药。针对PMD肝气郁证的中西医治疗药物，均未见到。

本发明芦丁抗PMD肝气郁证药效药理实验结果证明了芦丁的可靠疗效，芦丁作为天然中药中含有的单一活性成分，未见有毒副作用，具有药理活性明确和治疗疗效果可靠的特点，用于防治PMD肝气郁证具有更好的患者顺应性。因此，本发明中的芦丁可用于防治PMD，尤其是防治PMD肝气郁证保健食品和新药的研发，同时也是对治疗PMD药物研发的改进和补充。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中所述PMD肝气郁结模型构建与评价方式示意图；

图2为实施例2中所述PMD发病机制探究的研究方式示意图；

图3为实施例3中所述LD药效药理研究方式示意图；

图4为实施例1、3中PMD肝气郁结模型制备和LD药理药效研究的行为学实验结果图，其中，A为旷场实验的总路程结果，B为旷场实验的总静止时间结果，C为蔗糖偏好实验结果，D为强迫游泳实验静止不动时间结果。

图5为实施例1、3中PMD肝气郁结模型制备和LD药理药效研究中血清E2含量结果图。

图6为实施例1、3中PMD肝气郁结模型制备和LD药理药效研究中血清5-HT、NE含量结果图，A为5-HT含量结果图、B为NE含量结果图。

图7为实施例1、3中PMD肝气郁结模型制备和LD药理药效研究中血清ALLO含量结果图。

图8为实施例3中LD药理药效研究中前额叶Gabra4、Gabrb2、下丘脑Gabrb2 mRNA表达结果图，其中，A为前额叶Gabra4 mRNA表达结果，B为前额叶Gabrb2 mRNA表达结果，C为下丘脑Gabrb2表达结果。

图9为实施例2中PMD发病机制探究-PMD肝气郁证大鼠主要脑区Gabra4mRNA表达结果图，其中，A为前额叶Gabra4 mRNA表达结果，B为海马体Gabra4mRNA表达结果，C为下丘脑Gabra4 mRNA表达结果，D为杏仁核Gabra4 mRNA表达结果。

图10为实施例2中PMD发病机制探究-PMD肝气郁证大鼠主要脑区Gabrb2mRNA表达结果图，其中，A为前额叶Gabrb2 mRNA表达结果，B为海马体Gabrb2 mRNA表达结果，C为下丘脑Gabrb2 mRNA表达结果，D为杏仁核Gabrb2mRNA表达结果。

图11为实施例2中PMD发病机制探究-PMD肝气郁证大鼠主要脑区Gabrd mRNA表达结果图，其中，A为前额叶Gabrd mRNA表达结果，B为海马体Gabrd mRNA表达结果，C为下丘脑Gabrd mRNA表达结果，D为杏仁核Gabrd mRNA表达结果。

图12为实施例2中PMD发病机制探究-外源性ALLO干预PDD肝气郁证大鼠后，血清E2、5-HT、NE、ALLO含量结果图，A为E2含量结果图，B为5-HT含量结果图，C为NE含量结果图，D为ALLO含量结果图。

图13为实施例2中PMD发病机制探究-外源性ALLO干预PDD肝气郁证大鼠后，主要脑区Gabra4 mRNA表达结果图，其中，A为前额叶Gabra4 mRNA表达结果图，B为海马体Gabra4mRNA表达结果图，C为下丘脑Gabra4 mRNA表达结果图，D为杏仁核Gabra4 mRNA表达结果图。

图14为实施例2中PMD发病机制探究-外源性ALLO对PDD肝气郁证大鼠后，主要脑区Gabrb2 mRNA表达结果图，其中，A为前额叶Gabrb2 mRNA表达结果图，B为海马体Gabrb2mRNA表达结果图，C为下丘脑Gabrb2 mRNA表达结果图，D为杏仁核Gabrb2 mRNA表达结果图。

图15为实施例2中PMD发病机制探究-外源性ALLO对PDD肝气郁证大鼠后，主要脑区Gabrd mRNA表达结果图，其中，A为前额叶Gabrd mRNA表达结果图，B为海马体Gabrd mRNA表达结果图，C为下丘脑Gabrd mRNA表达结果图，D为杏仁核Gabrd mRNA表达结果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1PMD肝气郁结证大鼠模型构建

1.实验动物分组及动物模型制备

SPF级雌性SD大鼠，8周龄，体重(200±20)g，适应性饲养1周后，通过体重随机分为假手术组(Sham)和模型组(Model)。本实施例通过“双侧卵巢切除+慢性不可预见刺激”制备PMD肝气郁证模型大鼠。

2.大鼠模型评价指标

通过表观指标和关键生化指标评价PMD肝气郁证模型。阴道电阻法检测大鼠的动情周期，旷场实验、糖水偏好实验、强迫游泳实验为表观指标；运用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清E2、5-HT、NE含量为关键生化指标(图1)。

3.结果与结论

阴道电阻测量发现双侧卵巢切除大鼠动情周期不规律，血清E2含量下降(图5)，表明模拟出PMD月经周期紊乱及停经的围绝经期特征；旷场实验总路程、糖水偏好率显著下降，旷场实验总静止时间和强迫游泳不动时间显著上升(图4)，模拟出PMD肝气郁证情绪抑郁、行为退缩主要临床表现；血清5-HT、NE(图6)含量下降，反映出PMD肝气郁证主要病理变化。证明上述实施例方法造模成功，可以进行PMD发病机制探查，干预药物药理药效实验。

实施例2PMD肝气郁证发病机制探查

1.实验动物分组、模型制备、药物干预

SPF级雌性SD大鼠，8周龄，体重(200±20)g，适应性饲养1周后，通过体重随机分为假手术组(Sham)和模型组(Model)。通过“双侧卵巢切除+慢性不可预见刺激”制备PMD肝气郁证模型大鼠。

SPF级雌性SD大鼠，8周龄，体重(200±20)g，适应性饲养1周后，通过“双侧卵巢切除+慢性不可预见刺激”制备PMD肝气郁证模型大鼠。模型制备结束后，进行强迫游泳实验，以实验结果分为载体芝麻油(Vehicle)组和ALLO+载体(Vehicle-ALLO)组，每只大鼠48h内腹腔注射3次芝麻油或ALLO+芝麻油，每次注射0.4ml芝麻油，每只大鼠注射10mg/kg ALLO。

2.探查指标

如图2所示，本实例分两步探查PMD发病机制，第一步探查PMD肝气郁证大鼠血清ALLO含量变化和主要脑区(前额叶、海马、杏仁核、下丘脑)中GABA

3.结果与结论

与Sham组大鼠相比，Model组大鼠血清ALLO水平显著性下降(图7)，前额叶、海马、下丘脑中Gabra4(图9)、Gabrb2(图10)mRNA表达显著性升高，下丘脑和杏仁核中Gabrd mRNA(图11)表达显著性升高。与Vehicle组大鼠相比，Vehicle-ALLO组大鼠，血清E2、5-HT、NE、ALLO含量显著性上升(图12)，前额叶Gabra4(图13)、Gabrb2(图14)和下丘脑Gabrb2 mRNA(图14)表达显著性降低。

本实例首先证实了ALLO介导前额叶Gabra4、Gabrb2和下丘脑Gabrb2 mRNA表达升高为PMD肝气郁结证的发病机制。

实施例3芦丁抗PMD肝气郁证药理药效

1.实验动物分组、模型制备、药物干预

SPF级雌性SD大鼠，8周龄，体重(200±20)g，适应性饲养1周后，通过大鼠体重进行分为假手术组(Sham)、双侧卵巢切除结合慢性不可预知性刺激组(Model)、氟西汀组(Fluoxetine)、芦丁低剂量组(LD(Low))、芦丁中剂量组(LD(Medium))、芦丁高剂量组(LD(High))。以PMD肝气郁结证模型组作为对照组，Fluoxetine(1.8mg/kg)组作为阳性药对照组，LD(Low)组(8.65mg/kg)，LD(Medium)组(39.325mg/kg)和LD(High)组(70mg/kg)作为治疗组。除Sham组外，其他组均采用双侧卵巢切除结合慢性不可预知性刺激进行造模，给药与造模同时进行，给药方式为灌胃，共计5周，以探明LD药理药效(图3)。芦丁采用的LD标准品，纯度98％，购买于南京广润生物制品有限公司。

2.探查指标

阴道电阻法检测大鼠的动情周期，旷场实验、糖水偏好实验、强迫游泳实验检测大鼠抑郁行为变化；运用ELISA检测血清E2、5-HT、NE、ALLO含量，运用实时荧光定量PCR法检测前额叶Gabra4、Gabrb2和下丘脑Gabrb2 mRNA表达情况。

3.结果与结论

如图4-图8所示，低剂量的LD干预后，PMD肝气郁证大鼠抑郁行为和抑郁相关指标均有所改善，旷场实验总路程、糖水偏好率、5-HT和ALLO含量显著上升，旷场实验总静止时间和强迫游泳不动时间显著下降，前额叶Gabra4、Gabrb2mRNA表达显著性下降；LD干预的低、中、高三个剂量组中，低剂量组(8.65mg/kg)具有更为理想的调控效果。

芦丁改善PMD肝气郁证模型大鼠表观行为；纠正产生表观行为的病理指标。本实例证明芦丁是通过提升血清中ALLO含量，下调前额叶Gabra4、Gabrb2mRNA表达实现抗PMD肝气郁证的作用。

根据上述研究结果，本发明首先证实了ALLO介导前额叶Gabra4、Gabrb2和下丘脑Gabrb2 mRNA表达升高为PMD肝气郁证的发病机制；LD具有抗PMD肝气郁证的作用，可能是通过提升血清中ALLO含量，下调前额叶Gabra4、Gabrb2mRNA表达实现的。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。